Darstellung und Untersuchung von Materialien mit negativem Magnetowiderstand

Mit dem System KCo2-xCuxS2 wurde ein neues magnetoresistives System gefunden. Der negative Magnetowiderstand ist mit der Größenordnung von 10 % in 8 Tesla bei 4 K klein im Vergleich zu Mangan-Perowskiten, jedoch eindeutig intrinsisch.Die magnetische Struktur des Thiospinells Fe0.5Cu0.5Cr2S4 konnte durch Neutronenbeugung, Mößbauer-Spektroskopie sowie begleitende Bandstrukturrechnungen aufgeklärt werden. Ein negativen Magnetowiderstand von 5,5 % nahe der Curie-Temperatur in Magnetfeldern von 8 Tesla bei der isostrukturellen eisenreichen Verbindung Fe0.75Cu0.25Cr2S4 wurde gefunden.Die intermetallischen Verbindungen des Gadoliniums weisen alle hohe negative Magnetowiderstände bei TC auf. Sowohl bei GdAl2 als auch bei GdPdP und GdPtP werden Widerstandsabsenkungen in 8 Tesla beobachtet, die bei ~1,5 TC 4 % erreichen und bis zu Temperaturen von 5 K über 6 % liegen. Während der Transportmechanismus in GdAl2 offenbar auf einer direkten Gd-Gd Wechselwirkung beruht, ist bei GdPdP und GdPtP bei tiefen Temperaturen ein nicht eindeutiges Verhalten beobachtbar. Ein Einfluss von Fremdphasen kann jedoch ausgeschlossen werden.Unter den metallreichen Phosphiden hexagonaler Struktur zeigt Fe2P große negative MR-Effekte von 7 % schon bei Raumtemperatur in hohen Feldern. Nahe der ferromagnetischen Ordnung reagiert die Verbindung auf äußere Felder bei niedrigen Feldstärken von weniger als 2 Tesla mit einer Erhöhung der Leitfähigkeit um 10 bis 11 %.

Virus-Wirt-Interaktionen bei Hepatitis-B-Virus-Infektionen: Die Rolle von Gamma2-Adaptin

