Étude du mécanisme d’augmentation de la relâche virale par la protéine Vpu du VIH-1

Les différentes protéines accessoires du VIH-1, l’agent étiologique du SIDA, optimisent la réplication et la propagation du virus in vivo. Parmi ces dernières figure Vpu, l’antagoniste du facteur de restriction nommé Tetherin qui prévient la relâche des particules virales à partir de la surface de cellules infectées. En diminuant son expression de surface, Vpu prévient l’incorporation de ce facteur de restriction dans la particule virale en formation et conséquemment, empêche la formation d’une ancre protéique reliant le virus mature à la membrane plasmique de la cellule infectée. La mécanistique sous-jacente n’était cependant pas connue. Cette présente thèse relate nos travaux exécutés afin d’élucider la dynamique des mécanismes cellulaires responsables de cet antagonisme. Une approche de mutagénèse dirigée a d’abord permis d’identifier deux régions contenant des déterminants de la localisation de Vpu dans le réseau trans-Golgi (RTG), puis de démontrer la relation existante entre cette distribution et l’augmentation de la relâche des particules virales. Des expériences subséquentes de marquage métabolique suivi d’une chasse exécutées dans des systèmes cellulaires où Tetherin est exprimée de façon endogène ont suggéré le caractère dispensable de l’induction par Vpu de la dégradation du facteur de restriction lors de son antagonisme. En revanche, une approche de réexpression de Tetherin conduite en cytométrie en flux, confirmée en microscopie confocale, a mis en évidence une séquestration de Tetherin dans le RTG en présence de Vpu, phénomène qui s’est avéré nécessiter l’interaction entre les deux protéines. L’usage d’un système d’expression de Vpu inductible conjugué à des techniques de cytométrie en flux nous a permis d’apprécier l’effet majeur de Vpu sur la Tetherin néo-synthétisée et plus mineur sur la Tetherin de surface. En présence de Vpu, la séquestration intracellulaire de la Tetherin néo-synthétisée et la légère accélération de l’internalisation naturelle de celle en surface se sont avérées suffisantes à la réduction de son expression globale à la membrane plasmique et ce, à temps pour l’initiation du processus de relâche virale. À la lumière de nos résultats, nous proposons un modèle où la séquestration de la Tetherin néo-synthétisée dans le RTG préviendrait le réapprovisionnement de Tetherin en surface qui, combinée avec l’internalisation naturelle de Tetherin à partir de la membrane plasmique, imposerait l’établissement d’un nouvel équilibre de Tetherin incompatible avec une restriction de la relâche des particules virales. Cette thèse nous a donc permis d’identifier un processus par lequel Vpu augmente la sécrétion de virus matures et établit une base mécanistique nécessaire à la compréhension de la contribution de Vpu à la propagation et à la pathogénèse du virus, ce qui pourrait mener à l’élaboration d’une stratégie visant à contrer l’effet de cette protéine virale.

Création d'un modèle cellulaire des voies respiratoires du porc pour étudier les effets d'une co-infection virale au virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin et au circovirus porcin

Le circovirus porcin de type 2 (PCV2) est un pathogène majeur pour l’industrie porcine et est associé à une longue liste de maladies associées au circovirus porcin (MACVP). Les premières tentatives pour reproduire ces maladies ont montré que le virus doit être combiné à d’autres agents pathogènes du porc ou à différents stimulants du système immunitaire. De ces agents, le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est celui qui est le plus souvent co-isolé avec le PCV dans les fermes. Une grande partie des efforts faits pour étudier les interactions entre ces deux virus ont été menés in vivo. Les interactions in vitro ont jusqu’à maintenant été peu étudiées du fait qu’il n’existe pas de modèle cellulaire permettant la réplication efficace des deux virus. L’objectif de ce projet était donc de développer un modèle cellulaire propice à la réplication des deux virus et d’étudier leur interaction en co-infection. Une lignée cellulaire provenant de la trachée d’un porcelet nouveau-né (NPTr), permissive au PCV, a été génétiquement modifiée pour exprimer la protéine CD163, un récepteur majeur du VSRRP. Ce projet a montré que cette nouvelle lignée cellulaire (NPTr-CD163) est permissive au VSRRP ainsi qu’à plusieurs génotypes de PCV (PCV1, PCV2a, PCV2b et PCV1/2a). De plus, les résultats obtenus lors d’infections mixtes suggèrent que la réplication du VSRRP et du PCV conditionne de façon génotype-dépendante celle du PCV puisque la réplication du PCV1 est inhibée en présence de VSRRP, alors que celle du PCV2b est significativement augmentée dans les mêmes conditions. Ni la mortalité cellulaire, ni la réponse cellulaire en cytokines n’a permis d’expliquer ces résultats. La modulation de la réplication du PCV par le VSRRP serait donc liée à un mécanisme spécifique qui demeure inconnu. De plus, cet effet varierait en fonction du génotype de PCV.

