Estratègies prèvies al sacrifici que poden afectar el benestar animal i la qualitat de la carn de porcs de diferent genotip RYRI

The main objective of this thesis was to study (i) the effect of the fasting and lairage on carcass and technological meat quality and (ii) the inclusion of magnesium (MgCO3 and MgSO4) and/or tryptophan during 5 days before slaughtering pigs as a strategy to decrease stress levels and improve meat quality, with two different porcine RYR1 genotypes (NN and nn). An adequate combination of fasting and lairage period is recommended. A supplement of MgCO3 or Trp did not improve meat quality under minimal stressful ante mortem conditions; and MgSO4 had a laxative effect on pigs supplemented with it. When including nn pigs to the herd, it is recommended to consider the supplements’ combination of tryptophan and a source of Mg (avoiding MgSO4) to alleviate the negative effect of the stress and to improve technological meat quality.

Síntesi, caracterització química i estudi de l'activitat biològica de nous complexos de Pt(II) amb lligands de tipus diaminocarboxílic i els respectius ésters i derivats peptídics

El cisplatí, PtCl2(NH3)2, ha estat una de les drogues més utilitzades en la quimioteràpia del càncer des del descobriment de la seva activitat. Però degut a la seva alta toxicitat i greus efectes secundaris, s'han sintetitzat nous compostos amb la finalitat de reduir aquests inconvenients. En aquest sentit, el treball desenvolupat en aquesta tesi doctoral ha estat la síntesi i caracterització de tretze complexos de Pt(II) amb la finalitat d'estudiar llur activitat antitumoral. Aquests complexos presenten unes característiques estructurals comunes: geometria cis, dos lligands làbils de tipus clorur i un lligand diaminoquelatant derivat dels àcids d,l-2,3-diaminopropiònic (Hdap) i d,l-2,4-diaminobutíric (Hdab). S'han dissenyat unes estratègies sintètiques a partir de les quals els lligands han estat funcionalitzats amb diferents grups de tipus éster, aminoàcid i peptídic: Etdap·2HCl, Etdab·2HCl, [(dap-Metala)·2CF3COOH], [(dab-Metala)·2CF3COOH], [(dap-phe)·2CF3COOH], [(dab-phe)·2CF3COOH], [(dap-Mettrp)·2CF3COOH], [(dab-Mettrp)·2CF3COOH], [(dap-ASTTTNYT-NH2)·2CF3COOH], essent Metala= éster metílic de L-alanina, phe= L-fenilalanina, Mettrp= éster metílic del L-triptofà. Aquests lligands diaminoquelatants s'han utilitzat per sintetitzar els corresponents complexos de Pt(II): PtCl2(Hdap), PtCl2(Hdab), PtCl2(Etdap), PtCl2(Etdab), PtCl2(dap-Metala), PtCl2(dab-Metala), PtCl2(dap-ala), PtCl2(dab-ala), PtCl2(dap-phe), PtCl2(dab-phe), PtCl2(dap-Mettrp), PtCl2(dab-Mettrp), PtCl2(dap-ASTTTNYT-NH2). A través de diferents tècniques i assaigs biològics (dicroisme circular, electroforesi en gel d'agarosa, microscopia de forces atòmiques, citometria de flux, assaigs de proliferació cel·lular) s'ha pogut demostrar l'activitat antitumoral d'aquests compostos. A través de la tècnica de dicroisme circular (DC) s'ha pogut demostrar que els lligands lliures no interaccionen covalentment amb el DNA de Calf Thymus i no modifiquen l'estructura secundària de la doble hèlix. En canvi, els respectius complexos han demostrat tenir capacitat per interaccionar amb el DNA i modificar la seva estructura secundària. Els complexos PtCl2(Hdap), PtCl2(Hdab) i PtCl2(dab-phe) mostren un comportament similar al cisplatí, generant adductes cis-bifuncionals que distorcionen la doble hèlix de forma no desnaturalitzant amb obertura de la doble cadena. Els complexos PtCl2(Etdap), PtCl2(Etdab), PtCl2(dap-ala), PtCl2(dab-ala), PtCl2(dap-Metala), PtCl2(dab-Metala), PtCl2(dap-phe), PtCl2(dap-ASTTTNYT-NH2) quan interaccionen amb el DNA generen un canvi en la conformació del DNA de la forma B a la forma C, produint-se un augment de la curvatura de l'hèlix per rotació de les bases nitrogenades. En aquests estudis s'ha comprovat que l'estructura del complex influeix en l'efecte generat sobre l'estructura secundària de l'àcid nucleic. En