Caracterización molecular del mutante riso 1508 de cebada : modificaciones transcripcionales y posttranscripcionales en el desarrollo de la semilla

La semilla es el principal órgano reproductivo de las plantas espermatofitas, permitiendo la dispersión de las poblaciones y asegurando su supervivencia gracias a su tolerancia a la desecación y a su capacidad para germinar bajo condiciones ambientales óptimas. El rendimiento y valor económico de los cereales, que constituyen la primera cosecha mundial, depende, en buena medida, de la eficacia con que se acumulan en la semilla sustancias de reserva: proteínas, carbohidratos y lípidos. El principal carbohidrato acumulado en la semilla de cebada es el almidón y la fracción mayoritaria de proteínas es la de las prolaminas (solubles en etanol al 70%); estas proteínas tienen muy bajo contenido en lisina, un aminoácido esencial en la dieta de animales monogástricos. Con el fin de mejorar el valor nutricional de la semilla de cebada, se han obtenido diferentes mutantes con un mayor contenido en este aminoácido. Riso 1508 es un mutante de cebada rico en lisina cuya mutación lys3a, de efectos pleiotrópicos, segrega como un único gen mendeliano. Entre otros, presenta una reducción drástica de la expresión de algunos genes que codifican proteínas de reserva de tipo prolamina, en concreto, presenta reducida la expresión de los genes que codifican B-, C- y ϒ-Hordeínas y del inhibidor de tripsina CMe, pero no tiene alterada la expresión del gen que codifica las D-Hordeínas. Este último gen carece en su promotor del motivo GLM (5’‐(G/A)TGA(G/C)TCA(T/C)‐3’), que es reconocido por factores transcripcionales bZIP. En este trabajo, el mutante de cebada Riso 1508 se ha utilizado como herramienta para profundizar en el conocimiento de la regulación génica en semillas durante las fases de la maduración y la germinación. Para ello, en una primera aproximación, se llevó a cabo un análisis transcriptómico comparando el genotipo mutante con el silvestre durante la maduración de la semilla. Además de confirmar variaciones en los genes que codifican proteínas de reserva, este análisis indicó que también estaban afectados los genes relacionados con metabolismo de carbohidratos. Por ello se decidió caracterizar la familia multigénica de sacarosas sintasa (SUSy) en cebada. Se anotaron dos nuevos genes, HvSs3 y HvSs4, cuya expresión se comparó con la de los genes HvSs1 y HvSs2, previamente descritos en el laboratorio. La expresión de los cuatro genes en tejidos diferentes y su respuesta a estreses abióticos se analizó mediante RT-qPCR. HvSs1 y HvSs2 se expresaron preferencialmente durante el desarrollo del endospermo, y HvSs1 también fue un tránscrito abundante durante la germinación. HvSs1 se indujo en hojas en condiciones de anoxia y HvSs3 por estrés hídrico, y ambos genes se indujeron por tratamientos de frío. La localización subcelular de las cuatro isoformas no fue sólo citoplásmica, sino que también se localizaron en zonas próximas a retículo endoplásmico y en la cara interna de la membrana plasmática; además, se observó una co-localización de HvSS1 con el marcador de mitocondrias. Estos datos sugieren un papel distinto aunque parcialmente solapante de las cuatro Sacarosa Sintasas de cebada, descritas hasta la fecha. Las cinéticas de expresión de los genes que codifican los TFs más importantes implicados en la regulación génica durante el desarrollo del endospermo de cebada, se analizaron por RT-qPCR en ambos genotipos, demostrando que los TFs de la clase DOF aparecieron desregulados durante todo el proceso en Riso 1508 comparado con el cv. Bomi, aunque también se observaron diferencias significativas en algunos de los que codifican bZIPs. Estudios previos indicaban que el ortólogo de BLZ2 en maíz, O2, se regula post-traduccionalmente mediante un mecanismo de fosforilación/defosforilación reversible, y que la forma defosforilada es la fisiológicamente activa. En este trabajo se demostró que BLZ2 está sujeto a este tipo de regulación y que la proteín-fosfatasa HvPP2C2 está implicada en el proceso. La interacción de HvPP2C2 y BLZ2 tiene lugar en el núcleo celular únicamente en presencia de 100 μM ABA. En el mutante Riso 1508, BLZ2 se encuentra en un estado hiperfosforilado tanto durante la maduración como durante la germinación de la semilla, lo que dificultaría la unión de BLZ2 a las secuencias GLM en los promotores de los genes que codifican B-, C-,y ϒ- Hordeínas y CMe. Summary The seed is the main reproductive organ of spermatophyte plants allowing the spread of populations and ensuring their survival through its desiccation tolerance and because of their ability to germinate under optimum environmental conditions. Yield and economic value of cereal crops, that constitute the first world crop, depend largely on the efficiency with which they accumulate in the seed reserve substances: proteins, carbohydrates and lipids. The main carbohydrate accumulated in the barley seed is starch and the major protein fraction is that of prolamins (soluble in 70% ethanol); these proteins have a very low lysine content, an essential amino-acid for the diet of monogastric animals. In order to improve the nutritional value of the barley seed, different mutants have been obtained with a higher content of this amino-acid. Riso 1508 is one lysine-rich mutant whose mutation (lys3a) segregates as a single Mendelian gene with pleiotropic effects, such as a drastic reduction of genes encoding the trypsin inhibitor CMe and the B-, C-and ϒ-hordeins, but has not altered the expression of the gene encoding the D-hordeins. This latter gene lacks in its promotor the GLM motif (5’‐(G/A)TGA(G/C)TCA(T/C)‐3’), that is recognised by bZIP transcription factors In this work we have used the barley mutant Riso 1508 as a tool for better understanding gene regulation in seeds during the maturation and germination phases. To this aim, a transcriptomic analysis was performed comparing wild and mutant genotypes during seed maturation. Besides confirming variations in the expression of genes encoding reserve proteins, this analysis indicated that some genes related with carbohydrate metabolism were also affected. It was therefore decided to characterize the multigene family of sucrose synthases (SUSy) in barley. Two new genes were annotated, HvSs3 and HvSs4, and its expression was compared with that of genes HvSs1 and HvSs2, previously described in our laboratory. The expression of the four genes in different tissues and in response to abiotic stresses was analyzed by RTqPCR. HvSs1 and HvSs2 were preferentially expressed during the development of the endosperm, and the HvSs1 transcript was also abundant upon germination. HvSs1 was induced in leaves by anoxic conditions, HvSs3 by water stress, and both genes were induced by cold treatments. The subcellular localization of all four isoforms was not only cytoplasmic, but they could be found along the endoplasmic reticulum and at the inner side of the cell membrane; HvSS1, was also associated with the mitochondrial marker. These data suggest a distinct but partially overlapping roles for the barley sucrose synthases, described so far. The expression kinetics of the genes encoding the most important TFs involved in gene regulation during barley endosperm development was analyzed by RT-qPCR in both genotypes. These data show that the genes encoding DOF TFs were mis-regulated throughout the process in Riso 1508, although significant differences were also found among some of those encoding bZIPs. Previous studies indicated that the BLZ2 orthologue in maize, O2, was post-translationally regulated by reversible phosphorylation/dephosphorylation and that the dephosphorylated protein is the physiologically active form. In this work we demostrate that BLZ2 is under a similar regulation and that the proteinphosphatase HvPP2C2 is implicated in the process. The interaction between HvPP2C2 and BLZ2 takes place in the cell nucleus only in the presence of 100 μM ABA. In the Riso 1508 mutant, BLZ2 is found in a hyperphosphorylated state in the maturation phase and upon seed germination; because of this, the BLZ2 binding to the GLM promoter sequences of genes encoding B-, C- y ϒ- Hordeins and CMe would be decreased in the mutant.