Identification des partenaires protéiques de l'hélicase virale E1 du virus du papillome humain : caractérisation d'une nouvelle interaction avec la protéine à domaines WD p80

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Identification des partenaires protéiques de l'hélicase virale E1 du virus du papillome humain : caractérisation d'une nouvelle interaction avec la protéine à domaines WD p80

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Nanoparticules Chitosane-PEG-FA-ADN pour la thérapie génique non virale et application du gène de l’IL-1Ra dans un modèle expérimental d’arthrite rhumatoïde

La thérapie génique représente l'un des défis de la médecine des prochaines décennies dont la réussite dépend de la capacité d'acheminer l'ADN thérapeutique jusqu'à sa cible. Des structures non virales ont été envisagées, dont le chitosane, polymère cationique qui se combine facilement à l’ADN. Une fois le complexe formé, l’ADN est protégé des nucléases qui le dégradent. Le premier objectif de l'étude est de synthétiser et ensuite évaluer différentes nanoparticules de chitosane et choisir la mieux adaptée pour une efficacité de transfection sélective in vitro dans les cellules carcinomes épidermoïdes (KB). Le deuxième objectif de l'étude est d'examiner in vivo les effets protecteurs du gène de l'IL-1Ra (bloqueur naturel de la cytokine inflammatoire, l’Interleukine-1β) complexé aux nanoparticules de chitosane sélectionnées dans un modèle d'arthrite induite par un adjuvant (AIA) chez le rat. Les nanoparticules varient par le poids moléculaire du chitosane (5, 25 et 50 kDa), et la présence ou l’absence de l’acide folique (FA). Des mesures macroscopiques de l’inflammation seront évaluées ainsi que des mesures de concentrations de l’Interleukine-1β, Prostaglandine E2 et IL-1Ra humaine secrétés dans le sérum. Les nanoparticules Chitosane-ADN en présence de l’acide folique et avec du chitosane de poids moléculaire de 25 kDa, permettent une meilleure transfection in vitro. Les effets protecteurs des nanoparticules contenant le gène thérapeutique étaient évidents suite à la détection de l’IL-1Ra dans le sérum, la baisse d'expressions des facteurs inflammatoires, l’Interleukine-1 et la Prostaglandine-E2 ainsi que la diminution macroscopique de l’inflammation. Le but de cette étude est de développer notre méthode de thérapie génique non virale pour des applications cliniques pour traiter l’arthrite rhumatoïde et d’autres maladies humaines.

L’impact du polymorphisme du gène E2 sur la quantification de la charge virale du VPH-16 dans les maladies précancéreuses du col utérin

