Veículos e vetores em terapia génica

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz

Desenvolvimento de nanosistemas farmacêuticos para terapia gênica

Gene therapy is one of the major challenges of the post-genomic research and it is based on the transfer of genetic material into a cell, tissue or organ in order to cure or improve the patient s clinical status. In general, gene therapy consists in the insertion of functional genes aiming substitute, complement or inhibit defective genes. The achievement of a foreigner DNA expression into a population of cells requires its transfer to the target. Therefore, a key issue is to create systems, vectors, able to transfer and protect the DNA until it reaches the target. The disadvantages related to the use of viral vectors have encouraged efforts to develop emulsions as non-viral vectors. In fact, they are easy to produce, present suitable stability and enable transfection. The aim of this work was to evaluate two different non-viral vectors, cationic liposomes and nanoemulsions, and the possibility of their use in gene therapy. For the two systems, cationic lipids and helper lipids were used. Nanoemulsions were prepared using sonication method and were composed of Captex® 355; Tween® 80; Spam® 80; cationic lipid, Stearylamine (SA) or 1,2-dioleoyl-3-trimethylammoniumpropane (DOTAP) and water (Milli-Q®). These systems were characterized by average droplet size, Polidispersion Index (PI) and Zeta Potential. The stability of the systems; as well as the DNA compaction capacity; their cytotoxicity and the cytotoxicity of the isolated components; and their transfection capacity; were also evaluated. Liposomes were made by hydration film method and were composed of DOTAP; 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), containing or not Rhodaminephosphatidylethanolamine (PE- Rhodamine) and the conjugate Hyaluronic Acid DOPE (HA-DOPE). These systems were also characterized as nanoemulsions. Stability of the systems and the influence of time, size of plasmid and presence or absence of endotoxin in the formation of lipoplexes were also analyzed. Besides, the ophthalmic biodistribution of PE-Rhodamine containing liposomes was studied after intravitreal injection. The obtained results show that these systems are promising non-viral vector for further utilization in gene therapy and that this field seems to be very important in the clinical practice in this century. However, from the possibility to the practice, there is still a long way

Ocorrência da infecção por Toxoplasma gondii e avaliação da imunização em caprinos do sertão do cabugi, Rio Grande do Norte

Toxoplasmosis is one zoonosis caused by Toxoplasma gondii protozoan. Goats, amongst the production animals, are one of the species most susceptible to this parasite, being one them main involved agents in ovine and goat abortions, determining great economic losses and implications for public health, since the presence it parasite in the products of goat origin, consist in one of the main sources of infection for the man. In this study 244 blood samples in 8 farms situated in 4 cities from the Sertão do Cabugi region, Rio Grande do Norte State, northeast of Brazil and, tested by ELISA assay. The results had shown a prevalence of 47.13% for anti- T. gondii antibodies and a significant association between positivity and variable evaluated as age, locality and property. The IgG avidity assay evaluated in 115 positive samples was carried to discriminate acute and chronic infection. Twelve samples (10.4%) had presented antibodies of low avidity while 103 (89.6%) presented high avidity antibodies; indicating that most of the animals was precocious exposure to the parasite. Significant difference was verified only for the variable sex. We also evaluate the capacity of recombinant adenoviruses codifying SAG1, SAG2, SAG3 and CMV in inducing activation of specific immune response in goat. These 109 animals received 109 pfu of the AdSAG1, AdSAG2, AdSAG3, AdCMV or PBS in vaccine protocol with 3 immunizations. Serum samples of the each animal, before and after mmunization, had been submitted to the ELISA. The results demonstrate that the immunizations had induced the production of IgG antibodies specific against T. gondii proteins