Mit etwa 350 Millionen chronisch-infizierten Menschen gehört die Hepatitis-B neben der Tuberkulose und AIDS zu den häufigsten Infektionskrankheiten der Welt. Der einzig sichere Schutz vor dem bis zur Leberzirrhose persistierenden Virus bietet eine vorbeugende Impfung. Eine angemessene Therapie chronisch-erkrankter Patienten ist durch die Unkenntnis über viele Bereiche des HBV-Lebenszyklus nur eingeschränkt möglich. Gegenstand dieser Arbeit war vor allem etwas Licht in das Wechselspiel zwischen HBV und der Wirtszelle zu bringen und zelluläre Komponenten und Mechanismen zu identifizieren, die am Sortierungs- und Transportmechanismus viraler Substrukturen zur sogenannten Assembly-Plattform beteiligt sind, um dort die Freisetzung des Virus zu initiieren. Mit der vorliegenden Arbeit habe ich Methoden der Zellbiologie, Mikrobiologie, Molekularbiologie und Virologie vereint, um neue Einblicke in den HBV-Lebenszyklus zu gewinnen. Für die Ausschleusung von HBV wird seither der konstitutive Weg der Sekretion angenommen. In Anlehnung an den Mechanismus umhüllter RNA-Viren kann die Hypothese aufgestellt werden, dass das MVB (Multivesicular Body) im Prozess der HBV-Freisetzung beteiligt sein könnte. Die Freisetzung des Hepatitis-B-Virus aus einer infizierten Zelle ist ein streng organisierter Prozess, der sowohl das HBV-Coreprotein als auch die HBV-Hüllproteine zu benötigen scheint. (max. 5.000 Zeichen)Inhaltszusammenfassung in einer weiteren Sprache deutschenglischfranzösischrussischmehrsprachigsonst.Ausgangspunkt der Arbeit war eine spezifische Interaktion des großen HBV-Hüllproteins (L) mit einem neuen Mitglied der Adaptor-Protein-Komplex-Familie (AP-Komplex), dem g2?Adaptin (Hartmann-Stühler und Prange, 2001), das mutmaßlich an endosomalen Sortierungs- und Transportprozessen beteiligt ist. In Analogie zur Funktionsweise von Adaptin-Molekülen wurde vom g2-Adaptin eine Rolle in der Initiation und Steuerung der Sprossung und Freisetzung von HBV vermutet. Die im Rahmen dieser Arbeit erweiterte Charakterisierung der g2/L-Interaktion zeigte zum einen, dass die Ohrdomäne des Adaptins für die Interaktion essentiell ist und zum anderen, dass die Rekrutierung des Adaptins durch das L-Protein zu cis-Golgi-Strukturen innerhalb kleiner Transportvesikel entlang des Nukleus (perinukleär) erfolgt. Erste Ergebnisse dieser Arbeit deuteten bereits an, dass das virale Coreprotein mit demselben Adaptorprotein zu interagieren vermag. Für die g2/Core-Interaktion erwies sich in Folgearbeiten die Kopfregion des g2-Adaptins als die entscheidende Bindungsdomäne (Rost et al., 2006). Sowohl eine funktionelle Inaktivierung des g2-Adaptins durch RNA-Interferenz als auch eine g2-Adaptin- Überexpression störten die Virusmontage in späten Phasen der Morphogenese. Während ein g2-Adaptin-Überschuss die HBV-Produktion indirekt durch die Induktion dysfunktioneller endosomaler Kompartimente blockierte, verhinderte der siRNA-induzierte g2-Adaptin-Verlust die späte Ausschleusung des Virus aus der Zelle. Das Silencing von g2-Adaptin zeigte dabei weder einen Einfluss auf endosomale Strukturen noch auf die Freisetzung subviraler Partikel (Viren ohne Genom). Demzufolge scheinen sich die Mechanismen der Produktion von subviralen und viralen HBV-Partikeln bezüglich ihrer Anforderungen an Zellfunktionen und Transportwegen deutlich voneinander zu unterscheiden. Es konnten erste Hinweise darauf gefunden werden, dass die Virusmontage an endosomalen Kompartimenten (zum Beispiel dem MVB) erfolgen könnte, was durch bereits weitergeführte Untersuchungen bestätigt werden konnte (Lambert et al., J Virol, epub ahead of print). Darüber hinaus ist inzwischen bekannt, dass das Hepatitis-B-Virus für den Zusammenbau und die Freisetzung nicht nur das Adaptor-verwandte g2-Adaptin, sondern auch die endosomale Ubiquitin Ligase Nedd4, wahrscheinlich in Zusammenhang mit Ubiquitin selbst (Rost et al., 2006), benötigt. Eine Untersuchung dieser weiterführenden Aspekte war jedoch nicht mehr Inhalt dieser Arbeit. Insgesamt weisen die Daten darauf hin, dass die Sortierung und der Transport der Substrukturen des Hepatitis-B-Virus durch den MVB-Komplex zu erfolgen scheint. Dabei könnte das g2-Adaptin mit Hilfe einer Reihe von Kofaktoren (wie zum Beispiel Nedd4, Ubiquitin, etc.) eine entscheidende Rolle an der Sortierung und Anbindung des viralen L- und Coreproteins an die Assembly-Plattform spielen. Doch der genaue Mechanismus, welcher große Ähnlichkeit mit dem umhüllter RNA-Viren (wie zum Beispiel HIV-1) aufweist, bleibt noch ungeklärt. Ob weitere zelluläre Kofaktoren an der HBV-Sprossung und Freisetzung beteiligt sind, bleibt ebenfalls unbekannt und bedarf weiterer Untersuchungen.