Efecto sobre el rendimiento productivo y calidad de la canal de la inclusión de guisantes (Pisum sativum) y alberjón (Vicia narbonensis) en el pienso de lechones y cerdos de cebo

Las leguminosas grano presentan un perfil nutricional de gran interés para alimentación de ganado porcino, debido principalmente a su elevado contenido proteico. Sin embargo, la presencia de factores antinutritivos (FAN), que según el género difieren en calidad y cantidad, condiciona la absorción de la proteína, el nutriente más valorado. El objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido el estudio del efecto de los principales FAN de guisante y alberjón sobre el rendimiento productivo, de canal y de piezas nobles, cuando sustituyen a la soja, parcial o totalmente, durante la fase estárter y el periodo de engorde de cerdos grasos. Con este motivo se llevaron a cabo 4 ensayos con machos castrados y la misma línea genética: híbrido Duroc x (Landrace x Large white). En el ensayo 1, se estudió la influencia de distintos niveles de inhibidores de proteasas (IP) en el pienso sobre la productividad de lechones durante la fase estárter (40 a 61 días de edad). Para ello, se utilizaron tres variedades de guisantes de invierno que contenían diferentes cantidades de IP, tanto de tripsina (IT) como de quimotripsina (IQ) [unidades de tripsina inhibida/mg (UTI), unidades de quimotripsina inhibida/mg (UQI): 9,87- 10,16, 5,75-8,62 y 12,55-15,75, para guisantes Cartouche, Iceberg y Luna, respectivamente] más elevadas que en la harina de soja 47 (HnaS) y en la soja extrusionada (SE) (UTI/mg - UQI/mg: 0,61-3,56 y 2,36-4,65, para HnaS y SE, respectivamente). El diseño experimental fue al azar, con cuatro tratamientos dietéticos que diferían en las fuentes proteicas y en la cantidad de IP, enfrentando un pienso control de soja a otros tres piensos con guisantes de invierno de las variedades indicadas, que sustituían parcialmente a la soja. Cada tratamiento se replicó cuatro veces, siendo la celda con 6 lechones la unidad experimental. Los animales que consumieron el pienso con guisante Cartouche tuvieron más ganancia media diaria (GMD) que el resto (P < 0,001) con el mismo consumo medio diario (CMD) e índice de conversión (IC). No hubo diferencias significativas entre los animales del pienso control y los que consumieron piensos con guisantes Iceberg y Luna. En el ensayo 2 la leguminosa objeto de estudio fue el alberjón y su FAN el dipéptido _Glutamyl-S-Ethenyl-Cysteine (GEC). El diseño y el periodo experimental fueron los mismos que en el ensayo 1, con cuatro dietas que variaban en el porcentaje de alberjones: 0%, 5%, 15% y 25%, y de GEC (1,54% del grano). Los lechones que consumieron el pienso con 5% tuvieron un CMD y GMD más elevado (P < 0,001), con el mismo IC que los animales pertenecientes al tratamiento 0%. Los índices productivos empeoraron significativamente y de manera progresiva al aumentar el porcentaje de alberjones (15 y 25%). Se obtuvieron ecuaciones de regresión con estructura polinomial que fueron significativas tanto para el nivel de alberjón como para la cantidad de GEC presente en el pienso. El ensayo 3 se efectuó durante el periodo de engorde, sustituyendo por completo la soja a partir de los 84 días de edad con las tres variedades de guisantes de invierno, observando el efecto sobre el rendimiento productivo, de canal y piezas nobles. El diseño, en bloques completos al azar, tuvo cuatro tratamientos según el guisante presente en el pienso y, por lo tanto, los niveles de IP: Control-soja, Cartouche, Iceberg y Luna, con 12 réplicas de 4 cerdos por tratamiento. De 84 a 108 días de edad los animales que consumieron los piensos Control-soja e Iceberg, tuvieron el mismo CMD y GMD, empeorando en los cerdos alimentados con Luna y Cartouche (P < 0,05). El IC fue igual en los tratamientos Control-soja e Iceberg, ocupando una posición intermedia en Cartouche y peor en los cerdos del pienso Luna (P < 0,001). De 109 a 127 días de edad la GMD y el IC fueron iguales, con un CMD más elevado en Control-soja e Iceberg que en los cerdos que consumieron Cartouche y Luna (P < 0,05). No hubo diferencias significativas durante el acabado (128 a 167 días de edad). Globalmente el CMD y GMD fueron más elevados en los cerdos que comieron los piensos Iceberg y Control-soja, empeorando por igual en los que comieron Cartouche y Luna (P < 0,05); el IC fue el mismo en todos los tratamientos. No se observaron diferencias en los datos relacionados con peso y rendimiento de canal y piezas nobles (jamón, paleta y chuletero), ni del contenido de grasa intramuscular en el lomo y proporción de ácidos grasos principales (C16:0, C18:0, C18:1n-9) en la grasa subcutánea. En el ensayo 4, realizado durante el periodo de engorde (60 a 171 días de edad), se valoró el efecto de dietas con distintos niveles de alberjones, y en consecuencia de su factor antinutritivo el dipéptido GEC, sobre el rendimiento productivo y la calidad de la canal y piezas nobles. El diseño fue en cuatro bloques completos al azar, con cuatro tratamientos según el porcentaje de inclusión de alberjón en el pienso: 0%, 5%, 15% y 25%, con 12 réplicas por tratamiento y cuatro cerdos en cada una de ellas. El tratamiento con 5% mejoró la GMD al final de la fase de cebo (152 días de vida) y, junto con el 0%, presentaron los resultados más favorables de peso e IC al final del ensayo (171 días de vida). Del mismo modo, el peso y rendimiento de canal fueron más elevados en los cerdos alimentados con los tratamientos 0% y 5% (P < 0,001). Piensos con el 15 y 25% de alberjones empeoraron los resultados productivos, así como el rendimiento y peso de canal. Sucedió lo mismo con el peso de las piezas nobles (jamón, paleta y chuletero), significativamente superior en 0% y 5% frente a 15% y 25%, siendo los cerdos que consumieron este último pienso