Aplicação da equação de Fokker-Planck no estudo de canais iônicos

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Síntese de N-Alquilsulfonamidas análogas do PABA com potencial atividade antagonista de canais iônicos

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Ação de anestésicos gerais em canais iônicos

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Molecular, 2016.

Estudo exploratório da excitabilidade axonal com a "técnica threshold tracking" : controlos saudáveis e doentes com polineuropatia amilóide familiar

Tese de mestrado, Neurociências, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2015

Imunorreatividade à FMRF-amida no sistema nervoso central e na musculatura pediosa de Megalobulimus oblongus

O mapeamento da imunorreatividade ao neuropeptídio FMRF-amida no SNC e na musculatura pediosa de Megalobulimus oblongus foi realizado com o objetivo de dar continuidade aos estudos que vem sendo realizados nesta espécie, com o interesse em estabelecê-lo como modelo experimental em estudos neurobiológicos. O neuropeptídio FMRF-amida foi o primeiro peptídio nativo de invertebrados a ser purificado e seqüenciado, a partir do extrato de gânglios cardioativos do molusco Macrocallista nimbosa. Ele atuaria sobre os receptores metabotrópicos, induzindo a abertura dos canais iônicos de K+ tipo S (sensíveis à serotonina (5HT)), hiperpolarizando a membrana celular e assim, aumentando o limiar para o desencadeamento do potencial de ação. A distribuição da imunorreatividade à FMRF-amida em M. oblongus foi investigada empregando-se a técnica imunohistoquímica com anticorpo não-marcado de Sternberger (1979). Todos os gânglios nervosos centrais apresentaram neurônios e fibras FLI (FMRF-amide-like immunoreactivity), assim como suas comissuras, conetivos e a maioria dos nervos emergentes destes gânglios. Nos cortes da musculatura pediosa observou-se também uma intensa imunorreatividade a FMRF-amida. O maior número de neurônios FLI foi encontrado nos gânglios cerebrais com seus tamanhos variando de pequeno a grande. O corpo dorsal apresentou grande quantidade de fibras viii imunomarcadas. No mesocérebro foram detectados alguns agrupamentos FLI junto ao neuropilo e à comissura cerebral e neurônios dispersos na sua porção ântero-medial. O pró-cérebro mostrou-se repleto de neurônios globulosos FLI. Vários agrupamentos foram observados nos lobos pedal, pleural e comissural do pós-cérebro. Nos gânglios pedais houve intensa imunomarcação em agrupamentos neuronais localizados principalmente nas regiões posterior e lateral dos gânglios. Na região anterior foi observado um par de neurônios gigantes FLI. Uma distribuição homogênea de neurônios FLI foi observada por toda a extensão dos gânglios pleurais, com a exceção de apenas um neurônio grande localizado no gânglio pleural esquerdo. A diferença no tamanho dos dois gânglios parietais foi constatada também em M. oblongus. No hemigânglio esquerdo, o menor, foi identificado um neurônio gigante (300 µm). O gânglio direito apresentou um número maior de neurônios FLI, de tamanhos variados. O gânglio visceral foi a estrutura que mais apresentou neurônios grandes e gigantes por toda a sua extensão, com imunorreatividades variáveis. O par de gânglios bucais possuía agrupamentos neuronais FLI médios e grandes. Os neurônios gigantes não se mostraram imunorreativos, ou foram apenas levemente imunomarcados no trofospôngio. Na musculatura pediosa foram observadas fibras nervosas de diferentes calibres nas regiões dorsal, medial e ventral e sobre as células musculares. Identificaram-se gânglios nervosos nos pontos de intersecção dos ramos nervosos e malhas nervosas que formavam plexos nervosos nas regiões ventral e dorsal da musculatura pediosa de M. oblongus.

