Expressão, purificação e estudos estruturais da chaperona molecular Hsp65 de Mycobacterium leprae & caracterização da proteína NUDEL - nuclear distribuition element-like

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Clonaje y expresión de mutantes de Apg2

La Apg-2 es una chaperona humana que Junto con Hsp70 y Hsp40 rompe agregados proteicos y replega las proteínas liberadas. Comparando con su homólogo en bacterias Sse1p, se observa que el complejo de levaduras requiere la ayuda de la desagregasa Hsp104. Comparando secuencias, Apg-2 tiene inserciones en dos regiones concretas. Mediante mutaciones que eliminen esas regiones se quiere probar como influyen en la función de la proteína. en este trabajo se realiza el clonaje y la expresión de la proteína y los mutantes.

Reactivación de agregados proteicos por chaperonas moleculares

ClpB es una chaperona hexamérica que solubiliza y reactiva agregados proteicos con la colaboración del sistema Hsp70/Dnak. Cada monómero de la proteína contiene dos dominios de unión a nucleótido, NBDs, que unen e hidrolizan ATP. La inserción de subunidades mutantes inactivas, es decir, incapaces de hidrolizar ATP, en el hexámero de ClpB inhibe la actividad replegadora de esta chaperona porque bloquean la comunicación alostérica que se establece entre los NBDs de los protómeros. Con el fin de conocer qué dominios de la proteína se encuentran implicados en dicha comunicación intermonomérica, se preparan híbridos de ClpB que contienen subunidades inactivas sin dominio N-terminal o dominio M. Asimismo, se estudia el efecto de DnaK en la actividad ATPasa de ClpB.

Complejos proteicos elipsoidales NP: Octámero y su relación con el ensamblaje de nucleosomas

Se caracterizan los complejos entre la nucleoplasmina, una chaperona nuclear, y el octámero de histonas y se ve su papel en el ensamblaje de nucleosomas.

Les sHsps en surera: Estudis de funcionalitat

Aquesta tesi es centra en la caracterització funcional d'una proteïna de xoc de calor de baix pes molecular (Small Heat Shock Protein - sHSP) de classe I de surera pel que fa a la seva capacitat per protegir les cèl·lules de l'estrès i per estabilitzar les membranes. Les sHsps són proteïnes que s'expressen en condicions d'estrès cel·lular. Encara que certs aspectes funcionals de les sHsps són ben coneguts, el nostre treball aporta informacions noves sobre el paper de les diferents regions de la proteïna, especialment de la regió N-terminal. L'objectiu concret d'aquest treball és determinar la funció termoprotectora de QsHsp17.4-CI, una sHsp de classe I oobtinguda a partir de les cèl·lules de fel·lema d'alzina surera, en un model bacterià i analitzar la importància de les diferents regions de la proteïna en aquesta funció. Amb aquesta finalitat s'han dissenyat dues proteïnes parcials derivades de QsHsp17.4-CI: una a la que li falta la regió N-terminal (C105) i una altra amb pràcticament tot el domini -cristal·lí deleccionat (N61), i una tercera, derivada de QsHs10-CI, a la que li falta la meitat del domini -cristal·lí (Hsp10). També s'estudia la possible capacitat estabilitzadora de membranes i la capacitat de modificar l'expressió d'altres Hsps quan s'expressa de forma heteròloga. Els nostres resultats demostren que l'expressió de QsHsp17.4-CI protegeix a les cèl·lules d'E.coli de l'estrès tèrmic alhora que la regió N-terminal i la regió consens II del domini -cristal·lí són imprescindibles per aquesta funció de protecció. En relació a un possible paper en les membranes, els estudis de localització subcel·lular mostren que QsHsp17.4-CI colocalitza amb la fracció membranes i que la regió N-terminal de la proteïna és responsable d'aquesta colocalització. No s'ha pogut demostrar, però, que la localització amb la membrana estigui associada a un efecte protector d'aquesta: en cap cas la sobrexpressió de les proteïnes modifica la composició d'àcids grassos i només N61, que no té acció termoprotectora, altera l'estat fisico-químic de la membrana. En estudis d'expressió de novo en E.coli s'ha observat que, a diferència de les altres proteïnes heteròlogues, N61 activa l'expressió de la majoria de Hsps d'E.coli fent pensar en una possible relació entre l'estat físic de la membrana i l'activació de la resposta a l'estrès. En resum, en aquest treball hem provat la capacitat protectora de QsHsp17.4 i aportem noves dades sobre la importància de la regió N-terminal i la regió consens II del domini -cristal·lí en aquesta funció. Per altra banda, es suggereix que QsHsp17.4 podria interaccionar amb la membrana d'E.coli i que la regió N-terminal seria imprescindible per aquesta interacció. Finalment hem determinat que les proteïnes que provoquen variacions en l'estat de fluïdesa de la membrana poden activar la resposta al xoc de calor per part de la cèl·lula bacteriana.