los peores. Por el contrario el rendimiento de jamón y chuletero fue más elevado en los cerdos de los tratamientos 25% y 15% que en los que consumieron los piensos con 5% y 0% (P < 0,001); en el rendimiento de paletas se invirtieron los resultados, siendo mayores en los animales de los tratamientos 0% y 5% (P < 0,001). Se obtuvieron ecuaciones de regresión polinomial, para estimar las cantidades de inclusión de alberjones y de GEC más favorables desde el punto de vista productivo, así como los contrastes ortogonales entre los distintos tratamientos. ABSTRACT The grain legumes have a nutritional profile of great interest to feed pigs, mainly due to high protein content. However, the presence of antinutritional factors (ANF), which differ in quality and quantity according to gender, hinder the absorption of the protein, the most valuable nutrient. The aim of this thesis was to study the effect of the main ANF of pea and narbon vetch (NV) on productive performance, of the carcass and main lean cuts, when replacing soybean, partially or totally, during the starter phase and the fattening period of heavy pigs. For this reason were carried four trials with barrows and the same genetic line: Duroc hybrid x (Landrace x Large white). In trial 1, was studied the influence of different levels of protease inhibitors (PI) in the diet over productivity of piglets during the starter phase (40-61 days of age). For this, were used three varieties of winter peas containing different amounts of PI, both trypsin (TI) and chymotrypsin (CI) [inhibited units/mg trypsin (TIU), inhibited units/mg chymotrypsin (CIU): 9.87 - 10.16, 5.75 - 8.62 and 12.55 - 15.75, for peas Cartouche, Iceberg and Luna, respectively] higher than in soybean meal 47 (SBM) and soybeans extruded (SBE) (TIU/mg - CIU/mg: 0.61 - 3.56 and 2.36 - 4.65 for SBM and SBE, respectively). The design was randomized with four dietary treatments differing in protein sources and the amount of PI, with a control diet of soybean and three with different varieties of winter peas: Cartouche, Iceberg and Luna, which partially replace soybean. Each treatment was replicated four times, being the pen with 6 piglets the experimental unit. Pigs that ate the feed with pea Cartouche had better growth (ADG) than the rest (P < 0.001), with the same average daily feed intake (ADFI) and feed conversion ratio (FCR). There were no significant differences between piglets fed with control diet and those fed Iceberg and Luna diets. In trial 2 the legume under study was the NV and your ANF the dipeptide _Glutamyl FAN-S-Ethenyl-Cysteine (GEC). The experimental period and the design were the same as in trial 1, with four diets with different percentage of NV: 0%, 5%, 15% and 25%, and from GEC (1.52% of the grain). The piglets that consumed the feed containing 5% had higher ADG and ADFI (P < 0.05), with the same FCR that pigs belonging to the 0% treatment. Production rates worsened progressively with increasing percentage of NV (15 and 25%). Were obtained regression equations with polynomial structure that were significant for NV percentage and amount of GEC present in the feed. The test 3 was carried out during the fattening period, completely replace soy from 84 days of age with three varieties of winter peas, observing the effect on the yield, carcass and main lean cuts. The design, randomized complete blocks, had four treatments with different levels of PI: Control-soy, Cartouche, Iceberg and Luna, with 12 replicates of 4 pigs per treatment. From 84 to 108 days of age the pigs fed with Control-soy and Iceberg feed, had the same ADFI and ADG, worsening in pigs fed with Luna and Cartouche (P < 0.05). The FCR was similar in diets Control-soy and Iceberg, occupying an intermediate position in Cartouche and worse in pigs fed with Luna (P < 0.001). From 109-127 days of age the ADG and FCR were equal, with higher ADFI in pigs fed with Control-soy and Iceberg, regarding pigs fed with Cartouche and Luna (P < 0.05). There was no difference in the finishing phase (128-167 days of age). In global period, the ADFI and ADG were higher in pigs that ate Control-soy and Iceberg, and worse in those who ate Cartouche and Luna. The FCR was the same in all treatments. No significant differences were observed in the data related to weight and carcass yield, main lean cuts (ham, shoulder and loin chop) and intramuscular fat loin content and major fatty acids proportion (C16:0, C18:0, C18:1n-9) of subcutaneous fat. In experiment 4, made during the fattening period (60-171 days of age), was assessed the effect of diets with different levels of NV, and consequently of GEC, in the performance and quality of carcass and main lean cuts. There was a completely randomized design with four dietary treatments differing in percentage of NV: 0%, 5%, 15% and 25%, with 12 replicates per treatment and four pigs each. Treatment with 5% improved the ADG at the end of the fattening phase (152 days of age) and, together with 0%, showed the most favorable body weight and FCR at the end of the trial (171 days of age). Similarly, the weight and performance of carcass were higher for pigs fed with diets 0% and 5% (P < 0.05). Diets with 15 and 25% worsened the productive and carcass results. The weight of the main lean cuts (ham, shoulder and loin chop) was significantly higher in 0% and 5% vs 15% and 25%.The diet 25% was the worst of all. By contrast the performance of ham and loin chop was higher in pigs fed with diets 25% and 15%, that those who ate diets with 5% and 0% (P < 0.001); the results of shoulder performance were reversed, being greater in pigs feed with diets 0% and 5% (P < 0.001). Polynomial regression equations were obtained to estimate the percentage of NV and GEC more favorable from the point of view of production, and orthogonal contrasts between treatments.