Papel da localização da carga em determinação dos parâmetros do canal iônico

To aureus α-HL channel, we used the cysteine-scanning mutagenesis technique. Twenty-four mutants were produced from the substitution of a single aminoacid of the primary structure of the α-HL pro this yzed after the incorporation of a mutant channel in planar lipid bilayer membranes. The modified proteins were studied in the absence and presence of watersoluble specific sulphydryl-specific reagents, in order to introduce a strong positive or negative harge at positions of substitution. The introduction of a negative charge in the stem region onverted the selectivity of the channel from weak anionic to more cationic. However, the troduction of a positive charge increased its selectivity to the anion. The degree of these alterations was inversely dependent on the channel radius at the position of the introduced harge (selectivity). As to the asymmetry of the conductance-voltage, the influence of the harge was more complex. The introduction of the negative charge in the stem region (the trans art of the pore) provoked a decrease. The intensity of these alterations depended on the radius, and on the type of free charge at the pore entrance. These results suggest that the free charge at surrounds the pore wall is responsible for the cation-anion selectivity of the channel. The istribution of the charges between the entrances is crucial for determining the asymmetry of e conductance-voltage curves. We hope that these results serve as a model for studies with other nanometric channels, in biological or planar lipid bilayer membranes or in iotechnological applications

Indicadores de cálcio e de voltagem codificados geneticamente na detecção de potenciais de ação e inputs sinápticos em cultura de neurônios hipocampais

Recently, genetically encoded optical indicators have emerged as noninvasive tools of high spatial and temporal resolution utilized to monitor the activity of individual neurons and specific neuronal populations. The increasing number of new optogenetic indicators, together with the absence of comparisons under identical conditions, has generated difficulty in choosing the most appropriate protein, depending on the experimental design. Therefore, the purpose of our study was to compare three recently developed reporter proteins: the calcium indicators GCaMP3 and R-GECO1, and the voltage indicator VSFP butterfly1.2. These probes were expressed in hippocampal neurons in culture, which were subjected to patchclamp recordings and optical imaging. The three groups (each one expressing a protein) exhibited similar values of membrane potential (in mV, GCaMP3: -56 ±8.0, R-GECO1: -57 ±2.5; VSFP: -60 ±3.9, p = 0.86); however, the group of neurons expressing VSFP showed a lower average of input resistance than the other groups (in Mohms, GCaMP3: 161 ±18.3; GECO1-R: 128 ±15.3; VSFP: 94 ±14.0, p = 0.02). Each neuron was submitted to current injections at different frequencies (10 Hz, 5 Hz, 3 Hz, 1.5 Hz, and 0.7 Hz) and their fluorescence responses were recorded in time. In our study, only 26.7% (4/15) of the neurons expressing VSFP showed detectable fluorescence signal in response to action potentials (APs). The average signal-to-noise ratio (SNR) obtained in response to five spikes (at 10 Hz) was small (1.3 ± 0.21), however the rapid kinetics of the VSFP allowed discrimination of APs as individual peaks, with detection of 53% of the evoked APs. Frequencies below 5 Hz and subthreshold signals were undetectable due to high noise. On the other hand, calcium indicators showed the greatest change in fluorescence following the same protocol (five APs at 10 Hz). Among the GCaMP3 expressing neurons, 80% (8/10) exhibited signal, with an average SNR value of 21 ±6.69 (soma), while for the R-GECO1 neurons, 50% (2/4) of the neurons had signal, with a mean SNR value of 52 ±19.7 (soma). For protocols at 10 Hz, 54% of the evoked APs were detected with GCaMP3 and 85% with R-GECO1. APs were detectable in all the analyzed frequencies and fluorescence signals were detected from subthreshold depolarizations as well. Because GCaMP3 is the most likely to yield fluorescence signal and with high SNR, some experiments were performed only with this probe. We demonstrate that GCaMP3 is effective in detecting synaptic inputs (involving Ca2+ influx), with high spatial and temporal resolution. Differences were also observed between the SNR values resulting from evoked APs, compared to spontaneous APs. In recordings of groups of cells, GCaMP3 showed clear discrimination between activated and silent cells, and reveals itself as a potential tool in studies of neuronal synchronization. Thus, our results indicate that the presently available calcium indicators allow detailed studies on neuronal communication, ranging from individual dendritic spines to the investigation of events of synchrony in neuronal networks genetically defined. In contrast, studies employing VSFPs represent a promising technology for monitoring neural activity and, although still to be improved, they may become more appropriate than calcium indicators, since neurons work on a time scale faster than events of calcium may foresee

Estudo da relação estrutura/atividade para as ações neurotóxica/neuroprotetora das acilpoliaminotoxinas NSTX-3 e JSTX-3 em sistema nervoso central de ratos

