Mapeamento genómico de um gene de resistência ao míldio em Brassica oleracea L.

Tese dout., Biologia, Universidade do Algarve, 2006

Hipersensibilidade e necrose sistêmica em Nicotiana benthamiana transformada com o gene de resistência Sw-5 de tomateiro

O gene Sw-5 do tomateiro confere resistência a várias espécies de tospovírus e codifica uma proteína contendo domínios de ligação a nucleotídeos e repetições ricas em leucina. Tomateiros com Sw-5 exibem reações necróticas nas folhas inoculadas com tospovírus. Estas reações e a estrutura da proteína Sw-5 indicam que a resistência ocorre por meio do reconhecimento do patógeno e desencadeamento da resposta de hipersensibilidade. A capacidade de Sw-5 de conferir resistência a tospovírus em tabaco selvagem (Nicotiana benthamiana Domin.) foi avaliada em plantas transgênicas. Uma construção com a seqüência aberta de leitura de Sw-5 e sua região 3 não-traduzida sob controle do promotor 35S do CaMV foi utilizada para transformação de N. benthamiana via Agrobacterium tumefaciens. Plantas de progênies R1 foram inoculadas com um isolado de tospovírus e avaliadas quanto à ocorrência de reação de hipersensibilidade e resistência à infecção sistêmica. em uma progênie com segregação 3:1 (resistente:suscetível), foi selecionada uma planta homozigota e sua progênie avaliada quanto ao espectro da resistência a tospovírus. Plantas com o transgene exibiram resposta de hipersensibilidade 48 h após a inoculação, sendo resistentes à infecção sistêmica. O fenótipo da resistência foi dependente do isolado viral e um isolado de Tomato chlorotic spot virus (TCSV) causou necrose sistêmica em todas as plantas inoculadas, enquanto que isolados de Groundnut ringspot virus (GRSV) e um isolado relacionado a Chrysanthemum stem necrosis virus (CSNV) ficaram restritos ao sítio de infecção. Comparações do espectro da resistência obtido neste trabalho com aquele observado em outros membros da família Solanaceae indicam que as vias de transdução de sinais e as respostas de defesa ativadas por Sw-5 são conservadas dentro desta família e polimorfismos genéticos nas vias de transdução de sinais ou em componentes das respostas de defesa podem resultar em diferentes níveis de resistência.

Análise de ligação do gene de resistência Zym-2 com marcadores microssatélites e reação de acessos de meloeiro ao Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV)

As viroses causam perdas significativas na cultura do melão. Dentre essas, o vírus do mosaico amarelo da abobrinha-de-moita (Zucchini yellow mosaic virus- ZYMV) possui grande importância para a cultura e é encontrado em todos os locais de plantio de cucurbitáceas. O controle desse vírus através da resistência genética é a forma mais eficiente de manejo. O acesso PI414723 é a única fonte de resistência de meloeiro ao ZYMV. Essa resistência é oligogênica e supostamente condicionada por três genes dominantes: Zym-1, Zym-2 e Zym-3. A localização cromossômica do gene Zym-1 já foi confirmada no grupo de ligação 2, próximo ao marcador CMAG36. Entretanto, a localização de Zym-2 ainda carece de confirmação experimental, muito embora existam evidências de sua localização no grupo de ligação 10 (LGX). Sendo assim, um dos objetivos do presente trabalho foi confirmar a localização do gene Zym-2 através de análises de ligação com marcadores microssatélites (SSRs). Para tanto, foi utilizada uma população F2 derivada do cruzamento PI414723 x \'Védrantais\'. As plantas foram inoculadas mecanicamente com o isolado RN6-F, patótipo 0, duas vezes em um intervalo de 24 h. A confirmação da infecção e a quantificação dos títulos virais nas plantas F2 foram realizadas através do teste PTA-ELISA. O DNA genômico das plantas foi extraído da primeira folha verdadeira e utilizado nas reações de PCR com primers específicos para SSRs selecionados pertencentes ao LGX. Observou-se uma distribuição assimétrica de classes de absorbância e maior frequência de indivíduos F2 na classe com menor valor (0,1 a 0,2), sugerindo a existência de um gene de efeito maior. O teste chi-quadrado mostrou que todos os marcadores segregaram na frequência esperada (1:2:1), exceto o marcador CMCT134b. A ligação do Zym-2 aos marcadores foi confirmada por meio de regressão linear simples. Dos marcadores analisados, a regressão linear foi significativa para MU6549 e CMBR55, com p-valores de 0,011 e 0,0054, respectivamente. As análises de ligação mostraram que as ordens e as distâncias entre os marcadores condizem com os mapas presentes na literatura. Um segundo objetivo do estudo foi o de avaliar a reação ao ZYMV de 42 acessos de meloeiro oriundos da região Nordeste do Brasil, com o intuito de explorar novas fontes de resistência. Foram realizados dois experimentos utilizando a mesma metodologia citada anteriormente. O título viral médio entre os acessos variou de 0,123 a 0,621 no experimento 1 e de 0,019 a 0,368 no experimento 2. Alguns acessos apresentaram consistentemente baixos títulos virais, próximos aos do acesso resistente PI414723 e dos controles negativos (plantas não inoculadas da cultivar \'Védrantais\'). Portanto, estes acessos mostram-se como potenciais fontes de resistência ao vírus para o emprego em programas de melhoramento.