Le VPH-16 de même que certains VPH, dont le VPH-18, causent le cancer du col utérin. Son intégration dans le génome humain pourrait être un marqueur de progression de l’infection. Les charges virales totale et intégrée sont présentement mesurées en quantifiant par PCR en temps réel les gènes E6 (RT-E6) et E2 (RT-E2-1) du VPH-16. Nous avons évalué l’impact du polymorphisme du gène E2 sur la quantification de l’ADN du VPH-16 dans des spécimens cliniques. Dans un premier temps, le gène E2 de 135 isolats de VPH-16 (123 appartenaient au clade Européen et 12 à des clades non- Européens) fut séquencé. Ensuite, un test de PCR en temps réel ciblant les séquences conservées dans E2 (RT-E2-2) fut développé et optimisé. Cent trente-neuf spécimens (lavages cervicaux et vaginaux) provenant de 74 participantes (58 séropositives pour le VIH, 16 séronégatives pour le VIH) ont été étudiés avec les trois tests E2 (RT-E2-2), E6 (RT-E6) et E2 (RT-E2-1). Les ratios de la quantité d’ADN de VPH-16 mesuré avec RT-E2-2 et RT-E2-1 dans les isolats Européens (médiane, 1.02; intervalle, 0.64-1.80) et Africains 1 (médiane, 0.80; intervalle, 0.53-1.09) sont similaires (P=0.08). Par contre, les ratios mesurés avec les isolats Africains 2 (médiane, 3.23; intervalle, 1.92-3.49) ou Asiatique- Américains (médiane, 3.78; intervalle, 1.47-37) sont nettement supérieurs à ceux obtenus avec les isolats Européens (P<0.02 pour chaque comparaison). Les distributions des quantités de E2 contenues dans les 139 échantillons mesurées avec RT-E2-2 (médiane, 6150) et RT-E2-1 (médiane, 8960) étaient statistiquement différentes (P<0.0001). Nous avons observé que les charges virales totale (odds ratio (OR) OR, 2.16 95% intervalle de confiance (IC) 1.11-4.19), et épisomale du VPH-16 (OR, 2.14 95% IC 1.09-4.19), mais pas la présence de formes intégrées (OR, 3.72 95% IC 1.03-13.4), sont associées aux néoplasies intraepitheliales cervicales de haut grade (CIN-2,3), et ce, en contrôlant pour des facteurs confondants tels que l’âge, le taux de CD4 sanguin, l’infection au VIH, et le polymorphisme de VPH-16. La proportion des échantillons ayant un ratio E6/E2 > 2 pour les femmes sans lésion intraépithéliale (7 de 35) est similaire à celle des femmes avec CIN-2,3 (5 de 11, p=0.24) ou avec CIN- 1 (4 de14, P=0.65). Le polymorphisme du gène E2 est un facteur qui influence la quantification des charges intégrées de VPH-16.

Charge virale intégrée du papillomavirus de type 16 dans la maladie anale préinvasive

L’histoire naturelle de l’infection anale par le virus du papillome de type 16 (VPH-16) est mal définie pour les hommes ayant des relations sexuelles avec d’autres hommes (HARSAHs) VIH-séropositifs. Le but de cette étude était d’évaluer l’association entre la charge épisomale et intégrée du VPH-16 et la progression de la néoplasie intraépithéliale anale (AIN). Les charges épisomales et intégrées du VPH-16 furent mesurées par PCR quantitatif en temps réel sur 665 spécimens anaux obtenus de 135 hommes VPH-16-positifs participant à l’étude prospective HIPVIRG (Human Immunodeficiency and Papilloma VIrus Research Group). Le grade de l’AIN fut déterminé sur des biopsies obtenues lors des anuscopies à haute résolution périodiques. L’intégration du VPH-16 fut confirmée par DIPS-PCR pour démontrer la présence de jonctions virales-cellulaires. La charge épisomale du VPH-16 [ratio de cote (OR) 1.5, intervalle de confiance (IC) à 95%=1.1–2.1], le nombre de types de VPH [OR 1.4 (IC 95%=1.1–1.8)] et le tabagisme actuel [OR 4.8 (IC 95%=1.3–18.6)], mais non la charge intégrée, furent associés aux lésions de haut-grade (AIN-2,3) après ajustement pour l’âge et le décompte des lymphocytes CD4. La charge épisomale du VPH-16 était le seul facteur prédictif de progression de l’AIN de bas-grade (AIN-1) vers l’AIN-2,3 [OR 8.0 (IC 95%=1.2–55.4)]. Les spécimens avec une charge épisomale du VPH-16 élevée étaient moins susceptibles de contenir de l’intégration [OR 0.5 (IC 95%=0.3–0.8)]. L’intégration du VPH-16 fut détectée en absence d’AIN, dans l’AIN-1 et dans l’AIN-2,3. L’analyse des jonctions virales-cellulaires ne permit pas d’identifier un site d’intégration spécifique.