Pós-graduação em Ciências Biológicas (Biologia Celular e Molecular) - IBRC

Redução da densidade de extrassístoles e dos sintomas relacionados após administração de magnésio por via oral

FUNDAMENTO: As extrassístoles ventriculares e supraventriculares (EV e ESSV) são frequentes e muitas vezes sintomáticas. O íon magnésio (Mg) desempenha um papel importante na fisiologia do potencial de ação transmembrana celular e do ritmo cardíaco. OBJETIVO: Avaliar se a administração do pidolato de magnésio (PMg) em pacientes com EV e ESSV tem desempenho superior ao uso do placebo (P) na melhora dos sintomas e densidade das extrassístoles (DES). MÉTODOS: Estudo duplo-cego, randomizado, com 60 pacientes sintomáticos consecutivos, com mais de 240/EV ou ESSV ao Holter de 24 horas e selecionados para receber P ou PMg. Para avaliar a melhora da sintomatologia, foi feito um questionário categórico e específico de sintomas relacionados às extrassístoles. Após o tratamento, foi considerada significante uma redução de mais de 70% na DES por hora. A dose do PMg foi de 3,0 g/dia por 30 dias, equivalente a 260 mg do elemento Mg. Nenhum paciente tinha cardiopatia estrutural ou insuficiência renal. RESULTADOS: Dos 60 pacientes estudados, 33 eram do sexo feminino (55%). A faixa etária variou de 16 a 70 anos. No grupo PMg, 76,6% dos pacientes tiveram redução maior que 70%, 10% deles maior que 50% e somente 13,4% tiveram redução menor que 50% na DES. No grupo P, 40% dos pacientes tiveram melhora de apenas 30% na frequência de extrassístoles (p < 0,001). A melhora dos sintomas foi alcançada em 93,3% dos pacientes do grupo PMg, comparada com somente 16,7% do grupo P (p < 0,001). CONCLUSÃO: A suplementação de Mg via oral reduziu a DES, resultando em melhora dos sintomas.

Estimulação optogenética do septo medial no rato anestesiado e em livre comportamento

Theta rhythm consists of an electrophysiological hippocampal oscillation present in mammalian species (4-12 Hz with variations across species). This oscillation is present during active waking and is also prevalent in local field potentials (LFP) during rapid eye movement sleep (REM sleep). Several studies have shown that theta rhythm is important in cognitive tasks and that the medial septum is a key region for its occurrence. The septum sends cholinergic, GABAergic and glutamatergic projections to the hippocampus, which in turn projects axons to the septum. Besides the septum, other regions are involved in regulating theta rhythm, forming a complex network of interactions among brain areas that result in theta rhythm. Optogenetics is a recently developed method that has been widely used in various research areas. It allows us to manipulate the electrical activity of neurons through light stimulation. One of the existing techniques consists in using a viral vector to induce the neuronal expression of ion channels associated with the light-sensitive molecule rhodopsin (e.g. ChR2). Once infected, the neurons become sensitive to light of a particular wavelength. The present M. Sc. research aimed to perform luminous stimulation of the brain in anesthetized and freely behaving animals using chronically implanted electrodes and optical fibers in animals infected with a viral vector for ChR2 expression. Surgical viral injections were performed in the medial septum; histological results confirmed the expression of ChR2 by way of the presence of the eYFP reporter protein in the septum and also in hippocampal processes. Moreover, we performed acute experiments with luminous stimulation of the medial septum and LFP recordings of the septum and hippocampus of anesthetized animals. Action potentials were recorded in the septum. In these experiments we observed a significant increase in the firing rates of septal neurons during luminous stimulation (n = 300 trials). Furthermore, we found an early light-evoked response in the hippocampal LFP. Chronic experiments with luminous stimulation of the medial septum and hippocampus in freely behaving animals were also performed in combination with LFP recordings. We found that the luminous stimulation of the septum is able to induce theta rhythm in the hippocampus. Together, the results demonstrate that the luminous stimulation of the medial septum in optogenetically-modified animals causes relevant electrophysiological changes in the septum and the hippocampus.