Der Wirkungsmechanismus von Neurosteroiden auf das Cytoskelett neuronaler Zellen

Neurosteroide können langsame genomische und schnelle nicht-genomische Effekte zeigen. Die Synthese und der Metabolismus von Neurosteroiden werden entwicklungsbedingt reguliert. In den letzten Jahren sind immer mehr schnelle Steroideffekte bekannt geworden, die sowohl über klassische als auch über nicht-klassische Rezeptoren laufen. Zum heutigen Stand der Forschung sind die morphologischen Effekte von Neurosteroiden auf das neuronale Cytoskelett und die involvierten Signalkaskaden noch weitgehend unerforscht. In diesem Zusammenhang stellen sich auch die Fragen nach den verantwortlichen Rezeptoren und dem Transportmechanismus sowie der subzellulären Lokalisation der Steroide. Die im Rahmen meiner Promotion erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Steroide DHEA und Testosteron eine Reorganisation des Aktincytoskeletts in neuronalen Zellen induzieren und dass diese Effekte diesen Steroiden und nicht ihren Folgemetaboliten zuzuordnen sind. DHEA bewirkt die Kontraktion der Zellen, eine erhöhte Ausbildung von Stressfasern und fokalen Adhäsionskomplexen sowie die Bildung von Filopodien. Der diesen Effekten zu Grunde liegende Signalweg konnte eindeutig identifiziert werden. DHEA induziert in neuronalen Zellen die Aktivierung des Rho-Signalwegs. Diese Aktivierung führt zu einem erhöhten Phosphorylierungsstatus der regulatorischen leichten Kette von Myosin II (MRLC) an Serin 19 und der damit verbundenen erhöhten Myosin-Aktin-Interaktion. Die Ausbildung von Filopodien wird vermutlich über eine Aktivierung der GTPase Cdc42 vermittelt. Testosteron induziert das Auswachsen langer Neuriten sowie eine Verminderung von Stressfasern in neuronalen Zellen. Diese Effekte sind abhängig von der Aktivität der PI3-Kinase. Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Testosteron über die PI3-Kinase und FAK den Rac-Signalweg induziert, da es zu einer Inhibierung des Rho-Signalwegs kommt. Zahlreiche Erkenntnisse weisen darauf hin, dass DHEA und Testosteron die Aktivierung der beteiligten Signalwege über einen G-Protein gekoppelten Rezeptor induzieren. DHEA und Testosteron beeinflussen auch die Expression und die Lokalisation der regulatorischen leichten Ketten von Myosin II. Im Gegensatz zu DHEA (Lokalisation der MRLC in der kortikalen Region der Zelle), induziert Testosteron eine Umlokalisation der MRLC in den Zellkern. Daher ist es denkbar, dass die MRLCs, wie auch Aktin, als Transkriptionsfaktoren wirken können. Die Synthese eines funktionalen, fluoreszierenden DHEA-Derivats (DHEA-Bodipy) ermöglichte erstmals, den Transport und die subzelluläre Lokalisation von DHEA in neuronalen Zellen zu beobachten. DHEA-Bodipy wird in neuronalen Zellen in den Mitochondrien lokalisiert. Diese Lokalisation ergibt völlig neue Ansätze im Verständnis zellulärer Wirkungsorte von Steroiden und beteiligter Rezeptoren. Das in meiner Arbeit vorgestellte Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung von Steroiden bietet vielfältige Möglichkeiten im Einsatz zellbiologischer Methoden. Nach diesem Verfahren hergestellte, fluoreszierende Steroide eignen sich aufgrund ihrer Stabilität sehr gut für die Untersuchung des Transports und der subzellulären Lokalisation von Steroiden an fixierten und lebenden Zellen sowie für Colokalisationsexperimente. Diese Methode grenzt somit auch die Anzahl möglicher molekularer Interaktionspartner ein. Für Testosteron konnte ebenfalls ein fluoreszierendes Testosteron-Derivat (Testosteron-Bodipy) synthetisiert werden. Die Aufklärung der Effekte von Steroiden auf das neuronale Cytoskelett und der beteiligten Signalkaskaden sowie die Identifizierung der zellulären Wirkungsorte ermöglichen therapeutische Ansätze zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen, deren Ursachen in Abnormitäten des Cytoskeletts oder fehlregulierter Neurosteroidogenese zu begründen sind.