Desenvolvimento de sistemas farmacêuticos emulsionados para veiculação gênica

Broadly speaking, the concept of gene therapy involves the transfer of a genetic material into a cell, tissue, or organ in order to cure a disease or at least improve the clinical status of a patient. Making it simple, gene therapy consists in the insertion of functional genes into cells containing defective genes by substituting, complementing or inhibiting them. The achievement of a foreigner DNA expression into a population of cells requires its transfer to the target. Therefore, it is a key issue to create systems able to transfer and protect the DNA until it reaches the target, the vectors. The disadvantages related to the use of viral vectors have encouraged efforts to develop emulsions as non-viral vectors. In fact, they are easily produced, present controllable stability and enable transfection. The aim of this work was to develop an emulsion for gene therapy and evaluate its ability to compact nucleic acids by the development of a complex with the plasmid pIRES2-EGFP. The first step was to determine the Hydrophilic Lipophilic Balance (HLB) of the Captex® 355 (oily internal phase of the emulsion) through long and short term stability assays. Based on the results, emulsions composed of Captex® 355, Tween 20® and Span 60® with 10.7 HLB were produced by three different methods: phase inversion, spontaneous emulsification and sonication. The results showed that the lowest diameter and best stability of the emulsions were achieved by the sonication method. The cationic emulsions were made by adding DOTAP to the basic emulsion. Its association with pIRES2-EGFP was evaluated by electrophoresis. Several rates of emulsion and DNA were evaluated and the results showed that 100% of the complex was formed when the rate DOTAP/DNA(nmol/µg) was 130. In conclusion, the overall results show the ability of the proposed emulsion to compact pIRES2-EGFP, which is a requirement to a successful transfection. Therefore, such formulation may be considered a promising candidate for gene therapy

Caracterização de nanopartículas pDNA-protamina e pDNA-protamina-lipossoma e avaliação da eficiência de entrega gênica a células de mamífero.

Em estudos de terapia gênica e vacinação por DNA, a eficiência e a segurança dos vetores que transportam o material genético terapêutico possuem papel fundamental. Vetores não virais são considerados mais seguros, mas menos eficientes em relação aos vetores virais. Em parte, isso se deve à falta de estudos sistemáticos e comparativos no que diz respeito às características físico-químicas desses vetores quando em soluções biológicas e o efeito delas sobre a eficiência de entrega gênica. O objetivo deste trabalho é avaliar o efeito do pH, da força iônica e do tipo tampão de complexação sobre as características físico-químicas de nanopartículas pDNA-protamina e pDNA-protamina-lipofectamina, visando à entrega gênica para diferentes linhagens celulares. Para isso, nanopartículas formadas em diferentes condições foram caracterizadas através de ensaios de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e potencial zeta. Os estudos indicaram que o pH, a força iônica, o tipo de tampão e a presença de meio de cultura e soro no ambiente de complexação alteram significativamente o tamanho, a polidispersidade e o potencial zeta das partículas formadas. Finalmente, buscou-se avaliar o efeito dessas características sobre a eficiência de transfecção in vitro de células de macrófagos IC21 e células HeLa. Os estudos de transfecção em células Hela indicam que tanto a composição como as condições de formação das partículas influenciam significativamente a eficiência de transfecção.

