Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Studies of Drug Metabolism and Permeability

Poor pharmacokinetics is one of the reasons for the withdrawal of drug candidates from clinical trials. There is an urgent need for investigating in vitro ADME (absorption, distribution, metabolism and excretion) properties and recognising unsuitable drug candidates as early as possible in the drug development process. Current throughput of in vitro ADME profiling is insufficient because effective new synthesis techniques, such as drug design in silico and combinatorial synthesis, have vastly increased the number of drug candidates. Assay technologies for larger sets of compounds than are currently feasible are critically needed. The first part of this work focused on the evaluation of cocktail strategy in studies of drug permeability and metabolic stability. N-in-one liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC/MS/MS) methods were developed and validated for the multiple component analysis of samples in cocktail experiments. Together, cocktail dosing and LC/MS/MS were found to form an effective tool for increasing throughput. First, cocktail dosing, i.e. the use of a mixture of many test compounds, was applied in permeability experiments with Caco-2 cell culture, which is a widely used in vitro model for small intestinal absorption. A cocktail of 7-10 reference compounds was successfully evaluated for standardization and routine testing of the performance of Caco-2 cell cultures. Secondly, cocktail strategy was used in metabolic stability studies of drugs with UGT isoenzymes, which are one of the most important phase II drug metabolizing enzymes. The study confirmed that the determination of intrinsic clearance (Clint) as a cocktail of seven substrates is possible. The LC/MS/MS methods that were developed were fast and reliable for the quantitative analysis of a heterogenous set of drugs from Caco-2 permeability experiments and the set of glucuronides from in vitro stability experiments. The performance of a new ionization technique, atmospheric pressure photoionization (APPI), was evaluated through comparison with electrospray ionization (ESI), where both techniques were used for the analysis of Caco-2 samples. Like ESI, also APPI proved to be a reliable technique for the analysis of Caco-2 samples and even more flexible than ESI because of the wider dynamic linear range. The second part of the experimental study focused on metabolite profiling. Different mass spectrometric instruments and commercially available software tools were investigated for profiling metabolites in urine and hepatocyte samples. All the instruments tested (triple quadrupole, quadrupole time-of-flight, ion trap) exhibited some good and some bad features in searching for and identifying of expected and non-expected metabolites. Although, current profiling software is helpful, it is still insufficient. Thus a time-consuming largely manual approach is still required for metabolite profiling from complex biological matrices.

Väitöskirjatyössä pyrittiin kehittämään tehokkaampia menetelmiä lääkkeenkehityksen eri vaiheisiin. Analyyttisena tekniikkana käytettiin nestekromatografia-massaspektrometriaa (LC/MS). Lääkeaineseoksia käytettiin yksittäisten lääkeaineiden sijasta lääkkeiden imeytymisen ja aineenvaihduntareaktioiden tutkimisessa. Seosnäytteiden analysointiin kehitettiin ja validoitiin nestekromatografia-tandem massaspektrometrisia menetelmiä (LC/MS/MS). Lääkkeiden imeytymisen tutkimiseen käytettiin Caco-2 -solulinjaa, joka on suosittu in vitro -menetelmä kuvaamaan imeytymistä ihmisen ohutsuolessa. Työssä kehitettiin analyysimenetelmä Caco-2 -solulinjan rutiinitestaukseen käyttäen 7-10 mallilääkeainetta. Toisessa tutkimuksessa seosnäytestrategiaa käytettiin lääkkeiden aineenvaihdunnan tutkimiseen UGT-isoentsyymeillä. UGT:t ovat entsyymejä, jotka katalysoivat useiden aineiden muuttumista helpommin elimistöstä erittyviksi glukuronideiksi. Työssä inkuboitiin seitsemän yhdisteen seosta ihmisen eri rekombinantti UGT-entsyymien kanssa ja määritettiin muodostuneiden glukuronidien määrä ja laskettiin metabolinen puhdistuma. Seosnäytekokeet yhdessä LC-MS/MS-analyysitekniikan kanssa lisäsivät selvästi tehokkuutta sekä Caco-2 -kokeissa että metabolisen puhdistuman määrittämisessä. Uuden massaspektrometrisen ionisaatiomenetelmän, ilmanpainefotoionisaation (APPI), soveltuvuutta kvantitatiiviseen bioanalytiikkaan tutkittiin vertaamalla sitä sähkösumutusionisaatioon (ESI). Molemmat menetelmät soveltuivat hyvin Caco-2 -näytteiden analysointiin mutta dynaaminen lineaarinen mittausalue APPI:ssa osoittautui leveämmäksi tehden siitä joustavamman tekniikan vaihtelevien analyyttipitoisuuksien analysointiin. Työn loppuosassa keskityttiin lääkkeiden aineenvaihduntatuotteiden profilointiin. Erilaisia massaspektrometreja sekä aineenvaihduntatuotteiden etsimiseen ja identifiointiin tarkoitettuja ohjelmistoja testattiin virtsanäytteiden analysoinnissa. Testiyhdisteenä käytettiin tramadolia, jonka aineenvaihduntatuotteet tunnetaan hyvin. Kukin laitteisto omasi hyviä ja huonoja puolia aineenvaihduntatuotteiden määrittämisessä. Profilointiin tarkoitetut ohjelmistot olivat jonkun verran avuksi mutta käytännössä aineenvaihduntatuotteiden tunnistaminen vaikeasta biologisesta matriisista kuten virtsasta vaatii edelleen paljon manuaalista työtä. Lisäksi sibutramiinin aineenvaihduntaa tutkittiin rotan ja ihmisen maksasoluilla. Työssä löydettiin useita ennen julkaisemattomia sibutramiinin aineenvaihduntatuotteita.