Produção e caracterização de biomateriais acelulares bioativos obtidos a partir da decelularização de placentas

A bioengenharia de tecidos baseia-se no uso de moléculas bioativas, células-tronco e biomateriais para reparação de tecidos e/ou órgãos. Biomateriais podem ser classificados de acordo com sua origem em sintéticos ou biológicos. Biomateriais biológicos podem ser produzidos por decelularização, que visa a remoção de células da matriz extracelular (MEC), a qual deve manter sua integridade química e física. Placentas são órgãos de grande interesse na bioengenharia de tecidos visto que são descartadas após o parto e possuem grande volume de matriz extracelular. Métodos de decelularização podem ser classificados em químicos, físicos e enzimáticos. Todos conhecidamente causam alterações na MEC, sendo que a associação deles é comumente utilizada. Este trabalho comparou diferentes protocolos e estabeleceu um método mais favorável para a decelularização de placentas caninas, visando a produção de um biomaterial para futuras aplicações clínicas. Inicialmente ambas as porções - materna e fetal - das placentas foram submetidas à 10 protocolos, que avaliaram variáveis como concentração e tempo de incubação em detergentes, diferentes gradientes de temperatura e a influência da perfusão versus imersão das soluções, na MEC remanescente. Com base na transparência do tecido e na ausência de núcleo celular em cortes histológicos, dois protocolos foram selecionados (I e II). Além dos critérios já mencionados, ambos os protocolos foram comparados quanto à quantidade de DNA remanescente na MEC decelularizada e à permanência e distribuição de algumas das proteínas da matriz. O detergente SDS foi o mais eficaz na remoção de células, embora não tenha sido suficiente para promover uma decelularização tecidual completa. O congelamento prévio das placentas requereu um maior tempo de incubação posterior das amostras nos distintos detergentes. Ambos métodos de perfusão e imersão foram eficazes na remoção das células, embora grande concentração de proteínas do citoesqueleto tenham permanecido retidas na matriz. As amostras processadas pelo protocolo I (SDS 1%, 5mM EDTA + 50mM TRIS + 0,5% antibiótico, e Triton X-100 1%) apresentaram maior preservação da organização estrutural da MEC quando comparadas àquelas processadas de acordo com o protocolo II (que diferiu do anterior pela utilização de solução contendo 0,05% tripsina ao invés de 50mM TRIS), esse último método entretanto foi o que melhor removeu as células das placentas, conforme observado em lâminas histológicas e demonstrado pela menor concentração de DNA. Tanto as porções materna quanto fetal submetidas à ambos protocolos, mantiveram as proteínas laminina, fibronectina e colágeno tipo I. O colágeno tipo III foi observado somente na porção fetal. Conclui-se que o protocolo II foi o mais eficaz no processo de decelularização de placentas caninas tendo promovido a remoção do conteúdo celular e diminuição da concentração de DNA na MEC remanescente. No entanto é necessário otimizar o tempo de incubação das placentas em soluções enzimáticas visando maior conservação do arranjo da matriz decelularizada. A análise da capacidade da MEC decelularizada por tal método para ser utilizada em bioengenharia de tecidos ainda deve ser avaliada in vitro e in vivo

Efeito do inibidor de proteinase de origem vegetal EcTI, sobre a inflamação pulmonar alérgica crônica em camundongos Balb/c