Estudo sobre o papel da HSP27 na tolerância à isquemia cerebral em um modelo in vivo e em culturas organotípicas de hipocampo de ratos

A HSP27 é um membro da família das proteínas de choque térmico que protege as células contra diversos tipo de estresse, sendo expressa principalmente em astrócitos depois da isquemia. Neste trabalho, nós estudamos o papel da HSP27 na tolerância à isquemia cerebral, usando um modelo in vivo e culturas organotípicas. Foram estudados diferentes tempos de reperfusão in vivo (1, 4, 7, 14, 21, 30 dias) usando 2 min, 10 min ou 2+10 min de isquemia global transitória pela oclusão dos 4 vasos (4VO). Foi observado um aumento no imunoconteúdo no DG depois de todos os tratamentos, com uma diminuição na porcentagem de HSP27 fosforilada. Em CA1, região vulnerável, observou-se um aumento no imunoconteúdo depois de 10 ou 2+10 min de isquemia; em 10 min o aumento de fosforilação foi paralelo ao imunoconteúdo, enquanto com 2+10min de isquemia, quando a região CA1 se tornou resistente, houve uma diminuição na porcentagem de HSP27 fosforilada. Os resultados sugerem que a HSP27 pode estar atuando como chaperona, protegendo outras proteínas da desnaturação nos astrócitos, os quais podem auxiliar os neurônios a sobreviverem por manter a homeostase do tecido. Em culturas organotípicas, foram usados 5 ou 10 min de privação de glicose e oxigênio (OGD) ou 1µM de NMDA para induzir tolerância ao tempo letal, 40 min, de privação de glicose e oxigênio (OGD). Nesse caso, foi observado um aumento no imunoconteúdo de HSP27 depois de todos os tratamentos, mas a porcentagem de HSP27 fosforilada se manteve constante ou aumentou quando o pré-condicionamento ocorreu. A HSP27 pode estar modulando os filamentos de actina ou bloqueando o processo apoptótico, facilitando a sobrevivência das células. Em conjunto, os resultados sugerem que o mecanismo que leva à morte de células pode ser diferente nos dois modelos, exigindo atuações distintas da proteína.

Predição de sítios de ligação para a cisplatina e transplatina baseada em ligações de hidrogênio