Identificação de marcadores moleculares ligados a um gene mutado de resistência ao oídio (Erysiphe pisi Syd.) em ervilha (Pisum sativum L.)

Tese dout., Ciências Agrárias, Universidade do Algarve, 2006

Diversidade de respostas de Corynebacterium diphtheriae frente a agentes oxidantes: resistência, adaptação e envolvimento do determinante de resistência ao telurito (TeR) e do sistema OxyR na virulência bacteriana

Corynebacterium diphtheriae é um importante patógeno humano e agente causal da difteria. Embora seja observada uma redução mundial no número de casos da doença, a difteria permanece endêmica em muitos países e surtos são esporadicamente notificados. No Brasil, o último surto ocorreu no estado no Maranhão e revelou mudanças em aspectos clínico-epidemiológicos da doença. Diferentemente da maioria das cepas de difteria brasileiras, que pertencem ao biovar mitis, nesse surto dois diferentes pulsotipos de C. diphtheriae biovar intermedius foram isolados. Além disso, sinais patognomônicos da doença não foram relatados em parte dos casos. C. diphtheriae também vem sendo relacionado com quadros de infecções invasivas, apesar de ser reconhecido como patógeno tipicamente extracelular. Em conjunto, estas mudanças no perfil das infecções por C. diphtheriae sugerem a existência de outros fatores de virulência além da produção da toxina diftérica. Neste sentindo, foram realizadas análises de tipagem molecular e de genômica comparativa para avaliar a diversidade genética e o potencial de virulência de cepas de C. diphtheriae isoladas de difteria clássica e infecções invasivas. Os resultados obtidos demonstram a circulação de diferentes clones invasores no Brasil. Além disso, revelaram diferenças marcantes na presença e na composição de ilhas de patogenicidade entre as amostras, bem como nos genes sob regulação do DtxR e nas sequências dos corinefagos integradas ao cromossomo bacteriano. Uma vez que o potencial invasor bacteriano e a persistência no ambiente podem estar relacionados à tolerância ao estresse oxidativo, foram procurados nos genomas sequenciados, genes possivelmente envolvidos neste processo. Dentre estes, os genes DIP0906, predito como gene de resistência ao oxidante telurito (TeO32-), e DIP1421, codificador do regulador transcricional OxyR, foram caracterizados funcionalmente e tiveram seus papéis na patogenicidade investigados. Ensaios in vivo utilizando o nematódeo Caenorhabditis elegans demonstraram que ambos são importantes para a virulência de C. diphtheriae. Além da resistência ao TeO32, DIP0906 parece contribuir para a resistência ao peróxido de hidrogênio (H2O2) e para a viabilidade no interior de células respiratórias humanas. Já OxyR, além de controlar negativamente a resposta ao H2O2, parece estar envolvido com a ligação de C. diphtheriae a proteínas plasmáticas e de matriz extracelular. Adicionalmente, foi investigada resistência e a capacidade de adaptação de C. diphtheriae frente a agentes oxidantes, através da indução de resposta adaptativa e/ou resistência cruzada e da formação de biofilme. As cepas de C. diphtheriae apresentaram diferentes níveis de resistência e um comportamento heterogêneo na presença dos agentes oxidantes, o que sugere a existência de diferentes estratégias de sobrevivência e adaptação de C. diphtheriae nas condições de estresse oxidativo.

Marcadores RAPD para detecção de resistência à ferrugem-asiática-da-soja

Os objetivos deste trabalho foram confirmar a herança da resistência da PI 459025 (Rpp4) à ferrugem-asiática-da-soja e identificar marcadores moleculares do tipo RAPD, ligados a este gene de resistência, em populações de soja. Pelo cruzamento dos genitores contrastantes PI 459025 x Coodetec 208 obteve-se uma população, cujas populações das gerações F2 e F2:3 foram artificialmente infectadas e avaliadas quanto à reação ao fungo Phakopsora pachyrhizi, pelo tipo de lesão (RB - resistente e TAN - suscetível). Com os resultados da avaliação fenotípica, dois bulks foram obtidos com DNA de plantas homozigóticas resistentes e suscetíveis, respectivamente, pela análise de bulks segregantes. de 600 iniciadores RAPD aleatórios, foram identificados três com fragmentos polimórficos entre os bulks e parentais contrastantes quanto à resistência. Pela análise do qui-quadrado, confirmaram-se: a herança monogênica, com dominância completa quanto à resistência ao patógeno, e a segregação 3:1 para a presença de banda dos três marcadores. Os três marcadores são ligados respectivamente a 5,1, 6,3 e 14,7 cM de distância do loco de resistência, em fase de repulsão no grupo de ligação G, o que foi confirmado pela utilização do marcador microssatélite Satt288. Estes marcadores são promissores na seleção assistida para resistência à ferrugem-asiática-da-soja.