INTRODUÇÃO: A prevalência de asma tem crescido e a maioria dos pacientes com asma grave não obtém o controle total dos sintomas com as terapias disponíveis, fazendo-se necessária a busca por novas alternativas terapêuticas. Inibidores de proteinases têm sido estudados como tratamento de processos inflamatórios, dentre eles o Enterolobium contortisiliquum Tripsin Inhibitor (EcTI) OBJETIVO: Avaliar se o inibidor de proteinase EcTI modula a hiperresponsividade brônquica à metacolina, inflamação, remodelamento e estresse oxidativo nas vias aéreas e septos alveolares em um modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica crônica. MÉTODOS: Vinte e quatro camundongos Balb/c machos, entre seis e sete semanas de vida, pesando em media 25 g foram divididos em quatro grupos: C (controle), OVA (sensibilizados com ovalbumina, 50 ug intraperironeal (i.p) nos dias 0 e 14 e desafiados nos dias 22, 24, 26, 28); C+EC (controle tratados com EcTI (2 mg/kg/i.p) nos dias 22 a 28); OVA+EC (sensibilizados e desafiados com ovalbumina e também tratados com EcTI (2 mg/kg -i.p) nos dias 22 a 28). No dia 29, foram realizadas realizadas: (i) hiperresponsividade à metacolina e obtidas as respostas máximas de resistência e elastância do sistema respiratório; (ii) análise histopatológica do pulmão para quantificação de eosinófilos, fibras colágenas e elásticas nas vias aéreas (VA) e nos septos alveolares (SA); e (iii) imunohistoquímica para quantificação de células positivas para IFN-y, IL-4, IL-5, IL-13, MMP-9, TIMP-1, TGF-beta, iNOS, NF-kB e fração de volume de isoprostano nas VA e nos SA. Uma semana após o dia 29 foi realizada a técnica de anafilaxia cutanea passiva(PCA) para quantificar IgE e IgG1. A significância foi considerada quando p < 0,05. RESULTADOS: Houve aumento de todos os parâmetros avaliados no grupo OVA em relação ao grupo controle (p < 0,05). Houve atenuação da resposta máxima de Rrs e Ers no grupo OVA+EC comparado as grupo OVA (p < 0,05). O tratamento com EcTI nos animais sensibilizados atenuou o número de eosinófilos, células positivas para IL-4, IL-5, IL-13,IFN-y, iNOS, MMP-9, TIMP-1, NF-kB e TGF-beta e fração de volume de isoprostano, fibras colágenas e elásticas nas vias aéreas e nos séptos alveolares quando comparado ao grupo OVA (p < 0,05).Houve reaçao de PCA nos animais sensibilizados com ovalbumina. CONCLUSÃO: EcTI atenuou a hiperresponsividade brônquica, a inflamação, o remodelamento e o estresse oxidativo nesse modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica crônica. Embora sejam necessários mais estudos, esse inibidor pode ser considerado uma futura ferramenta farmacológica para o tratamento de asma

Atividades biológicas de extratos salinos de sementes de plantas da caatinga contra Aedes Aegypti e investigação da participação de proteínas bioativas

Dengue fever, currently the most important arbovirus, is transmitted by the bite of the Aedes aegypti mosquito. Given the absence of a prophylactic vaccine, the disease can only be controlled by combating the vector insect. However, increasing reports of resistance and environmental damage caused by insecticides have led to the urgent search for new safer alternatives. Twenty - um plant s eed extracts from the Caatinga were prepared , tested and characterized . Sodium phosphate ( 50 mM pH 8.0) was used as extractor. All extracts showed larvicidal and ovipositional deterrence activity . Extracts of D. grandiflora, E. contortisiliquum, A. cearenses , C. ferrea and C. retusa were able to attract females for posture when in low co ncentration . In the attractive concentrations, the CE of E. contortisiliquum and A. cearenses were able to kill 52% and 100% of the larvae respectively . The extracts of A. cearenses , P. viridiflora, E. velutina, M. urundeuva and S. brasiliensis were also pupicides, while extracts of P. viridiflora, E. velutina, E. contortisiliquum , A. cearenses, A. colubrina, D. grandiflora , B. cheilantha , S. spectabilis, C. pyramidalis, M. regnelli e G. americana displayed adulticidal activity. All extracts were toxic to C. dubia zooplankton . The EB of E. velutina and E. contortisiliquum did not affect the viability of fibroblasts . In all extracts were identified at least two potential insecticidal proteins such as enzyme inhibitors, lectins and chitin - binding proteins and components of secondary metabolism . Considering all bioassays , the extracts from A. cearenses, P. viridiflora, E. contortisiliquum , S. brasiliensis, E. velutina and M. urundeuva were considered the most promising . The E. contortisiliquum extracts was the only one who did not show pupicida activity, indicating that its mechanism of action larvicide and adulticidal is related only to the ingesti on of toxic compounds by insect , so it was selected to be fragmenting. As observed for the CE , th e protein fractions of E. contortisiliquum also showed larvicidal activity, highlighting that F2 showed higher larvicidal activity and lower en vironmental toxicity than the CE source. The reduction in the proteolytic activity of larvae fed with crude extra ct and fractions of E. contortisiliquum suggest ed that the trypsin inhibitors ( ITEc) would be resp onsible for larvicidal activity . However the increase in the purification of this inhibitor resulted in loss of larvicidal activity , but the absence of trypsin inhibitor reduced the effectiveness of the fractions , indicating that the ITEC contributes to the larvicidal activity of this extract. Not been observed larvicidal activity and adulticide in rich fraction vicilin, nor evidence of the contribution o f this molecule for the larvicidal activity of the extract. The results show the potential of seeds from plant extracts of Caatinga as a source of active molecules against insects A. aegypti at different stages of its development cycle, since they are comp osed of different active compounds, including protein nature, which act on different mechanisms should result in the death of insec

Obtención de péptidos alimentarios mediante hidrólisis enzimática con efectos sobre la salud intestinal