Pós-graduação em Biofísica Molecular - IBILCE

Chaperonas moleculares y tolerancia a estrés abiótico en especies arbóreas

Las temperaturas extremas, la sequía y otros estreses abióticos limitan la producción forestal de forma significativa, causando grandes pérdidas económicas en el sector. Los árboles, al ser organismos sésiles, han desarrollado una serie de estrategias para percibir dichos factores, activando respuestas defensivas apropiadas. Entre ellas ocupa un lugar preeminente la síntesis de proteínas con actividad chaperona molecular. Las chaperonas moleculares interaccionan con proteínas desnaturalizadas total o parcialmente, promoviendo su correcto plegamiento y ensamblaje. Las chaperonas moleculares que se sintetizan de forma predominante en plantas, pero no en otros eucariotas, pertenecen a la familia sHSP (small heat-shock proteins). Se trata de una familia inusualmente compleja y heterogénea, cuyos miembros son de pequeño tamaño (16-42 kD) y poseen un dominio “alfa-cristalina” muy conservado. Estas proteínas están implicadas en protección frente a estrés abiótico mediante la estabilización de proteínas y membranas, si bien su mecanismo de acción se conoce de forma incompleta. A pesar del evidente potencial aplicado de las proteínas sHSP, son muy escasos los estudios realizados hasta el momento con un enfoque netamente biotecnológico. Por otra parte, casi todos ellos se han llevado a cabo en especies herbáceas de interés agronómico o en especies modelo, como Arabidopsis thaliana. De ahí que las sHSP de arbóreas hayan sido mucho menos caracterizadas estructural y funcionalmente, y ello a pesar del interés económico y ecológico de los árboles y de su prolongada exposición vital a múltiples factores estresantes. La presente Tesis Doctoral se centra en el estudio de sHSP de varias especies arbóreas de interés económico. El escrutinio exhaustivo de genotecas de cDNA de órganos vegetativos nos ha permitido identificar y caracterizar los componentes mayoritarios de tallo en dos especies productoras de madera noble: nogal y cerezo. También hemos caracterizado la familia completa en chopo, a partir de su secuencia genómica completa. Mediante expresión heteróloga en bacterias, hemos analizado el efecto protector de estas proteínas in vivo frente a distintos tipos de estrés abiótico, relevantes para el sector productivo. Los resultados demuestran que las proteínas sHSP-CI: (i) aumentan la viabilidad celular de E.coli frente a casi todos estos factores, aplicados de forma individual o combinada; (ii) ejercen un rol estabilizador de las membranas celulares frente a condiciones adversas; (iii) sirven para mejorar la producción de otras proteínas recombinantes de interés comercial. El efecto protector de las proteínas sHSP-CI también ha sido analizado in planta, mediante la expresión ectópica de CsHSP17.5-CI en chopos. En condiciones normales de crecimiento no se han observado diferencias fenotípicas entre las líneas transgénicas y los controles, lo que demuestra que se pueden sobre-expresar estas proteínas sin efectos pleiotrópicos deletéreos. En condiciones de estrés térmico, por el contrario, los chopos transgénicos mostraron menos daños y un mejor crecimiento neto. En línea con lo anterior, las actividades biológicas de varias enzimas resultaron más protegidas frente a la inactivación por calor, corroborando la actividad chaperona propuesta para la familia sHSP y su conexión con la tolerancia al estrés abiótico. En lo que respecta a la multiplicación y propagación de chopo in vitro, una forma de cultivo que comporta estrés para las plantas, todas las líneas transgénicas se comportaron mejor que los controles en términos de producción de biomasa (callos) y regeneración de brotes, incluso en ausencia de estrés térmico. También se comportaron mejor durante su cultivo ex vitro. Estos resultados tienen gran potencial aplicado, dada la recalcitrancia de muchas especies vegetales de interés económico a la micropropagación y a la manipulación in vitro en general. Los resultados derivados de esta Tesis, aparte de aportar datos nuevos sobre el efecto protector de las proteínas sHSP citosólicas mayoritarias (clase CI), demuestran por vez primera que la termotolerancia de los árboles puede ser manipulada racionalmente, incrementando los niveles de sHSP mediante técnicas de ingeniería genética. Su interés aplicado es evidente, especialmente en un escenario de calentamiento global. ABSTRACT Abiotic stress produces considerable economic losses in the forest sector, with extreme temperature and drought being amongst the most relevant factors. As sessile organisms, plants have acquired molecular strategies to detect and recognize stressful factors and activate appropriate responses. A wealth of evidence has correlated such responses with the massive induction of proteins belonging to the molecular chaperone family. Molecular chaperones are proteins which interact with incorrectly folded proteins to help them refold to their native state. In contrast to other eukaryotes, the most prominent stress-induced molecular chaperones of plants belong to the sHSP (small Heat Shock Protein) family. sHSPs are a widespread and diverse class of molecular chaperones that range in size from 16 to 42k Da, and whose members have a highly conserved “alpha-crystallin” domain. sHSP proteins play an important role in abiotic stress tolerance, membrane stabilization and developmental processes. Yet, their mechanism of action remains largely unknown. Despite the applied potential of these proteins, only a few studies have addressed so far the biotechnological implications of this protein family. Most studies have focused on herbaceous species of agronomic interest or on model species such as Arabidopsis thaliana. Hence, sHSP are poorly characterized in long-lived woody species, despite their economic and ecological relevance. This Thesis studies sHSPs from several woody species of economic interest. The most prominent components, namely cytosolic class I sHSPs, have been identified and characterized, either by cDNA library screening (walnut, cherry) or by searching the complete genomic sequence (poplar). Through heterologous bacterial expression, we analyzed the in vivo protective effects of selected components against abiotic stress. Our results demonstrate that sHSP-CI proteins: (i) protect E. coli cells against different stressful conditions, alone or combined; (ii) stabilize cell membranes; (iii) improve the production of other recombinant proteins with commercial interest. The effects of CsHSP17.5-CI overexpression have also been studied in hybrid poplar. Interestingly, the accumulation of this protein does not have any appreciable phenotypic effects under normal growth conditions. However, the transgenic poplar lines showed enhanced net growth and reduced injury under heat-stress conditions compared to vector controls. Biochemical analysis of leaf extracts revealed that important enzyme activities were more protected in such lines against heat-induced inactivation than in control lines, lending further support to the chaperone mode of action proposed for the sHSP family. All transgenic lines showed improved in vitro and ex vitro performance (calli biomass, bud induction, shoot regeneration) compared to controls, even in the absence of thermal stress. Besides providing new insights on the protective role of HSP-CI proteins, our results bolster the notion that heat stress tolerance can be readily manipulated in trees through genetic engineering. The applied value of these results is evident, especially under a global warming scenario.