Asymmetrisches Dimethylarginin als kardiovaskulärer Risikofaktor : Transportmechanismen und Auswirkungen einer Akkumulation

Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit dem Membrantransporter-vermittelten Export von asymmetrischem Dimethyl-L-Arginin (ADMA) aus der Endothelzelle. Da ADMA-Plasmakonzentrationen mit Erkrankungen wie koronaren Herzkrankheiten, Atherosklerose, Bluthochdruck und Endotheldysfunktion in Verbindung gebracht werden, ist ein effektiver ADMA-Export aus der Zelle heraus unabdingbar. Um den Mechanismus hierfür aufzuklären, wurden die immortalisierte Endothelzelllinie EA.hy926 und weitere primäre Endothelzellen (humane Umbilikalvenenendothelzellen und Endothelzellen der großen und kleinen Herzgefäße) auf die Expression basischer Aminosäuretransporter mittels einer qRT-PCR hin untersucht. Dabei zeigte sich, dass alle getesteten Endothelzellen die Aminosäuretransporter hCAT-1, y+LAT1 und y+LAT2 exprimierten. Basierend auf ADMA-Exportdaten, die mit entsprechenden Transporter-überexprimierenden Xenopus laevis-Oozyten gewonnen wurden, wurde festgestellt, dass alle drei Membrantransporter ADMA exportieren konnten. Der physiologisch wichtige Exportweg für intrazellulär anfallendes ADMA scheint dabei der via y+L zu sein, da es sich hierbei um einen aktiven Exportmechanismus handelt, der im Gegentransport von im humanen Plasma reichlich vorhandenen neutralen Aminosäuren und Natriumionen den nach innen gerichteten Natriumgradienten ausnutzt. Die Wichtigkeit des Membrantransportes für die Kontrolle intrazellulärer ADMA-Konzentrationen wurde in vitro durch Entzug von extrazellulären Austauschsubstraten und einer daraus resultierenden Blockade der Transportfunktion gezeigt. Hierbei wurde innerhalb von zwei Stunden ein 2,5-facher Anstieg der intrazellulären ADMA-Konzentration festgestellt, die bei Präsenz von Austauschsubstrat für die Transporter nicht auftrat. Die Relevanz der y+LATs für den ADMA-Export wurde durch Herunterregulation dieser Proteine mittels siRNA sichtbar: Unter diesen Bedingungen konnte ADMA auch in Anwesenheit von Austauschsubstrat für das System y+L weniger effektiv exportiert werden. Eine wichtige Aufgabe des humanen Endothels ist die Bildung bioaktiven Stickstoffmonoxids, das unter anderem eine Vasodilatation der Gefäße bewirkt. Für diese NO-Synthese wird L-Arginin als Substrat von der endothelialen NO-Synthase benötigt. ADMA stellt einen kompetitiven Inhibitor dar, dessen erhöhtes intrazelluläres Vorkommen möglicherweise hemmend auf die NO-Synthase wirken könnte. Es konnten hier allerdings keine Auswirkungen eines um das 4-fache gestiegenen, intrazellulären ADMA-Spiegels auf die Tätigkeit der endothelialen NO-Synthase festgestellt werden. Möglicherweise bedarf es eines noch weiter zu Gunsten des ADMAs verschobenen, intrazellulären L-Arginin:ADMA-Verhältnisses, um eine Hemmung der NO-Synthase festzustellen. Dies könnte bei einem pathologischen Transporterausfall eintreten, der intrazellulär permanent höhere ADMA-Konzentrationen zur Folge hätte. Des Weiteren hätte ein Anstieg der Arginasetätigkeit und damit einhergehend ein Substratdefizit für die NO-Synthase den gleichen Effekt. Der translationale Ansatz mit humanen peripheren mononukleären Blutzellen von Patienten aus der 2. Medizinischen Klinik zeigte die Tendenz einer Korrelation zwischen dem ADMA-Exportvermögen und der Endothelfunktion und brachte zudem die Erkenntnis eines individuell äußerst variablen ADMA-Exportvermögens zutage.