En la presente Tesis Doctoral, se estudió la obtención e identificación de péptidos alimentarios mediante el uso de hidrólisis enzimática y sus efectos sobre la salud gastrointestinal. La secuenciación y cuantificación de los péptidos se realizó mediante cromatografía de líquidos de alta eficacia en fase inversa acoplada a espectrometría de masas en tándem (RP-HPLC-MS/MS). Se analizaron distintos hidrolizados y digeridos gastrointestinales de caseínas, proteínas de suero de leche y lunasina. Inicialmente, se propone la producción de caseinofosfopéptidos (CPPs) mediante la hidrólisis con tripsina de un subproducto de caseína generado durante la fabricación de un ingrediente funcional con actividad antihipertensiva. La identificación y la semi-cuantificación de CPPs revelaron algunos cambios cualitativos y cuantitativos en los CPPs generados en los hidrolizados con distintas condiciones de tiempo de hidrólisis y precipitación selectiva. Una vez realizada la identificación de CPPs en los hidrolizados trípticos, el subproducto también se sometió a un proceso de digestión gastrointestinal simulando las condiciones fisiológicas. La comparación de los péptidos resultantes mostró gran homología en las secuencias de CPPs formados por la hidrólisis con tripsina y la digestión gastrointestinal simulada. Se observó que algunas regiones de αS1-caseína, concretamente las comprendidas entre los residuos (43-59) y (60-74), de la αs1-caseína y los residuos (1-25) y (30-50) de β-caseína, fueron capaces de resistir tanto a la hidrólisis con tripsina como a la digestión gastrointestinal. Por lo tanto, se demuestra que el subproducto industrial puede ser empleado como fuente de CPPs para favorecer la absorción de minerales a nivel intestinal...

Desarrollo de herramientas bioinformáticas para estudios de proteómica a gran escala de "Candida albicans"

El concepto de Proteómica, acuñado en analogía al de Genómica, fue usado por primera vez por Marc Wilkins a mediados de los años 90 para describir al conjunto total de proteínas que se expresan por los genes de una célula, tejido u organismo. Anteriormente, a finales de los 80, el desarrollo de las técnicas de ionización suave, como la Ionización por Electrospray, ESI (Electrospray Ionization) o la Desorción Suave por Láser, SLD (Soft Laser Desorption), permitió ionizar grandes biomoléculas como los péptidos y proteínas manteniéndolas relativamente intactas. Esto sentó las bases de la espectrometría de masas aplicada a la proteómica. En la proteómica shotgun (el término inglés está muy asentado), el primer paso del experimento generalmente consiste en la digestión de las proteínas de la muestra en péptidos por acción de una enzima proteolítica como la tripsina. Esto incrementa notablmente el rendimiento en términos de número de proteínas que pueden ser identificadas en un sólo experimento comparado con los experimentos basados en gel. Sin embargo, tiene el coste asociado de provocar una gran complejidad de la mezcla de péptidos y el problema añadido de la inferencia de las proteínas originarias. Los péptidos son separados por cromatografía líquida e ionizados para entrar a continuación en el espectrómetro de masas donde son separados en función de la proporción entre su masa y su carga (m/z) y los valores obtenidos son registrados en un espectro MS1. En la espectrometría de masas en tándem (MS/MS), los péptidos con mayor intensidad son seleccionados para ser fragmentados de modo que se generan espectros MS/MS, colecciones de valores m/z y de intensidad para cada precursor y sus fragmentos...

Ontogenia del sistema digestivo y caracterización de la actividad enzimática de las larvas de chita Anisotremus scapularis (Tschudi, 1846)

La chita Anisotremus scapularis es un pez marino que habita las costas de Perú, es muy valorado para el consumo humano directo, y, es considerada una especie con potencial acuícola. El cultivo larval en muchas especies de peces marinos se considera como uno de los cuellos de botella para el desarrollo de la tecnología de cultivo a escala comercial, este es el caso de la chita. Como primer alimento y durante los primeros días de vida de las larvas se les suministra presas vivas, y posteriormente, cuando poseen un sistema digestivo más desarrollado, se les suministra alimento balanceado. Sin embargo, los alimentos vivos más empleados no satisfacen los requerimientos nutricionales de las larvas convirtiéndose en un punto crítico. Es por ello, que en los últimos años diversas investigaciones han concentrado sus esfuerzos en la sustitución del alimento vivo por alimento balanceado; no obstante, esto exige un buen conocimiento de la organización y funcionalidad del sistema digestivo. En este sentido, en el presente trabajo se investigan algunos aspectos de la fisiología nutricional de las larvas de chita durante los primeros 30 días de vida. Las larvas fueron cultivadas a partir de huevos obtenidos de desoves naturales de un lote de reproductores mantenidos en cautiverio en el Laboratorio de Cultivo de Peces del Instituto del Mar del Perú (IMARPE). El estudio del crecimiento en longitud, los análisis histológicos y la caracterización enzimática se realizaron a partir de muestras de larvas colectadas a los 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 14, 18, 22, 26 y 30 días después de la eclosión (DDE). Para los análisis histológicos, las larvas fueron sometidas a un proceso de deshidratación e inclusión en parafina, y teñidos utilizando la técnica de hematoxilina-eosina. La cuantificación de las enzimas digestivas de la chita, proteasas totales (ácidas y alcalinas), tripsina, leucina aminopeptidasa, lipasas dependientes de sales biliares y alfa-amilasa se llevó a cabo con técnicas espectrofotométricas. Al momento de la eclosión, las larvas poseen un tubo digestivo recto e histológicamente indiferenciado ubicado dorsalmente con respecto al saco vitelino, que se caracteriza por poseer una gota de aceite. Entre los 2 y 4 DDE, se observaron los mayores cambios en el desarrollo del sistema digestivo, entre los más importantes están la diferenciación de la bucofaringe, esófago e intestino, plegamiento de la mucosa intestinal, la formación de las microvellosidades en los enterocitos y el desarrollo de sus glándulas anexas, hígado y páncreas, los cuales permitieron la ingestión, digestión y absorción de los primeros alimentos exógenos ingeridos por las larvas. El mayor cambio que se observó en días posteriores fue la observación de un estómago en desarrollo, con la diferenciación de las glándulas gástricas (26 DDE). Las enzimas digestivas analizadas, fueron detectadas desde el momento de la eclosión de las larvas, antes de la apertura de la boca, y se incrementaron con la edad de los organismos. En general, se observó incrementos en la actividad total de las enzimas digestivas a partir de los 8 y 10 DDE o a los 4 mm de longitud total (LT), particularmente con aumentos más marcados en la actividad de las lipasas y de la leucina aminopeptidasa. Para la actividad de proteasas alcalinas totales, tripsina y alfa-amilasa, los aumentos fueron evidentes a partir de los 22 DDE o entre 6 y 7 mm de LT. La actividad de las proteasas ácidas se evidenció e incrementó a partir del 26 DDE o a los 9 mm de LT. En cuanto los patrones de actividad específica, en general, se observaron incrementos súbitos de la actividad que se relacionan con los periodos de transición de la alimentación endógena a exógena (3-6 DDE), y con el cambio de alimentación de rotíferos a metanauplios de Artemia (26 DDE). También, exceptuando la actividad de la leucina aminopeptidasa, se observaron estos incrementos súbitos antes de la primera alimentación. Con base al análisis histológico y bioquímico de las larvas de chita, se recomienda iniciar el destete a los 26 DDE.