Identification et caractérisation de facteurs impliqués dans la réplication et la stabilité des génomes des organelles de plantes

Comparativement au génome contenu dans le noyau de la cellule de plante, nos connaissances des génomes des deux organelles de cette cellule, soit le plastide et la mitochondrie, sont encore très limitées. En effet, un nombre très restreint de facteurs impliqués dans la réplication et la réparation de l’ADN de ces compartiments ont été identifiés à ce jour. Au cours de notre étude, nous avons démontré l’implication de la famille de protéines Whirly dans le maintien de la stabilité des génomes des organelles. Des plantes mutantes pour des gènes Whirly chez Arabidopsis thaliana et Zea mays montrent en effet une augmentation du nombre de molécules d’ADN réarrangées dans les plastides. Ces nouvelles molécules sont le résultat d’une forme de recombinaison illégitime nommée microhomology-mediated break-induced replication qui, en temps normal, se produit rarement dans le plastide. Chez un mutant d’Arabidopsis ne possédant plus de protéines Whirly dans les plastides, ces molécules d’ADN peuvent même être amplifiées jusqu’à cinquante fois par rapport au niveau de l’ADN sauvage et causer un phénotype de variégation. L’étude des mutants des gènes Whirly a mené à la mise au point d’un test de sensibilité à un antibiotique, la ciprofloxacine, qui cause des bris double brin spécifiquement au niveau de l’ADN des organelles. Le mutant d’Arabidopsis ne contenant plus de protéines Whirly dans les plastides est plus sensible à ce stress que la plante sauvage. L’agent chimique induit en effet une augmentation du nombre de réarrangements dans le génome du plastide. Bien qu’un autre mutant ne possédant plus de protéines Whirly dans les mitochondries ne soit pas plus sensible à la ciprofloxacine, on retrouve néanmoins plus de réarrangements dans son ADN mitochondrial que dans celui de la plante sauvage. Ces résultats suggèrent donc une implication pour les protéines Whirly dans la réparation des bris double brin de l’ADN des organelles de plantes. Notre étude de la stabilité des génomes des organelles a ensuite conduit à la famille des protéines homologues des polymérases de l’ADN de type I bactérienne. Plusieurs groupes ont en effet suggéré que ces enzymes étaient responsables de la synthèse de l’ADN dans les plastides et les mitochondries. Nous avons apporté la preuve génétique de ce lien grâce à des mutants des deux gènes PolI d’Arabidopsis, qui encodent des protéines hautement similaires. La mutation simultanée des deux gènes est létale et les simples mutants possèdent moins d’ADN dans les organelles des plantes en bas âge, confirmant leur implication dans la réplication de l’ADN. De plus, les mutants du gène PolIB, mais non ceux de PolIA, sont hypersensibles à la ciprofloxacine, suggérant une fonction dans la réparation des bris de l’ADN. En accord avec ce résultat, la mutation combinée du gène PolIB et des gènes des protéines Whirly du plastide produit des plantes avec un phénotype très sévère. En définitive, l’identification de deux nouveaux facteurs impliqués dans le métabolisme de l’ADN des organelles nous permet de proposer un modèle simple pour le maintien de ces deux génomes.

Analyse des protéines cellulaires incorporées dans les particules matures du virus de l’Herpès simplex de type 1

Les virus exploitent la machinerie cellulaire de l’hôte de façon très variée et plusieurs types vont même jusqu’à incorporer certaines protéines cellulaires. Nous avons récemment effectué la première analyse protéomique du virion mature de l’Herpès simplex de type 1 (HSV-1), ce qui nous a permis de déterminer que jusqu’à 49 protéines cellulaires différentes se retrouvaient dans ce virus (Loret, S. et al. (2008). "Comprehensive characterization of extracellular herpes simplex virus type 1 virions." J Virol 82(17): 8605-18.). Afin de déterminer leur importance dans le cycle de réplication d’HSV-1, nous avons mis au point un système de criblage nous permettant de quantifier le virus produit et relâché dans le milieu extracellulaire en utilisant un virus marqué à la GFP ainsi que des petits ARN interférents (pARNi) ciblant spécifiquement ces protéines cellulaires. Cette approche nous a permis de démontrer que 17 des protéines identifiées précédemment jouaient un rôle critique dans la réplication d’HSV-1, suggérant ainsi que leur incorporation dans le virus n’est pas aléatoire. Nous avons ensuite examiné le rôle d’une de ces protéines, DDX3X (DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 3, X-linked), une protéine multifonctionnelle connue pour son implication dans les cycles de réplication de plusieurs virus humains. À l’aide de pARNi ainsi que de différentes lignées cellulaires, dont une lignée DDX3X thermosensible, nous avons démontré que l’inhibition de DDX3X résultait en une diminution du nombre de capsides intracellulaires et induisait une importante diminution de l’expression des gènes viraux. Nous avons aussi démontré que la fraction de DDX3X incorporée dans le virion contribuait activement au cycle infectieux d’HSV-1. Ces résultats confirment l’intérêt de notre approche afin d’étudier les interactions hôte-pathogène en plus de démontrer la contribution des protéines cellulaires incorporées à HSV-1 dans l’infection virale.