Translationsregulation des Myelin basischen Proteins in Gliazellen

Im zentralen Nervensystem (ZNS) myelinisieren Oligodendrozyten neuronale Axone, indem sie ihre Zellfortsätze mehrfach um axonale Segmente wickeln. Die Ausbildung dieser multilamellaren Membranstapel ermöglicht eine saltatorische und damit rasche und energie-effiziente Erregungsleitung (Nave, 2010). Eine Schädigung des Myelins beeinträchtigt die Reizweiterleitung und führt zur Degeneration der Axone, wie es zum Beispiel bei der Multiplen Sklerose der Fall ist. Das Myelin basische Protein (MBP) ist ein Hauptbestandteil des Myelin und ist essentiell für die Kompaktierung der Myelinmembran (Wood et al., 1984). Die MBP mRNA wird in hnRNP A2 enthaltenen RNA Granulen in einem translations-inaktiven Zustand zu den distalen Fortsätzen transportiert. Vermittelt durch axonale Signale wird nach axo-glialem Kontakt die Translation von MBP ermöglicht (White et al., 2008). Der genaue Mechanismus der differentiellen Genregulation des MBP Proteins ist bisher nur unzureichend aufgeklärt. In der vorliegenden Arbeit konnte eine kleine regulatorische RNA (sncRNA) identifiziert werden, welche über die seed Region mit der MBP mRNA interagieren und die Translation regulieren kann. In primären Oligodendrozyten führt die Überexpression der sncRNA-715 zu reduzierten MBP Protein Mengen und die Blockierung der endogenen sncRNA-715 führt zu einer gesteigerten MBP Synthese. Interessanterweise korreliert während der Differenzierung der Oligodendrozyten in vitro und in vivo die Synthese des MBP Proteins invers mit der Expression der sncRNA-715. In Oligodendrozyten beeinflusst eine experimentell erhöhte sncRNA-715 Menge die Zellmorphologie und induziert Apoptose. Weiterhin ist sncRNA-715 in zytoplasmatischen granulären Strukturen lokalisiert und assoziiert mit MBP mRNA in hnRNP A2 Transport- Granula. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass sncRNA-715 ein Bestandteil der hnRNP A2 Granula sein könnte und dort spezifisch die Translation der MBP mRNA während des Lokalisationsprozesses inhibiert. In chronischen MS Läsionen sind Olig2+-Zellen zu finden. Obwohl die MBP mRNA in diesen Läsionen nachzuweisen ist, kann kein Protein synthetisiert werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in diesen Läsionen die Expression der sncRNA-715 erhöht ist. SncRNA-715 könnte die Translation von MBP verhindern und folglich als Inhibitor der Remyelinisierung während des Krankheitsverlaufs fungieren. Schwann-Zellen sind die myelinisierenden Zellen im peripheren Nervensystem (PNS). Im Zuge der Myelinisierung wird die MBP mRNA in diesen Gliazellen ebenfalls in die distalen Fortsätze transportiert und dort lokal translatiert und in die Myelinmembran eingebaut (Trapp et al., 1987). Im Gegensatz zum ZNS ist im PNS nur wenig über den Transportmechanismus der mRNA bekannt (Masaki, 2012). Es ist es sehr wahrscheinlich, dass in Schwann-Zellen und Oligodendrozyten die Lokalisation und die translationale Hemmung der MBP mRNA ähnlichen Mechanismen unterliegen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass hnRNP A2 und sncRNA-715 in Schwann-Zellen exprimiert werden und in zytoplasmatischen Granula-ähnlichen Strukturen lokalisiert sind. Während der Differenzierung dieser Gliazellen in vivo und in vitro korreliert die Expression der sncRNA-715 invers mit der Synthese des MBP Proteins. HnRNP A2 und sncRNA-715 scheinen in Schwann-Zellen assoziiert zu sein und könnten wie in Oligodendrozyten den Transport der MBP mRNA vermitteln.