Terapia génica: conceitos e aplicações na medicina dentária

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz

Desenvolvimento de nanosistemas farmacêuticos para terapia gênica

Gene therapy is one of the major challenges of the post-genomic research and it is based on the transfer of genetic material into a cell, tissue or organ in order to cure or improve the patient s clinical status. In general, gene therapy consists in the insertion of functional genes aiming substitute, complement or inhibit defective genes. The achievement of a foreigner DNA expression into a population of cells requires its transfer to the target. Therefore, a key issue is to create systems, vectors, able to transfer and protect the DNA until it reaches the target. The disadvantages related to the use of viral vectors have encouraged efforts to develop emulsions as non-viral vectors. In fact, they are easy to produce, present suitable stability and enable transfection. The aim of this work was to evaluate two different non-viral vectors, cationic liposomes and nanoemulsions, and the possibility of their use in gene therapy. For the two systems, cationic lipids and helper lipids were used. Nanoemulsions were prepared using sonication method and were composed of Captex® 355; Tween® 80; Spam® 80; cationic lipid, Stearylamine (SA) or 1,2-dioleoyl-3-trimethylammoniumpropane (DOTAP) and water (Milli-Q®). These systems were characterized by average droplet size, Polidispersion Index (PI) and Zeta Potential. The stability of the systems; as well as the DNA compaction capacity; their cytotoxicity and the cytotoxicity of the isolated components; and their transfection capacity; were also evaluated. Liposomes were made by hydration film method and were composed of DOTAP; 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), containing or not Rhodaminephosphatidylethanolamine (PE- Rhodamine) and the conjugate Hyaluronic Acid DOPE (HA-DOPE). These systems were also characterized as nanoemulsions. Stability of the systems and the influence of time, size of plasmid and presence or absence of endotoxin in the formation of lipoplexes were also analyzed. Besides, the ophthalmic biodistribution of PE-Rhodamine containing liposomes was studied after intravitreal injection. The obtained results show that these systems are promising non-viral vector for further utilization in gene therapy and that this field seems to be very important in the clinical practice in this century. However, from the possibility to the practice, there is still a long way

Multifactorial approach to non-viral gene therapy: development of an efficient system for the retina

Tese de Doutoramento, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2016

Ocorrência da infecção por Toxoplasma gondii e avaliação da imunização em caprinos do sertão do cabugi, Rio Grande do Norte

Toxoplasmosis is one zoonosis caused by Toxoplasma gondii protozoan. Goats, amongst the production animals, are one of the species most susceptible to this parasite, being one them main involved agents in ovine and goat abortions, determining great economic losses and implications for public health, since the presence it parasite in the products of goat origin, consist in one of the main sources of infection for the man. In this study 244 blood samples in 8 farms situated in 4 cities from the Sertão do Cabugi region, Rio Grande do Norte State, northeast of Brazil and, tested by ELISA assay. The results had shown a prevalence of 47.13% for anti- T. gondii antibodies and a significant association between positivity and variable evaluated as age, locality and property. The IgG avidity assay evaluated in 115 positive samples was carried to discriminate acute and chronic infection. Twelve samples (10.4%) had presented antibodies of low avidity while 103 (89.6%) presented high avidity antibodies; indicating that most of the animals was precocious exposure to the parasite. Significant difference was verified only for the variable sex. We also evaluate the capacity of recombinant adenoviruses codifying SAG1, SAG2, SAG3 and CMV in inducing activation of specific immune response in goat. These 109 animals received 109 pfu of the AdSAG1, AdSAG2, AdSAG3, AdCMV or PBS in vaccine protocol with 3 immunizations. Serum samples of the each animal, before and after mmunization, had been submitted to the ELISA. The results demonstrate that the immunizations had induced the production of IgG antibodies specific against T. gondii proteins

Produção de vetores recombinantes para análise das propriedades biológicas e cancerígenas da proteína K1 do herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV/HHV-8)

Pós-graduação em Patologia - FMB

Produção de vetores recombinantes para expressão de diferentes formas da proteína K1 do herpesvírus associado ao Sarcoma de Kaposi (KSHV)

Kaposi´s sarcoma associated herpesvirus (KSHV) or human herpesvirus 8 (HHV-8) is a gammaherpesvirus essential for the development of all forms of Kaposi´s sarcoma (KS). The KSHV’s life cycle is basically divided into latent and lytic phases, which have distinct viral gene expression profiles. Some important oncogenic products of KSHV are expressed during the lytic phase, including the viral K1 protein. As an effect of interfer-ence with intracellular signaling, K1 expression increases proliferation and survival of KSHV-infected cells. Due to its high level of genetic variability compared to other re-gions of the viral genome, the K1-encoding ORF (ORF-K1) is commonly evaluated for KSHV genotyping. It remains unclear whether different viral genotypes have particular biological effects that might modify the KSHV oncogenicity. The present study aimed to contribute to the establishment of an experimental in vitro model for evaluation of the K1 protein from common KSHV genotypes. Recombinant expression vectors with the ORF-K1 from KSHV genotypes A, B and C were prepared by genetic cloning. The recombi-nant vectors pKSHVOK1 obtained by cloning were sequenced for structural validation. After that, HEK293 cell line was transfected with the recombinant vectors, and proteins were extracted for expression analysis by Western blot technique, for K1 functional vali-dation. Results showed that ORF-K1 vectors containing KSHV ORF-K1 from the A, B and C genotypes were produced and structurally validated by DNA sequencing. The K1 expression at the protein level was also confirmed by immunoblots using an antibody for FLAG detection, an epitope from the vector that binds to K1. Based on presented re-sults, it´s possible to conclude that the recombinant vectors will be able to be used in future studies of K1 protein biological properties from distinct KSHV genotypes