Évaluation de stratégies pour l'optimisation d'un vaccin à ADN contre le virus de la diarrhée virale bovine (BVDV)

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Importance des protéines cellulaires incorporées dans les virions matures d’HSV-1

Pour compléter leur cycle de vie, les virus interagissent avec de nombreux facteurs de la cellule-hôte. Le virus Herpès simplex de type 1 (HSV-1) ne fait pas exception. Une récente étude protéomique du virus effectuée par notre laboratoire a permis d’identifier 49protéines cellulaires potentiellement incorporées dans les virions matures d’HSV-1 [1]. Étant donné que certaines de ces protéines peuvent jouer des rôles importants au cours du cycle de vie du virus, elles constituent des cibles de choix pour identifier et caractériser de nouvelles interactions hôte-pathogène dans le contexte d’HSV-1. D’ailleurs le laboratoire a été effectué un criblage aux petits ARN d’interférence qui a démontré qu'au moins 15 des protéines incorporées sont impliqués dans le cycle de réplication de HSV-1 en culture cellulaire (Annexe 1). Des nombreuses études rapportent l'incorporation des protéines de l'hôte dans les virions matures mais très peu abordent l'importance de la fraction des protéines cellulaires incorporée dans les virions pour le cycle virale. Pour vérifier ça, nous avons déplété ces protéines des virions matures extracellulaires en utilisant des petits ARN d’interférence. Par la suite, nous avons utilisé ces virus déplétés pour réinfecter des cellules déplétées ou normales. Cette méthode nous a permis d'identifier pour la première fois 8 protéines (DDX3X, HSPA8, KRT10, MIF, Rab5A, Rab6A, Rab10 et 14-3-3ζ) dont l'absence dans les virions réduit la production virale d'au moins 50%. Pour mieux comprendre à quelle étape du cycle viral ces protéines sont nécessaires, nous avons aussi quantifié les virus intracellulaires, produits des cellules déplétées individuellement des quinze protéines cellulaires. Ainsi, nous avons trouvé que dans nos conditions 7 de ces 8 protéines cellulaires (DDX3X, HSPA8, KRT10, MIF, Rab5A, Rab6A et Rab10) semblent impliquées dans la production des virus intracellulaires, ce qui nous a stimulés à débuter une série de tests plus approfondis de l’entrée d’HSV-1. Les résultats préliminaires, démontrent l’implication dans l’entrée d’HSV-1 d’au moins 3 à 4 de ces protéines (HSPA8, KRT10, Rab5A et Rab10).

Facteurs de risque de sévérité de la papillomatose respiratoire juvénile

La papillomatose respiratoire récurrente (PRR) juvénile est causée par les génotypes 6 et 11 du virus du papillome humain (VPH). Cette maladie est caractérisée par des verrues récurrentes généralement au larynx. La forme sévère peut avoir un impact dévastateur sur la santé et la qualité de vie de l’enfant atteint et de sa famille en raison des conséquences des multiples chirurgies nécessaires et du risque d'obstruction des voies respiratoires. Objectif: Examiner les facteurs de risque associés aux manifestations sévères de la PRR. Méthode: Étude rétrospective des 31 cas diagnostiqués entre janvier 1995 et décembre 2008. Les données démographiques, cliniques, génétiques et virologiques ont été évaluées. Des régressions logistiques furent effectuées afin d'évaluer le rôle des variables indépendantes sur la sévérité de la maladie. Résultats: Nos données suggèrent que les facteurs de risque de sévérité de la PRR seraient associés au genre féminin (Rapport de cotes (RC)=2.60, intervalles de confiance (IC) 95% : 0.44-15.44), au fait d’être premier-né (RC=3.51, IC 95% : 0.17-72.32), à un statut économique faible (RC=5.31, IC 95% : 0.17-164.19), à un jeune âge (RC=0.83, IC 95% : 0.68-1.01), à une charge virale élevée (RC=3.81, IC 95% : 0.23-63.16) et aux condylomes chez la mère pendant la grossesse (RC=12.05, IC 95% : 0.97-149.85). Conclusion: La sévérité de la PRR serait le résultat d'une combinaison de déterminants qui favoriseraient la croissance cellulaire particulièrement chez les jeunes enfants. Des mesures préventives et thérapeutiques visant à restreindre la contamination et la réplication du virus pourraient réduire le fardeau de la maladie.