Na +-coupled betaine symporters involved in osmotic stress response in prokaryotes and eukaryotes

The betaine/GABA transporter BGT1 is one of the most important osmolyte transporters in the kidney. BGT1 is a member of the neurotransmitter sodium symporter (NSS) family, facilitates Na+/Cl--coupled betaine uptake to cope with hyperosmotic stress. Betaine transport in kidney cells is upregulated under hypertonic conditions by a yet unknown mechanism when increasing amounts of intracellular BGT1 are inserted into the plasma membrane. Re-establishing isotonicity results in ensuing depletion of BGT1 from the membrane. BGT1 phosphorylation on serines and threonines might be a regulation mechanism. In the present study, four potential PKC phosphorylation sites were mutated to alanines and the responses to PKC activators, phorbol 12-myristate acetate (PMA) and dioctanoyl-sn-glycerol (DOG) were determined. GABA-sensitive currents were diminished after 30 min preincubation with these PKC activators. Staurosporine blocked the response to DOG. Three mutants evoked normal GABA-sensitive currents but currents in oocytes expressing the mutant T40A were greatly diminished. [3H]GABA uptake was also determined in HEK-293 cells expressing EGFP-tagged BGT1 with the same mutations. Three mutants showed normal upregulation of GABA uptake after hypertonic stress, and downregulation by PMA was normal compared to EGFP-BGT1. In contrast, GABA uptake by the T40A mutant showed no response to hypertonicity or PMA. Confocal microscopy of the EGFP-BGT1 mutants expressed in MDCK cells, grown on glass or filters, revealed that T40A was present in the cytoplasm after 24 h hypertonic stress while the other mutants and EGFP-BGT1 were predominantely present in the plasma membrane. All four mutants co-migrated with EGFP-BGT1 on Western blots suggesting they are full-length proteins. In conclusion, T235, S428, and S564 are not involved in downregulation of BGT1 due to phosphorylation by PKC. However, T40 near the N-terminus may be part of a hot spot important for normal trafficking or insertion of BGT1 into the plasma membrane. Additionally, a link between substrate transport regulation, insertion of BGT1 into the plasma membrane and N-glycosylation in the extracellular loop 2 (EL2) could be revealed. The functional importance of two predicted N-glycosylation sites, which are conserved in EL2 within the NSS family were investigated for trafficking, transport and regulated plasma membrane insertion by immunogold-labelling, electron microscopy, mutagenesis, two-electrode voltage clamp measurements in Xenopus laevis oocytes and uptake of radioactive-labelled substrate into MDCK cells. Trafficking and plasma membrane insertion of BGT1 was clearly promoted by proper N-glycosylation in both, oocytes and MDCK cells. De-glycosylation with PNGase F or tunicamycin led to a decrease in substrate affinity and transport rate. Mutagenesis studies revealed that in BGT1 N183 is the major N-glycosylation site responsible for full protein activity. Replacement of N183 with aspartate resulted in a mutant, which was not able to bind N-glycans suggesting that N171 is a non-glycosylated site in BGT1. N183D exhibited close to WT transport properties in oocytes. Surprisingly, in MDCK cells plasma membrane insertion of the N183D mutant was no longer regulated by osmotic stress indicating unambiguously that association with N-glycans at this position is linked to osmotic stress-induced transport regulation in BGT1. The molecular transport mechanism of BGT1 remains largely unknown in the absence of a crystal structure. Therefore investigating the structure-function relationship of BGT1 by a combination of structural biology (2D and 3D crystallization) and membrane protein biochemistry (cell culture, substrate transport by radioactive labeled GABA uptake into cells and proteoliposomes) was the aim of this work. While the functional assays are well established, structure determination of eukaryotic membrane transporters is still a challenge. Therefore, a suitable heterologous expression system could be defined, starting with cloning and overexpression of an optimized gene. The achieved expression levels in P. pastoris were high enough to proceed with isolation of BGT1. Furthermore, purification protocols could be established and resulted in pure protein, which could even be reconstituted in an active form. The quality and homogeneity of the protein allowed already 2D and 3D crystallization, in which initial crystals could be obtained. Interestingly, the striking structural similarity of BGT1 to the bacterial betaine transporter BetP, which became a paradigm for osmoregulated betaine transport, provided information on substrate coordination in BGT1. The structure of a BetP mutant that showed activity for GABA was solved to 3.2Å in complex with GABA in an inward facing open state. This structure shed some light into the molecular transport mechanisms in BGT1 and might help in future to design conformationally locked BGT1 to enforce the on-going structure determination.