Mapeamento dos remanescentes de manguezal, a partir da interpretação de ortofotos coloridas, e análise dos vetores de pressão antrópica, como subsídio ao planejamento para conservação do ecossistema no Estado do Rio de Janeiro

Manguezal é um ecossistema costeiro que ocorre nas regiões tropicais e subtropicais do planeta, ocupando a zona entremarés dos oceanos, e sendo caracterizado pela presença de vegetação arbórea adaptada à condições adversas de salinidade, substrato, baixa oxigenação e submersão periódica. A pressão sobre os manguezais do Estado do Rio de Janeiro vem se intensificando nas últimas décadas, e estão associadas a vetores de pressão como os aterros, desmatamentos, queimadas, corte seletivo de madeira, captura predatória de moluscos e crustáceos, lançamento de efluentes de origens diversas, a superexplotação dos recursos pesqueiros e a utilização de técnicas e apetrechos inadequados. Considerando a inexistência de mapeamento integrado e atualizado dos remanescentes de manguezal, indicando sua localização e dimensionamento, o presente estudo veio suprir essa demanda, construindo uma ferramenta consistente para a análise dos principais vetores a que estão expostos, subsidiando a proposição de ações para a conservação e monitoramento desse ecossistema. Essas ações consideram a necessidade de preservação da biodiversidade, da manutenção da atividade pesqueira, da estabilidade da linha de costa, e da subsistência de diversas populações que habitam a região costeira. O mapeamento dos manguezais do Estado do Rio de Janeiro foi elaborado a partir da interpretação visual de ortofotografias coloridas do ano de 2005, na escala 1:10.000, tendo sido realizadas checagens de campo para identificação da verdade terrestre. Os remanescentes mapeados totalizam uma área de aproximadamente 17.720 ha, estando distribuídos por sete regiões hidrográficas localizadas na zona costeira fluminense. Esses ocorrem com mais freqüência, e com maiores dimensões, nas regiões da baía da Ilha Grande, Guandu(Sepetiba) e baía de Guanabara. O estudo contemplou ainda o levantamento e sistematização de dados cartográficos e de sensoriamento remoto, e a identificação e análise dos principais vetores de pressão que atuam sobre esses, a partir da adaptação da metodologia da Análise de Cadeia Causal. Nessa análise foram identificados como principais problemas ambientais dos manguezais fluminenses, a Modificação de habitats e comunidades, a Poluição, e a Exploração não sustentável dos recursos pesqueiros, todos associados aos diferentes vetores de pressão já relacionados. Por fim, foram apresentadas propostas de ações para subsidiar a implementação da Política Estadual para a Conservação dos Manguezais do Estado do Rio de Janeiro, contemplando os níveis operacional, de planejamento, e político. A reativação do Grupo Técnico Permanente sobre Manguezais é de vital importância para a retomada dessas discussões e para a implementação de ações, apoiado na ampliação dos conhecimentos sobre esse rico ecossistema e, integrando e fortalecendo a atuação dos diversos atores envolvidos, buscando assim garantir a integridade dos manguezais fluminenses

Modelos de agrupamento e classificação para os bairros da cidade do Rio de Janeiro sob a ótica da Inteligência Computacional: Lógica Fuzzy, Máquinas de Vetores Suporte e Algoritmos Genéticos