Modelagem dos efeitos da irradiação luminosa no cérebro de camundongos e rastreamento de neurônios durante experimentos de microscopia de fluorescência

The fluorescent proteins are an essential tool in many fields of biology, since they allow us to watch the development of structures and dynamic processes of cells in living tissue, with the aid of fluorescence microscopy. Optogenectics is another technique that is currently widely used in Neuroscience. In general, this technique allows to activate/deactivate neurons with the radiation of certain wavelengths on the cells that have ion channels sensitive to light, at the same time that can be used with fluorescent proteins. This dissertation has two main objectives. Initially, we study the interaction of light radiation and mice brain tissue to be applied in optogenetic experiments. In this step, we model absorption and scattering effects using mice brain tissue characteristics and Kubelka-Munk theory, for specific wavelengths, as a function of light penetration depth (distance) within the tissue. Furthermore, we model temperature variations using the finite element method to solve Pennes’ bioheat equation, with the aid of COMSOL Multiphysics Modeling Software 4.4, where we simulate protocols of light stimulation tipically used in optogenetics. Subsequently, we develop some computational algorithms to reduce the exposure of neuron cells to the light radiation necessary for the visualization of their emitted fluorescence. At this stage, we describe the image processing techniques developed to be used in fluorescence microscopy to reduce the exposure of the brain samples to continuous light, which is responsible for fluorochrome excitation. The developed techniques are able to track, in real time, a region of interest (ROI) and replace the fluorescence emitted by the cells by a virtual mask, as a result of the overlay of the tracked ROI and the fluorescence information previously stored, preserving cell location, independently of the time exposure to fluorescent light. In summary, this dissertation intends to investigate and describe the effects of light radiation in brain tissue, within the context of Optogenetics, in addition to providing a computational tool to be used in fluorescence microscopy experiments to reduce image bleaching and photodamage due to the intense exposure of fluorescent cells to light radiation.

Desenvolvimento de magnetizador para tratamento magnético da água

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade Gama, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, 2015.

Retenção em canais amplos de núcleos confeccionados por diferentes técnicas com pinos fibro resinosos

O propósito desse trabalho foi verificar a retenção de pinos fibro resinosos cimentados em canais radiculares alargados simulando raízes extensamente comprometidas, fabricados por duas técnicas usadas para diminuir sua desadaptação; comparando-as ao pino fixado somente com cimento. Foram utilizados vinte e quatro raízes de dentes humanos unirradiculares, padronizadas com 15.0 mm de comprimento e 5.0 0.3 mm de diâmetro. As raízes foram incluídas em resina acrílica e divididas em grupos de acordo com a técnica usada: grupo I - pino DC White Post no2 cimentado com sistema adesivo quimicamente ativado e com cimento resinoso dual; grupo II mesmo pino reanatomizado com resina composta para copiar a anatomia do canal radicular, cimentado da mesma forma; e grupo III mesmo pino associado a três pinos acessórios, cimentados do mesmo modo. O canal radicular teve seu diâmetro padronizado pela broca no2 para o pino DC em uma profundidade de 12.0 mm e alargado com uma broca tronco cônica em uma profundidade de 10.0 mm. As oito raízes de cada grupo foram seccionadas transversalmente em três discos de 3.0 mm, a partir da cervical para a execução de um ensaio de extrusão, descartando-se os últimos 2.0 mm, que serviram somente para centralizar o pino. Os valores de retenção foram registrados e tratados estatisticamente por ANOVA e pelo teste SNK (p<0.05). Diferenças significativas foram observadas entre três porções radiculares investigadas em todos os grupos, com os valores de retenção diminuindo da cervical para apical. A retenção na porção apical do grupo com pinos customizado com resina foi estatisticamente maior que na mesma região dos demais grupos. Nenhuma diferença foi encontrada entre o grupo com pinos acessórios e o grupo somente com pino e cimento nessa parte da raiz. Nenhuma diferença foi observada comparando as porções cervical e média dos diferentes grupos. Os tipos de falha após o teste de extrusão foram observados em microscópio eletrônico de varredura com aumento de 200, 600 e 1000 vezes. Elas ocorreram exclusivamente entre o pino e o cimento ou a resina composta. A camada de adesão (camada híbrida) foi mais facilmente observada nas porções cervical e média de todos os grupos. Isso sugere que a retenção nas porções apicais da raiz é predominantemente friccional. Uma vez que pinos acessórios somente alcançam até a porção média do canal radicular, a retenção do pino não é aumentada com essa técnica.