Drug delivery, entry and intracellular trafficking of polymeric nanoparticles

Polymere Nanopartikel sind kleine Teilchen, die vielseitige Einsatzmöglichkeiten für den Transport von Wirkstoffen bieten. Da Nanomaterialien in diesen biomedizinischen Anwendungen oft mit biologischen Systemen in Berührung kommen, erfordert das eine genaue Untersuchung ihrer gegenseitigen Wechselwirkungen. In diesem speziellen Forschungsgebiet, welches sich auf die Interaktionen von Nanomaterialien mit biologischen Komponenten konzentriert, wurde bereits eine Vielzahl verschiedener Nanopartikel-Zell-Interaktionen (z. B. Nanotoxizität, Wirkstofftransport-mechanismen) analysiert. Bezüglich der Untersuchungen zu nanopartikulären Wirkstofftransport-mechanismen ist es im Allgemeinen akzeptiert, dass ein erfolgreicher zellulärer Transport hauptsächlich von der Aufnahme des Nanotransporters abhängt. Deshalb analysieren wir in dieser Arbeit (1) den Wirkstofftransportmechanismus für biologisch-abbaubare eisenhaltige Poly-L-Milchsäure Nanopartikel (PLLA-Fe-PMI) sowie (2) die Aufnahmemechanismen und die intrazellulären Transportwege von nicht-abbaubaren superparamagnetischen Polystyrolnanopartikeln (SPIOPSN). rnIn dieser Arbeit identifizieren wir einen bisher unbekannten und nicht-invasiven Wirkstoff-transportmechanismus. Dabei zeigt diese Studie, dass der subzelluläre Transport der nanopartikulärer Fracht nicht unbedingt von einer Aufnahme der Nanotransporter abhängt. Der identifizierte Arzneimitteltransportmechanismus basiert auf einem einfachen physikochemischen Kontakt des hydrophoben Poly-L-Milchsäure-Nanopartikels mit einer hydrophoben Oberfläche, wodurch die Freisetzung der nanopartikulären Fracht ausgelöst wird. In Zellexperimenten führt die membranvermittelte Freisetzung der nanopartikulären Fracht zu ihrem sofortigen Transport in TIP47+- und ADRP+- Lipidtröpfchen. Der Freisetzungsmechanismus („kiss-and-run") kann durch die kovalente Einbindung des Frachtmoleküls in das Polymer des Nanopartikels blockiert werden.rnWeiterhin wird in Langzeitversuchen gezeigt, dass die Aufnahme der untersuchten polymeren Nanopartikel von einem Makropinozytose-ähnlichen Mechanismus gesteuert wird. Im Laufe dieser Arbeit werden mehrere Faktoren identifiziert, die in diesem Aufnahmemechanismus eine Rolle spielen. Darunter fallen unter anderem die kleinen GTPasen Rac1 und ARF1, die die Aufnahme von SPIOPSN beeinflussen. Darauffolgend werden die intrazellulären Transportwege der Nanopartikel untersucht. Mit Hilfe eines neuartigen Massenspektrometrieansatzes wird der intrazelluläre Transport von nanopartikelhaltigen endozytotischen Vesikeln rekonstruiert. Intensive Untersuchungen identifizieren Marker von frühen Endosomen, späten Endosomen/ multivesikulären Körpern, Rab11+- Endosomen, Flotillin-Vesikeln, Lysosomen und COP-Vesikeln. Schließlich wird der Einfluss des lysosomalen Milieus auf die Proteinhülle der Nanopartikel untersucht. Hier wird gezeigt, dass die adsorbierte Proteinhülle auf den Nanopartikeln in die Zelle transportiert wird und anschließend im Lysosom abgebaut wird. rnInsgesamt verdeutlicht diese Arbeit, dass die klassische Strategie des nanopartikulären und invasiven Wirkstofftransportmechanismuses überdacht werden muss. Weiterhin lässt sich aus den Daten schlussfolgern, dass polymere Nanopartikel einem atypischen Makropinozytose-ähnlichen Aufnahmemechanismus unterliegen. Dies resultiert in einem intrazellulären Transport der Nanopartikel von Makropinosomen über multivesikuläre Körperchen zu Lysosomen.rn