primer lloc, existeix una diferència en el comportament en funció del tamany del lligand diaminoquelatant, de manera que els complexos amb el lligand (dab) provoquen un efecte més remarcable. També s'observa aquest canvi de comportament al passar dels complexos que tenen el grup funcional esterificat als que el tenen protonat. D'aquesta manera, s'observa un major efecte sobre l'estructura secundària del DNA en aquells complexos que tenen el lligand diaminoquelatant de tres metilens (dab) i amb el grup carboxilat terminal protonat. Per tal de modelitzar la interacció d'aquests complexos amb el DNA, s'ha estudiat la interacció d'aquests compostos de Pt(II) amb 5'-GMP a través de RMN-1H, observant la variació dels senyals corresponents al H8 de 5'-GMP. Així s'ha pogut demostrar que aquests compostos interaccionen amb la 5'-GMP a través d'un enllaç covalent Pt-N7, de la mateixa manera a com interacciona el cisplatí. A través d'electroforesi en gel d'agarosa i microscopia de forces atòmiques (AFM) s'ha pogut determinar l'efecte que generen els lligands lliures i els respectius complexos de Pt(II) sobre l'estructura terciària del plasmidi pBR322. Els lligands provoquen un augment de l'agregació de les molècules de DNA i un lleuger augment de la compactació de l'estructura terciària. Aquests resultats s'atribueixen a la capacitat d'aquests compostos a interaccionar per pont d'hidrogen amb el DNA. Els corresponents complexos de Pt(II) provoquen un augment de l'agregació i una important compactació, degut per una banda a la capacitat de l'àtom de Pt a interaccionar covalentment amb el DNA, i per altra banda, a la capacitat del lligand a interaccionar per pont d'hidrogen amb l'àcid nucleic. Finalment s'ha estudiat l'activitat citotòxica d'aquests complexos de Pt(II) en diferents línies cel·lulars: A431 (línia de carcinoma epidermoide), HeLa (línia de carcinoma de coll d'úter) i HL-60 (línia promielocítica de leucèmia). Els complexos moderadament solubles en aigua, PtCl2(Hdap), PtCl2(Hdab), PtCl2(dap-ala), PtCl2(dab-ala), PtCl2(dap-phe) i PtCl2(dab-phe), han demostrat ser actius. L'activitat depèn de la concentració de complex, del temps d'incubació i de la línia cel·lular. Per temps d'incubació alts i concentracions de complex elevades s'observa la màxima activitat. Els complexos de l'alanina, PtCl2(dap-ala) i PtCl2(dab-ala), són els que mostren més activitat, mentre que els compostos de la fenilalanina són els menys actius, degut probablement a la voluminositat del lligand, la qual pot impedir o dificultar el transport del compost a través de la membrana cel·lular. L'activitat citotòxica dels complexos insolubles en aigua, PtCl2(Etdap) i PtCl2(Etdab), queda bloquejada per l'elevada concentració de DMSO (12%) necessària per solubilitzar els compostos. Aquests resultats permeten deduir que la presència d'un 12% de DMSO anul·la l'activitat d'aquests complexos, ja que el DMSO pot coordinar-se amb el Pt ocupant les posicions làbils del complex i evitant que es pugui coordinar amb el DNA. Els assaigs de proliferació cel·lular del complex PtCl2(dap-ASTTTNYT-NH2) i del pèptid lliure ASTTTNYT-NH2 han demostrat que ambdós compostos són actius. Tot i això, l'activitat del complex és superior a la del pèptid lliure, ja que el Pt pot interaccionar covalentment amb el DNA i augmentar l'efecte citotòxic. Per tant, el complex presenta un lligand portador biològicament actiu que pot transportar el metall a través de la membrana cel·lular i facilitar així la seva interacció amb el DNA. A través de la tècnica de citometria de flux s'ha comprovat que en tots els casos la mort cel·lular produïda pels complexos ha estat per apoptosi. Per últim, s'ha sintetitzat i caracteritzat un complex trinuclear de Pt(II), {[Pt(Me2Bpy)2][PtCl2(Me2Bpy)]2}, essent Me2Bpy= 4,4'-dimetil-2,2'-dipiridil. La resolució de la seva estructura per difracció de Raig-X ha permès determinar l'existència d'una interacció intramolecular Pt-Pt de 3.474 Å.