Mecanismo de interacción, calcio dependiente, entre Calcineurina y PERK, involucrado en el Estrés de Retículo Endoplásmico

El Estrés de Retículo Endoplásmico (RE) es inducido por la acumulación de proteínas sin plegar en el lumen de la organela. Esto se puede observar en diversas situaciones fisio-patológicas como durante una infección viral o en proceso isquémico. Además, contribuye a la base molecular de numerosas enfermedades ya sea índole metabólico (Fibrosis quística o Diabetes Miellitus) o neurodegenerativas como mal de Alzheimer o Parkinson (Mutat Res, 2005, 569). Para restablecer la homeostasis en la organela se activa una señal de transducción (UPR), cuya respuesta inmediata es la atenuación de la síntesis de proteína debido a la fosforilación de subunidad alpha del factor eucariótico de iniciación de translación (eIF2α) vía PERK. Esta es una proteína de membrana de RE que detecta estrés. Bajo condiciones normales, PERK está inactiva debido a la asociación de su dominio luminar con la chaperona BIP (Nat Cell Biol, 2000, 2: 326). Frente a una situación de estrés, la chaperona se disocia causando desinhibición. Recientemente, (Plos One 5: e11925) se observó, bajo condiciones de estrés, un aumento de Ca2+ citosólico y un rápido incremento de la expresión de calcineurina (CN), una fosfatasa citosólica dependiente de calcio, heterodimérica formada por una subunidad catalítica (CN-A) y una regulatoria (CN-B). Además, CN interacciona, sin intermediarios, con el dominio citosólico de PERK favoreciendo su trans-autofosforilación. Resultados preliminares indican que, astrocitos CNAβ-/- exhibieron, en condiciones basales, un mayor número de células muertas y de niveles de eIF2α fosforilado que los astrocitos CNAα-/-. Hipótesis: CNAβ/B interacciona con PERK cuando el Ca2+ citosólico esta incrementado luego de haberse inducido Estrés de RE, lo cual promueve dimerización y auto-fosforilación de la quinasa, acentuándose así la fosforilación de eIF2α e inhibición de la síntesis de proteínas. Esta activación citosólica de PERK colaboraría con la ya descrita, desinhibición luminal llevada cabo por BIP. Cuando el Ca2+ citosólico retorna a los niveles basales, PERK fosforila a CN, reduciendo su afinidad de unión y disociándose el complejo CN/PERK. Objetivo general: Definir las condiciones por las cuales CN interacciona con PERK y regula la fosforilación de eIF2α e inhibición de la síntesis de proteína. Objetivos específicos: I-Estudiar la diferencia de afinidades y dependencia de Ca2+, de las dos isoformas de CN (α y β) en su asociación con PERK. Además verificar la posible participación de la subunidad B de CN en esta interacción. II-Determinar si la auto-fosforilación de PERK es diferencialmente regulada por las dos isoformas de CN. III-Discernir la relación del estado de fosforilación de CN con su unión a PERK. IV-Determinar efectos fisiológicos de la interacción de CN-PERK durante la respuesta de Estrés de RE. Para llevar a cabo este proyecto se realizarán experimentos de biología molecular, interacción proteína-proteína, ensayos de fosforilación in vitro y un perfil de polisoma con astrocitos CNAβ-/- , CNA-/- y astrocitos controles. Se espera encontrar una mayor afinidad de unión a PERK de la isoforma β de CN y en condiciones donde la concentración de Ca2+ sea del orden micromolar e imite niveles del ión durante un estrés. Con respecto al estado de fosforilación de CN, debido a los resultados preliminares, donde solo se la encontró fosforilada en condiciones basales, se piensa que CN podría interactuar con mayor afinidad con PERK cuando CN se encuentre desfosforilada. Por último, se espera encontrar un aumento de eIF2α fosforilado y una acentuación de la atenuación de la síntesis de proteína como consecuencia de la mayor activación de PERK por su asociación con la isoforma β de CN en astrocitos donde el Estrés de RE se indujo por privación de oxigeno y glucosa. Estos experimentos permitirán avanzar en el estudio de una nueva función citoprotectora de CN recientemente descrita por nuestro grupo de trabajo y sus implicancias en un modelo de isquemia.