Étude de la régulation des activités transcriptionnelle, réplicative et de l’instabilité de la protéine régulatrice E2 des papillomavirus

Les papillomavirus sont de petits virus à ADN double brin qui infectent les cellules de l’épithélium de la peau et des muqueuses d’une variété de vertébrés causant des lésions bénignes telles des verrues. Certains de ces virus sont également associés au développement de lésions malignes, notamment le cancer du col utérin. La protéine régulatrice E2 des papillomavirus est impliquée dans diverses fonctions contribuant à l’établissement de l’infection par ces virus. Entre autre, E2 régule la transcription des gènes viraux, participe à l’initiation de la réplication de l’ADN viral en s’associant à l’hélicase virale E1 et est responsable du maintien et de la ségrégation de l’épisome viral au cours de la division cellulaire. Toutes ces activités sont attribuables à la capacité de E2 à s’associer au génome viral et à interagir avec des protéines virales et cellulaires. De plus, ces fonctions sont elles-mêmes régulées par des modifications post-traductionnelles de la protéine E2. Plusieurs études ont été réalisées afin de découvrir les mécanismes de régulation des fonctions de E2 mais le rôle exact des différents domaines de E2 dans ces contrôles reste à être défini. En premier lieu, nous nous sommes intéressés à l’interaction entre E2 et Brd4(L) qui avait été définie comme étant essentielle à la ségrégation de l’épisome. Plusieurs caractéristiques associées à la protéine Brd4(L) telles que sa capacité à lier les lysines acétylées des histones, son interaction avec le complexe Mediator et sa participation à l’activation de la transcription en formant un complexe avec pTEFb, nous ont permis d’émettre l’hypothèse que l’interaction E2-Brd4(L) est nécessaire à l’activité transcriptionnelle de E2. Nous avons démontré que la protéine Brd4(L) interagit avec le domaine de transactivation de E2 de divers types de papillomavirus. De plus, cette interaction implique les résidus de E2 essentiels à son activité transcriptionnelle. Ainsi, ces résultats proposent que l’association E2-Brd4(L) serve à la régulation de la transcription des gènes viraux. Dans un second temps, nos recherches se sont concentrées sur l’existence d’une interface de dimérisation au sein du domaine de transactivation de E2 et de son implication dans les activités transcriptionnelles et réplicatives de la protéine. Nos études ont aussi mis en évidence que l’intégrité de la structure de ce domaine contribue au bon fonctionnement de la réplication du génome viral. Cette découverte suggère que la dimérisation de E2 peut réguler l’initiation de la réplication et propose l’existence d’un niveau de régulation additionnel impliquant l’état de la structure quaternaire de la protéine E2 et une modulation de l’interaction entre E1 et E2 à cette étape du cycle viral. Finalement, l’étude de l’instabilité de la protéine E2 nous a permis de définir une région importante dans le domaine flexible de la protéine, nécessaire à sa dégradation par le protéasome. De plus, la présence de résidus conservés localisés dans ce domaine, sont associés à la dégradation et portent la signature d’un signal de localisation nucléaire de type PY-NLS, suggérant que la stabilité de la protéine E2 est régulée par sa localisation au sein de la cellule. Ces études démontrent l’existence de nouvelles stratégies de régulation des activités transcriptionnelle et réplicative de la protéine E2 des papillomavirus. La compréhension de ces mécanismes nous permet de mieux cerner les étapes favorisant l’établissement et la progression du cycle viral et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques contre les infections aux papillomavirus.