A partir de 2011, ocorreram e ainda ocorrerão eventos de grande repercussão para a cidade do Rio de Janeiro, como a conferência Rio+20 das Nações Unidas e eventos esportivos de grande importância mundial (Copa do Mundo de Futebol, Olimpíadas e Paraolimpíadas). Estes acontecimentos possibilitam a atração de recursos financeiros para a cidade, assim como a geração de empregos, melhorias de infraestrutura e valorização imobiliária, tanto territorial quanto predial. Ao optar por um imóvel residencial em determinado bairro, não se avalia apenas o imóvel, mas também as facilidades urbanas disponíveis na localidade. Neste contexto, foi possível definir uma interpretação qualitativa linguística inerente aos bairros da cidade do Rio de Janeiro, integrando-se três técnicas de Inteligência Computacional para a avaliação de benefícios: Lógica Fuzzy, Máquina de Vetores Suporte e Algoritmos Genéticos. A base de dados foi construída com informações da web e institutos governamentais, evidenciando o custo de imóveis residenciais, benefícios e fragilidades dos bairros da cidade. Implementou-se inicialmente a Lógica Fuzzy como um modelo não supervisionado de agrupamento através das Regras Elipsoidais pelo Princípio de Extensão com o uso da Distância de Mahalanobis, configurando-se de forma inferencial os grupos de designação linguística (Bom, Regular e Ruim) de acordo com doze características urbanas. A partir desta discriminação, foi tangível o uso da Máquina de Vetores Suporte integrado aos Algoritmos Genéticos como um método supervisionado, com o fim de buscar/selecionar o menor subconjunto das variáveis presentes no agrupamento que melhor classifique os bairros (Princípio da Parcimônia). A análise das taxas de erro possibilitou a escolha do melhor modelo de classificação com redução do espaço de variáveis, resultando em um subconjunto que contém informações sobre: IDH, quantidade de linhas de ônibus, instituições de ensino, valor m médio, espaços ao ar livre, locais de entretenimento e crimes. A modelagem que combinou as três técnicas de Inteligência Computacional hierarquizou os bairros do Rio de Janeiro com taxas de erros aceitáveis, colaborando na tomada de decisão para a compra e venda de imóveis residenciais. Quando se trata de transporte público na cidade em questão, foi possível perceber que a malha rodoviária ainda é a prioritária

Detecção de vírus transmitidos por ácaros Brevipalpus em seus vetores.

A importância dos ácaros do gênero Brevipalpus vem crescendo, tornando-se evidente seu potencial como praga de plantas, especialmente por sua capacidade de transmitir vírus (CHILDERS et al., 2003; KITAJIMA et al., 2010). Os vírus transmitidos por Brevipalpus sp. (VTBs) têm em comum, além do vetor, a morfologia das partículas e semelhanças em sintomas e efeitos citopatológicos que induzem nas plantas hospedeiras (KITAJIMA et al., 2003). Os sintomas nos hospedeiros consistem de lesões locais (cloróticas, necróticas, manchas verdes ou ainda manchas anelares) em folhas e ramos afetados (KITAJIMA et al., 2003). Ao contrário de outros vírus que invadem sistemicamente seus hospedeiros, as partículas dos VTBs permanecem concentradas nas lesões, não sendo capazes de circular nas plantas que infectam. A relação dos VTBs com seus vetores não é completamente conhecida. A otimização dos protocolos de extração de ácidos nucleicos e a possibilidade de se utilizar primers específicos não apenas para a sua detecção nos hospedeiros, mas também em seus vetores, são passos importantes para os estudos da interação vetor-patógeno-hospedeiro. Podem também ser úteis para o manejo de culturas com relação às doenças causadas pelos VTBs, como a mancha anular do cafeeiro, a leprose dos citros e a pinta verde do maracujazeiro, pois, em alguns casos, é possível a detecção precoce dos vírus nos ácaros antes mesmo do aparecimento dos sintomas no campo.

Bioecologia e controle de insetos vetores de patógenos na cultura do milho.

2003