Implicación de LKB1 en la patogénesis y progresión del cáncer de próstata.

303 p.

The effect of chaperone compounds on glucocerebrosidase stability and activity in fibroblasts from Gaucher Disease patients with different genotypes

Dissertação de mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2014

Caracterisation fonctionelle d'un facteur d'elongation mitochondrial leEF-Tsmt chez la tomate: approaches par transgenese et proteomique.

Esta tese é relacionada ao estudo funcional de um gene que codifica um fator de elongação LeEF-Tsmt em tomate. Este gene participa no processo de síntese de proteína em mitocôndrias e apresenta uma forte expressão durante o processo de maturação quando comparado a outros órgãos. Nós demonstramos que o mesmo se exprime fortemente durante as primeiras fases do processo maturação em paralelo com a crise respiratória climatérica e que sua expressão é estimulada pelo etileno, ferimento e altas temperaturas. Porém, os mutantes de tomate insensíveis ao etileno, exibem uma expressão normal. Frutos transgênicos foram gerados, nos quais o LeEF-Tsmt foi aumentado ou inibido de uma forma constitutiva. Porém, a alteração da expressão do gene através da transformação genética com construções sentido e antisense do gene LeEF-Tsmt não afeta o padrão de respiração e produção de etileno durante a maturação e após o ferimento. Além disso, a expressão do gene da alternativa oxidase, que é conhecida por apresentar um papel importante no climatério respiratório, não foi afetada. Todos estes dados indicam que apesar de sua forte regulação, o LeEF-Tsmt não é limitante da atividade respiratória mitocondrial. A expressão do gene de LeEF-Tsmt é estimulada pelo efeito do estresse oxidativo induzido nas partes vegetativas da planta pela seca e o paraquat. A sensibilidade ao estresse oxidativo avaliado em folhas pela presença de necrose e em calos através de crescimento celular, foi reduzido em plantas antisentido. Entre as enzimas conhecidas por apresentar um papel na detoxificação de espécies reativas de oxigênio, superóxido dismutase (SOD), catalases (CAT), peroxidase (PX) e glutation redutase (GR), nós demostramos que a GR e PX exibem atividade mais alta em linhas antisentido, explicando assim, pelo menos em parte, sua melhor tolerância ao estresse. O papel da proteína de LeEF-Tsmt na síntese de proteínas mitocondriais foi estudado pela análise do proteôma mitocondrial em linhas antisentido e sentido do gene LeEF-Tsmt. A comparação dos proteômas de linhas transformadas e selvagem foi tratado com a ajuda de uma técnica de dupla marcagem 14N/15N aplicadas à tecidos de tomate cultivados in vitro. A linha sentido super expressa fortemente a proteína, enquanto que as linhas antisentidos diminuem ligeiramente. Uma proteína do tipo ?heat-shock? segue as variações da proteína LeEF-Tsmt, sugerindo um possível papel chaperona. Uma análise global do proteôma mitocondrial foi executada, fornecendo novas informações sobre um conjunto de ao redor 500 proteínas mitocondriais de tomate.