Charge virale des papillomavirus et transmission entre partenaires

L’histoire naturelle et la progression des infections au VPH (virus du papillome humain) sont bien décrites. Cependant, la dynamique de transmission reste faiblement documentée. Une meilleure compréhension de la dynamique de transmission ainsi que de ses facteurs de risque permettrait d’optimiser les stratégies de prévention afin de réduire la prévalence de ces infections dans la population par la vaccination et les méthodes contraceptives. Notre étude vise à déterminer si la charge virale des infections au VPH influence leur transmission entre les partenaires sexuels. Pour ce faire, l’association entre la charge virale au niveau des organes génitaux et la concordance spécifique de type des infections prévalentes au VPH a été évaluée pour 250 couples hétérosexuels récemment formés. Les charges virales de VPH16 (r = 0.30), de VPH18 (r = 0.50) et de VPH51 (r = 0.19) étaient significativement corrélées (p < 0.05) entre les deux partenaires sexuels, contrairement à celles de VPH31 (r = 0.08) et de VPH42 (r = -0.1). Lorsqu’ajusté en fonction de l’âge des participants, une charge virale élevée augmentait significativement le taux de détection du même type chez le partenaire pour les types 16, 31 et 51. Ainsi, dans les couples hétérosexuels récemment formés, des charges virales élevées sont associées à une détection accrue du même type chez le partenaire sexuel.

Caractérisation de la fonction de la protéine cellulaire p80/UAF1 dans la réplication du génome du virus du papillome humain

Le virus du papillome humain (VPH) est l’agent étiologique du cancer du col utérin, ainsi que d’autre néoplasies anogénitales et des voies aérodigestives supérieures. La réplication de son génome d’ADN double brin est assurée par les protéines virales E1 et E2, de concert avec la machinerie cellulaire de réplication. E1 assure le déroulement de l’ADN en aval de la fourche de réplication, grâce à son activité hélicase, et orchestre la duplication du génome viral. Nos travaux antérieurs ont démontré que le domaine N-terminal de E1 contient un motif de liaison à la protéine cellulaire p80/UAF1 qui est hautement conservé chez tous les VPH anogénitaux. L’intégrité de ce motif est essentielle au maintien de l’épisome viral. Les travaux présentés dans cette thèse ont d’abord déterminé que le motif de liaison à UAF1 n’est pas requis pour l’assemblage du pré-réplisome viral, mais important pour la réplication subséquente de l’ADN du VPH. Nous avons constaté qu’en présence de E1 et E2, UAF1 est relocalisé dans des foyers nucléaires typiques de sites de réplication du virus et qu’en outre, UAF1 s’associe physiquement à l’origine de réplication du VPH. Nous avons aussi déterminé que l’inhibition du recrutement de UAF1 par la surexpression d’un peptide dérivé de E1 (N40) contenant le motif de liaison à UAF1 réduit la réplication de l’ADN viral. Cette observation soutient le modèle selon lequel UAF1 est relocalisé par E1 au réplisome pour promouvoir la réplication de l’ADN viral. UAF1 est une protéine à domaine WD40 n’encodant aucune activité enzymatique et présumée exploiter des interactions protéine-protéine pour accomplir sa fonction. Nous avons donc investigué les protéines associées à UAF1 dans des cellules du col utérin et avons détecté des interactions avec les enzymes de déubiquitination USP1, USP12 et USP46, ainsi qu’avec la phosphatase PHLPP1. Nous avons établi que E1 forme un complexe ternaire avec UAF1 et n’importe laquelle des USP associés : USP1, USP12 ou USP46. Ces USP sont relocalisés au noyau par E1 et s’associent à l’ADN viral. De plus, l’activité enzymatique des USP est essentielle à la réplication optimale du génome viral. Au contraire, PHLPP1 ne forme pas de complexe avec E1, puisque leurs interactions respectives avec UAF1 sont mutuellement exclusives. PHLPP1 contient un peptide de liaison à UAF1 homologue à celui de E1. Ce peptide dérivé de PHLPP1 (P1) interagit avec le complexe UAF1-USP et, similairement au peptide N40, antagonise l’interaction E1-UAF1. Incidemment, la surexpression du peptide P1 inhibe la réplication de l’ADN viral. La génération de protéines chimériques entre P1 et des variants de E1 (E1Δ) défectifs pour l’interaction avec UAF1 restaure la capacité de E1Δ à interagir avec UAF1 et USP46, ainsi qu’à relocaliser UAF1 dans les foyers nucléaires contenant E1 et E2. Ce recrutement artificiel de UAF1 et des USP promeut la réplication de l’ADN viral, un phénotype dépendant de l’activité déubiquitinase du complexe. Globalement, nos travaux suggèrent que la protéine E1 du VPH interagit avec UAF1 afin de recruter au réplisome un complexe de déubiquitination dont l’activité est importante pour la réplication de l’ADN viral.