Obtenção de biopeptídeos com atividade antioxidante a partir de proteínas de origem animal

Pele, ossos, espinhas, entre outros, separados durante o processamento de produtos cárneos podem ser uma boa fonte de proteína, especialmente de colágeno. Para obtenção de colágeno nativo a partir de ossos é necessário um tratamento prévio de desproteinização e desmineralização. Portanto, o objetivo deste trabalho foi determinar os melhores parâmetros para a desmineralização de ossos de pescado e frango utilizando soluções de HCl e EDTA um complexante de íons metálicos. O melhor efeito da desmineralização foi obtido com solução de HCl 1,0 mol/L. Após 48 h de extração, 99,4 e 95,4% das substâncias minerais foram solubilizadas para os ossos de pescado e para ossos de frango, respectivamente. Paralelamente, a menor perda de colágeno também foi observada nessas condições. O processo realizado empregando soluções de EDTA foi menos eficaz do que com solução de HCl. Após 48 h de extração com EDTA 0,1 mol/L, 37,5 e 32,4% dos compostos minerais foram removidos dos ossos de pescado e dos ossos de frango, respectivamente. Uma maior eficiência foi alcançada com solução de EDTA 0,5 mol/L. O rendimento do processo foi de cerca de 66,6% a partir dos ossos de pescado e 70,6% a partir os ossos de frango. A desmineralização com EDTA não provocou perda de colágeno.

Efeito do consumo de farinha de linhaça (Linum usitatissimum) no crescimento de ratos Wistar e relação com a digestibilidade de globulinas e fatores antinutricionais protéicos

Linseed is an important oilseed consumed raw as nutritional supplement, that although represents a rich source of nutrients, its nutritional value could be impaired due to the presence of antinutritional factors. In this study, protein fractions from raw linseed flour were extracted and isolated being obtained 12% of albumins, 82% of globulins, 5% of glutelins and 1% of prolamins. These proteins were visualized by SDS-PAGE and albumins showed low molecular mass protein bands around 21 kDa and minor bands, similar to that of trypsin inhibitor; Globulins presented protein bands with high molecular masses, which possibly are constituents of multimeric proteins, such as legumins. After determination of the centesimal composition of raw linseed, it was used as exclusive protein source for young rats to evaluate its effect on animal growth. The results showed negative effects on rat growth (weight gain 73% less than the control group) and reduction of intestinal villus (35%), that could be related with in vitro and in vivo globulin digestibility and proteinaceous antinutritional factors (mammalian digestive enzymes inhibitors and lectins) in albumin fraction. Native globulins showed, by SDS-PAGE, low susceptibility in vitro to trypsin and chymotrypsin, however presented high degradation by pancreatin. Thermal treatment of globulins for 5 and 15 minutes at 100ºC improved considerably its digestibility by trypsin and pancreatin. Globulins presented 93.2% in vivo digestibility, similar to the control protein. Albumin fraction had high trypsin inhibition activity (100%) and chymotrypsin inhibition of 28.3%; haemagglutinating activity was not detected. The results of this study indicate the negative action of trypsin inhibitors on animal growth, but can not be discarded its combined action with other antinutritional factors, which could compromise the raw linseed utilization as an alternative food

Construção de modelos de interação in silico e in vitro do inibidor do tipo Kunitz de Adenanthera pavonina L. para as enzimas cisteínicas e serínicas

Serines proteinases inhibitors (PIs) are widely distributed in nature and are able to inhibit both in vitro and in vivo enzymatic activites. Seed PIs in than leguminous are classified in seven families, Bowman-Birk and Kunitz type families that most studied representing an important role in the first line of defense toward insects pests. Some Kunitz type inhibitors possess activities serine and cysteine for proteinases named bifunctional inhibitor, as ApTKI the inhibitor isolate from seed of Adenanthera pavonina. The A. pavonina inhibitor presenting the uncommon property and was used for interaction studies between proteinases serine (trypsin) and cysteine (papain). In order to determinate the in vitro interaction of ApTKI against enzymes inhibitor purification was carried cut by using chromatographic techniques and inhibition assays. The 3D model of the bifunctional inhibitor ApTKI was constructed SWISS-MODEL program by homology modeling using soybean trypsin inhibitor (STI, pdb:1ba7), as template which presented 40% of identity to A. pavonina inhibitor. Model quality was evaluated by PROCHECK program. Moreover in silico analyzes of formed complex between the enzymes and ApTKI was evaluated by HEX 4.5 program. In vitro results confirmed the inhibitory assays, where the inhibitor presented the ability to simultaneously inhibit trypsin and papain. The residues encountered in the inhibitor model of folder structural three-dimensional that make contact to enzymes target coud explain the specificity pattern against serine and cysteine proteinases