Utilização de análise de segregantes agrupados na identificação de marcadores ligados a genes que controlam a resistência à ferrugem (Puccinia psidii Winter) em Eucalyptus sp.

Devido a grande importância da cultura de Eucalyptus no Brasil, empresas do setor florestal têm buscado através de programas de melhoramento genético, reduzir as perdas de produção e atender a demanda do mercado de papel e celulose. Um exemplo, é a busca por genes de resistência a doenças, principalmente a ferrugem causada por Puccinia psidii Winter, que resulta em redução da produtividade em plantas altamente suscetíveis. No presente trabalho, mudas de Eucalyptus pertencentes a uma geração F1, provenientes do cruzamento controlado entre parentais híbridos E. grandis X E. urophylla, sendo eles resistente e suscetível, foram inoculadas com Puccinia psidii em casa de vegetação e acompanhadas até o aparecimento dos sintomas da ferrugem. Foram classificadas, em dois grupos: resistentes (ausência de sintomas) e suscetíveis (presença de sintomas e esporulação). As amostras de DNA foram comparadas com o uso de marcadores moleculares associado ao método de BSA (Bulked Segregant Analysis). O polimorfismo entre os grupos foi geneticamente relacionado ao loco que determina a característica de resistência ou sucetibilidade. Dentre os 720 primers testados, 19 foram polimórficos, porém, apenas o marcador AK 01 manteve-se presente, quando testado em todos os indivíduos da população, mostrando-se a uma distância genética estimada de 20 cM em repulsão ao gene de resistência.

Determinação da virulência e da resistência antimicrobiana em Staphylococcus spp. isolados de pacientes do Serviço de Dermatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, SP

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Seleção assistida por marcadores moleculares microssatélites para resistência ao oídio em soja

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Ocorrência de cepas de Escherichia coli que apresentam o gene de Shiga toxina em queijo mussarela produzido artesanalmente

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Utilização de bulked segregant analysis na identificação de marcadores ligados a genes que controlam a resistência à ferrugem (Puccinia psidii Winter) em Eucalyptus sp

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Mapeamento molecular do loco Rpp5 de resistência à ferrugem asiática da soja

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Resistência da soja à ferrugem asiática e ao oídio: herança de caracteres quali-quantitativos e mapeamento genético

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Pesquisa de genes de resistência do M. tuberculosis a isoniazida e rifampicina por sequenciamento e pela tecnologia de DNA-STRIP

Tuberculose (TB), causada por Mycobacterium tuberculosis, é uma das doenças infecciosas que mais causam mortes. Estima-se que mais de dois bilhões de pessoas estejam infectadas no mundo. O tratamento da TB consite em associação de fármacos, isoniazida, rifampicina, pirazinamida e etambutol, nos primeiros 2 meses e 4 meses de isoniazida e de rifampicina. Internacionalmente, são consideradas cepas multi resistentes (MDR), as que apresentam resistência simultânea a isoniazida e a rifampicina. A rápida detecção de resistência é essencial para o controle e tratamento da TB, reduzindo, assim, o custo do tratamento e a transmissão da doença. Neste projeto, os isolados já identificados fenotipicamente como resistentes a isoniazida e/ou rifampicina, foram submetidos ao sequenciamento de Sanger para pesquisa de 3 genes relacionados a resistência a isoniazida (katG, inhA e ahpC) e 1 gene de resistência a rifampicina (rpoB). Foi realizada uma comparação destes genes mutados para a resistência utilizando o novo teste desenvolvido pela Biomérieux, denominado GenoType® MTBDRplus, que se baseia na tecnologia DNA-STRIP. Através deste novo teste, foi observada mutação em 22 isolados clínicos de M. tuberculosis para genes de resistência a isoniazida e/ou rifampicina, sendo 4 provenientes do MS e 18 de SP. Já pelo sequenciamento genético foi observada mutação em 24 isolados para genes de resistência a isoniazida e/ou rifampicina, sendo 6 provenientes do MS e 18 de SP. Portanto, através do sequenciamento de Sanger, foi possível detectar um número maior de isolados mutados e mais mutações quando comparado ao teste GenoType® MTBDRplus. Isso acontece porque na técnica de sequenciamento, um fragmento do gene como um todo é analisado e no caso do teste GenoType® MTBDRplus, é verificada apenas a ausência ou presença das mutações mais frequentes descritas na literatura, além de não ser analisado o gene ahpC. A grande ...

Investigação de genes de resistência a carbapenêmicos, cefalosporinas e quinolonas e tipagem molecular de Enterobacter spp isolados de pacientes internados em um hospital terciário do Estado de São Paulo

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)