Quantificação da área ocupada pela guta-percha e pelo Resilon em canais achatados após termoplastificação

O presente trabalho teve por objetivo quantificar, comparativamente, a área de preenchimento de dois materiais obturadores sólidos, cones de guta-percha (GP) e cones de Resilon (R), no terço apical de incisivos inferiores humanos, ex vivo, obturados pela técnica da onda contínua de condensação. Os espécimes foram submetidos a um protocolo, desde a cirurgia de acesso até o final do preparo químico-mecânico e divididos aleatoriamente em dois grupos, de 21 dentes cada, de acordo com o material utilizado. Não foi utilizado cimento endodôntico em nenhuma das amostras. Após a obturação, as amostras foram seccionadas transversalmente em dois níveis, a 3 e a 5mm do ápice, e subdivididas em grupos de acordo com a altura de corte e do material obturador, sendo estabelecido: GP3 (guta-percha com corte a 3mm), GP5 (guta-percha com corte a 5mm), R3 (Resilon com corte a 3mm) e R5 (Resilon com corte a 5mm). Posteriormente, as amostras foram submetidas a um processo de lixamento e polimento e examinadas em microscópio óptico por reflexão com aumento de 50x a 100x. Para a análise e processamento digital das imagens, foi utilizado o sistema de imagens Axio Vision 4.6 para Windows, sendo obtidas as medidas para cada área observada em micrômetros (μm); uma da área da cavidade, e outra da área de material obturador. Foi aferido o grau de circularidade de cada amostra, por uma fórmula matemática utilizada automaticamente pelo programa, onde 1 (um) é considerado o círculo perfeito e, quanto mais achatado o canal, mais tendente a 0 (zero) nesta escala. Obteve-se a área do canal, a circularidade de 0 a 1, a área preenchida pelo material obturador e, a porcentagem da área de preenchimento do material obturador em relação à área do canal. Foi realizado o cruzamento dos grupos dois a dois pelo teste t de Student, sendo verificada diferença estatisticamente significante entre os grupos GP3 e R3, tendo o grupo R3 apresentado maior porcentagem de área do canal radicular preenchida pelo material obturador em suas amostras (p<0,05). Na relação da circularidade com a quantidade de preenchimento, com o teste de Correlação de Pearson, não foi observada forte correlação entre a forma final do canal (relação de circularidade) e a quantidade de preenchimento do canal radicular pelos materiais obturadores testados. Conclui-se que houve grande variação de preenchimento mínimo e máximo em todos os grupos testados e o Resilon apresentou maior porcentagem de preenchimento de área do canal radicular em suas amostras.

Infiltração microbiana por Enterococcus faecalis em canais retrobturados com MTA, iRoot SP e Endo CPM Sealer

O objetivo deste trabalho consistiu na análise da infiltração apical em dentes retrobturados por três materiais: MTA, iROOT SP e Endo CPM Sealer. Para tal, foram utilizados 51 dentes humanos extraídos, incisivos centrais superiores, que foram instrumentados manualmente com limas tipo K, pela técnica Crown-down, obturados com compactação lateral e, após serem apicectomizados a 3mm aquém do ápice foram submetidos à retrobturação, com os três materiais propostos. As amostras foram divididas, randomicamente, em três grupos: GI MTA, GII iROOT SP e GIII Endo CPM Sealer, cada grupo com 15 amostras. Os dentes foram inseridos em tubos de eppendorfs, e feitos a impermeabilização do remanescente radicular utilizando duas camadas de cianocrilato, epóxi, e outra camada de esmalte. Em cada eppendorf foi adicionado caldo TSB estéril e uma suspensão de Enterococcos faecalis e adaptado ao frasco de vidro com meio de cultura enterococcosel. A infiltração bacteriana foi verificada pela turvação do meio de cultura. Após a análise no período de 60 dias, podemos concluir que durante esse tempo ocorreram infiltrações no Grupo I, 43,75 % das amostras apresentaram turvamento do meio de cultura demonstrando persistência da infecção. Já no Grupo II, 31,25 % das amostras tiveram crescimento bacteriano. Por fim no Grupo III, 25,00 % houve a infiltração. Grupos controle positivo e negativo para crescimento bacteriano foram realizados (n=3, cada). Os cimentos testados comportaram-se de maneira semelhante frente à infiltração bacteriana durante o período testado.