Purificação, caracterização e avaliação da atividade antiproliferativa de um inibidor de quimotripsina tipo kunitz de semente de Eryhrina velutina

A chymotrypsin inhibitor was purified from Erythrina velutina seeds by ammonium sulphate fractionation, affinities chromatographies on Trypsin-Sepharose, Quimotrypsin-Sepharose and reversed phase C-18 FPLC/AKTA system. The inhibitor, named EvCI, shown molecular mass of 17 kDa, as determined by SDSPAGE. 2D-PAGE showed four isoinhibitors with pI values of 4,42, 4,63, 4,83 and 5,06, with molecular mass of 17 kDa each. The aminoacid sequence of EvCI was determined by MALDI-TOF-MS and showed a high similarity with other Kunitz-type inhibitor of Erythrina variegata. EvCI competitively inhibited chymotrypsin, with Ki of 4 x10-8 M, but did not inhibited trypsin, pancreatic elastase, bromelain and papain. The inhibitory activity of EvCI was stable over wide pH and temperature ranges. In the presence of DTT 100 mM for 120 min, EvCI lost 50 % of activity. Cytotoxicity was studied in HeLa, MDA, HepG2, K562 and PC3 cells after 72-h incubation period. EvCl inhibited HeLa cells growth with an IC50 value of 50 μg/ml. Subsequent studies in HeLa cells analysis of cell death by annexin V/PI double-staining and cell cycle, using flow cytometry. The results provide evidence for a cytostatic activity of EvCl and support further studies on potential application of this inhibitors as an antiproliferative agent in combined therapy against cervical cancer

Purificação, caracterização e efeitos imunomodulatório e antiproliferativo de uma lectina do fungo Clavaria cristata (Holmsk.) Pers

A 140,0 kDa lectin was purified and characterized from the mushroom Clavaria cristata. The purification procedures from the crude extract of the mushroom comprised gel filtration chromatography on Sephacryl s200 and ion exchange on Resource Q column. The purified lectin agglutinated all types of human erythrocytes with preference for trypsinized type O erythrocytes. The haemagglutinating activity is dependent of Ca 2+ ions and was strongly inhibited by the glycoprotein bovine submaxillary mucin (BSM) up to the concentration of 0, 125 mg/mL. The C. cristata lectin (CcL) was stable in the pH range of 2,5-11,5 and termostable up to 80 °C. CcL molecular mass determined by gel filtration on a Superose 6 10 300 column was approximately 140,3 kDa. SDS polyacrilamide gel electrophoresis revealed a single band with a molecular mass of approximately 14,5 kDa, when the lectin was heated at 100 ⁰C in the presence or absence of β-mercaptoethanol. CcL induced activation of murine peritoneal macrophages in vitro resulting in the release of nitric oxide (NO), reaching the maximum production at 24 h. In experimental paw oedema model in mice, CcL showed proinflammatory activity being able to induce oedema formation. Cell viability of HepG2, MDA 435 e 3T3 cell lines was examined after 72 h of incubation with CcL in different concentrations (0,5-50 μg/mL). CcL inhibited HepG2 cells growth with an IC50 value of 50 μg/mL. In the present work, the observed immunomodulatory and antiproliferative effects indicate CcL as a possible immunomodulator compound, interfering in the macrophages immune response, taking possible anti-parasitic, anti-tumoral effects or diagnostic and/or therapeutic

Avaliação das atividades anti-inflamatória, anticoagulante e antiproliferativa do inibidor de quimotripsina das sementes de erythrina velutina (EvCI)

Studies indicate that several components were isolated from medicinal plants, which have antibacterial, antifungal, antitumor and anti-inflammatory properties. Sepsis is characterized by a systemic inflammation which leads to the production of inflammatory mediators exacerbated by excessive activation of inflammatory cells and disseminated intravascular coagulation (DIC), in which the human neutrophil elastase plays an important role in its pathogenesis. Several epidemiological studies suggest that components of plants, especially legumes, can play a beneficial role in reducing the incidence of different cancers. A chymotrypsin inhibitor of Kunitz (Varela, 2010) was purified from seeds of Erythrina velutina (Mulungu) by fractionation with ammonium sulfate, affinity chromatography on Trypsin-Sepharose, Chymotrypsin-Sepharose and ion exchange chromatography on Resource Q 1 ml (GE Healthcare) in system FPLC / AKTA. The inhibitor, called EvCI, had a molecular mass of 17 kDa determined by SDS-PAGE. The purified protein was able to inhibit human neutrophil elastase (HNE), with an IC50 of 3.12 nM. The EvCI was able to inhibit both pathways of HNE release stimulated by PAF and fMLP (75.6% and 65% respectively). The inhibitor also inhibited leukocyte migration in septic mice about 87% and prolonged the time of coagulation and inhibition factor Xa. EvCI showed neither hemolytic activity nor cytotoxicity. EvCI showed a selective antiproliferative effect to HepG2 cell lines with IC50 of 0.5 micrograms per milliliter. These results suggest EvCI as a molecule antagonist of PAF / fMLP and a potential use in fighting inflammation related disorders, disseminated intravascular coagulation (DIC) and cancer

Associação entre o proteassoma e o inibidor de protease BTCI : caracterização fisico-química e efeitos moleculares em células de câncer de mama (MCF-7)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2010.