Identificación y caracterización de la ruta mediada por la proteína G heterotrimérica de Arabidopsis thaliana en la respuesta inmune

La resistencia de las plantas a los hongos necrótrofos como Plectosphaerella cucumerina es genéticamente compleja y depende de la activación coordinada de distintas rutas de señalización (Llorente et al, 2005; Sanchez-Vallet et al, 2010). Entre éstas se encuentran las mediadas por la proteína G heterotrimérica, un complejo formado por tres subunidades (Gα, Gβ y Gγ) que regula tanto la respuesta de inmunidad a diferentes patógenos como distintos procesos de desarrollo (Temple and Jones, 2007). En esta Tesis hemos demostrado que, en Arabidopsis, el monómero funcional formado por las subunidades Gβ y Gγ1/Gγ2 es el responsable de la regulación de la respuesta de defensa, ya que mutantes nulos en estas subunidades (agb1 y agg1 agg2) presentan una alta susceptibilidad al hongo P. cucumerina. Además, hemos identificado varios aminoácidos (Q102, T188 y R235) de la proteína AGB1 esenciales en la interacción con los efectores correspondientes para la regulación de la respuesta inmune (Jiang et al, enviado). Para determinar las bases moleculares de la resistencia mediada por la proteína G heterotrimérica, llevamos a cabo un análisis transcriptómico comparativo entre los genotipos agb1 y Col-0, el cual reveló que la resistencia mediada por AGB1 no depende de rutas defensivas implicadas en la resistencia a hongos necrotrofos, como las mediadas por el ácido salicílico (SA), etileno (ET), jasmónico (JA) o ácido abscísico (ABA), o la ruta de biosíntesis de metabolitos derivados del triptófano. Este estudio mostró que un número significativo de los genes desregulados en respuesta a P. cucumerina en el genotipo agb1 respecto a las plantas silvestres codificaban proteínas con funciones relacionadas con la pared celular. La evaluación de la composición y estructura de la pared de los mutantes de las subunidades de la proteína G heterotrimérica reveló que los genotipos agb1 y agg1 agg2 presentaban alteraciones similares diferentes de las observadas en plantas silvestres Col-0, como una reducción significativa en el contenido de xilosa en la pared. Estos datos sugieren que la proteína G heterotrimérica puede modular la composición/estructura de la pared celular y contribuir, de esta manera, en la regulación de la respuesta inmune (Delgado- Cerezo et al, 2011). La caracterización del interactoma de la proteína G heterotrimérica corroboró la relevancia funcional que presenta en la regulación de la pared celular, ya que un número significativo de las interacciones identificadas estaban comprendidas por proteínas relacionadas directa o indirectamente con la biogénesis y remodelación de la pared celular (Klopffleisch et al, 2011). El papel en inmunidad de algunos de estos potenciales efectores ha sido validado mediante el análisis de la resistencia a P. cucumerina de los mutantes de pérdida de función correspondientes. Con el objetivo de caracterizar las rutas de señalización mediadas por AGB1 e identificar efectores implicados en esta señalización, llevamos a cabo una búsqueda de mutantes supresores de la susceptibilidad de agb1 a P. cucumerina, identificándose varios mutantes sgb (supressor of Gbeta). En esta Tesis hemos caracterizado en detalle el mutante sgb10, que presenta una activación constitutiva de las rutas de señalización mediadas por SA y JA+ET y suprime el fenotipo de susceptibilidad de agb1. SGB10 y AGB1 forman parte de rutas independientes en la regulación de la respuesta inmune, mientras que interaccionan de forma compleja en el control de determinados procesos de desarrollo. La mutación sgb10 ha sido cartografiada entre los genes At3g55010 y At3g56408, que incluye una región con 160 genes. ABSTRACT Plant resistance to necrotrophic fungi Plectosphaerella cucumerina is genetically complex and depends on the interplay of different signalling pathways (Llorente et al, 2005; Sanchez-Vallet et al, 2010). Among others, the heterotrimeric G protein complex has a relevant role. The G protein that is formed by three subunits (Gα, Gβ and Gγ) is a pleiotropic regulator of immune responses to different types of pathogens and developmental issues (Temple and Jones, 2007). Throughout the Thesis, we have demonstrated that Arabidopsis’ functional monomer formed by the Gβ and Gγ1/Gγ2 subunits is a key regulator of defense response, as null mutants (agb1 and agg1 agg2) are equally hypersusceptible to P. cucumerina infection. In addition we have identified several AGB1 aminoacids (Q102, T188 y R235) essentials to interact with specific effectors during the regulation of immune response (Jiang et al, sent).To determine the molecular basis of heterotrimeric G protein mediated resistance we have performed a microarray analysis with agb1-1 and wild type Col-0 plants before and after P. cucumerina challenge. A deep and exhaustive comparative transcriptomical analysis of these plants revealed that AGB1 mediated resistance does not rely on salicilic acid (SA), ethylene (ET), jasmonates (JA), abscisic acid (ABA) or triptophan derived metabolites biosynthesis. However the analysis revealed that a significant number of cell wall related genes are misregulated in the agb1 mutant after pathogen challenge when compared to wild-type plants. The analysis of cell wall composition and structure showed similar cell wall alterations between agb1 and agg1 agg2 mutants that are different from those of wild-type plants, so far the mutants present a significant reduction in xylose levels. All these results suggest that heterotrimeric G protein may regulate immune response through modifications in the cell wall composition/structure (Delgado-Cerezo et al, 2011). The characterization of Heterotrimeric G protein interactome revealed highly connected interactions between the G-protein core and proteins involved in cell wall composition or structure (Klopffleisch et al, 2011). To test the role in immunity of several effectors identified above, we have performed resistance analysis of corresponding null mutants against P. cucumerina. In order to characterize AGB1 mediated signalling pathway and identify additional effectors involved in AGB1-mediated immune response against P. cucumerina, we have performed a screening to isolate mutants with suppression of agb1 phenotype. One of the mutants, named sgb10, has been characterized during the Thesis. The mutant shows constitutive expression of SA, JA+ET-mediated defense signaling pathways to suppres agb1 hypersusceptibility. SGB10 and AGB1 proteins seem to be part of independent pathways in immunity, however its function during development remains unclear. At present, we have mapped the sgb10 mutation between At3g55010 and At3g56408 genes. This region contains 160 genes.