Investigation of plasmodiophora brassicae (clubroot disease) in vegetable brassica using arabidopsis thaliana as a model system

Clubroot, caused by Plasmodiophora brassicae, is the most devastating soil-borne disease of vegetable brassicas. It occurs all over the world and is responsible for crop losses of up to 10% every year. In Australia, the disease is being managed effectively with chemicals and cultural practices, but ideally control can be improved in the long term by the introduction of resistant cultivars. The life cycle ofP. brassicae and mode of action of plant resistance has not been fully elucidated because of the technical difficulties of working with an obligate, soil-borne plant pathogen. However, Arabidopsis thaliana, which is a host ofP. brassicae, has great potential as a model system for studying the life cycle, the infection process and development of resistance. We have developed a sand-liquid-culture system for growing Arabidopsis that allows easy observation of all life stages and, most importantly, the primary plasmodial stages within the root hair. The method was first optimised for observations of the lifecycle of the pathogen in a susceptible Arabidopsis ecotype (Col-3) where all stages of the lifecycle have now been observed and characterised. Further screening of Arabidopsis ecotypes for disease resistance has utilised one of the most virulent Australian pathotypes of brassica (ECD number 16/19/31). To date, Arabidopsis ecotype Ta-0 has shown a level of tolerance to the disease even though the roots get infected. It has been reported earlier that resistance toP. brassicae in Arabidopsis is due to one or a small number of genes. To examine changes in gene expression during the early, critical stages of infection, RNA was extracted from the susceptible and resistant ecotypes at two time points, 4 days and 17 days after inoculation. Microarray analysis will be used to investigate genome wide changes in gene expression during infection but also to identify candidate genes that may confer resistance to Australian isolates of the pathogen.

The role of oomycete effectors in plant–pathogen interactions

Plants constantly come into contact with a diverse range of microorganisms that are potential pathogens, and they have evolved multi-faceted physical and hemical strategies to inhibit pathogen ingress and establishment of disease. Microbes, however, have developed their own strategies to counteract plant defence responses. Recent research on plant–microbe interactions has revealed that an important part of the infection strategies of a diverse range of plant pathogens, including bacteria, fungi and oomycetes, is the production of effector proteins that are secreted by the pathogen and that promote successful infection by manipulating plant structure and metabolism, including interference in plant defence mechanisms. Pathogen effector proteins may function either in the extracellular spaces within plant tissues or within the plant cell cytoplasm. Extracellular effectors include cell wall degrading enzymes and inhibitors of plant enzymes that attack invading pathogens. Intracellular effectors move into the plant cell cytoplasm by as yet unknown mechanisms where, in incompatible interactions, they may be recognised by plant resistance proteins but where, in compatible interactions, they may suppress the plant’s immune response. This article presents a brief overview of our current understanding of the nature and function of effectors produced by oomycete plant pathogens.

Expressão de uma quitinase de Metarhizium anisopliae em Nicotiana tabacum : obtenção de plantas transgênicas resistentes a doenças fúngicas

A resistência a doenças em plantas transgênicas tem sido obtida por meio da expressão de genes isolados de bactérias, fungos micoparasitas e plantas. Neste trabalho, relatamos a utilização de um gene do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. O gene chit1 codifica a quitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), pertencente a uma classe de glicosil-hidrolases capazes de converter quitina em oligômeros de N-acetil-glicosamina (NAcGlc). Quando presentes em tecidos vegetais, supõese que as quitinases ataquem especificamente a parede celular de fungos invasores, provocando danos às hifas e causando a morte por lise das células fúngicas. Deste modo, dois diferentes grupos de plantas transgênicas de Nicotiana tabacum foram produzidos: no primeiro deles, denominado chitplus, os indivíduos possuem o gene chit1 sob o controle do promotor CaMV 35S. O segundo grupo, demoninado chitless, consiste de plantas transformadas com um T-DNA não contendo o gene do fungo. Trinta e quatro plantas transgênicas resistentes à canamicina (17 de cada grupo) foram regeneradas a partir de discos de folhas infectados por Agrobacterium tumefaciens. A produção da quitinase em extratos protéicos de folhas foi analisada por zimogramas em SDS-PAGE contendo glicol-quitina e corados por calcoflúor branco, na forma de um screening dos transgênicos primários. As plantas transgênicas foram testadas, ainda, por meio de ensaios colorimétricos empregando oligômeros sintéticos de NAcGlc como substratos específicos, além de immunoblot e Western blot com soro anti-quitinase. A quantidade de enzima recombinante nas plantas chitplus variou desde nenhuma atividade detectável a elevados níveis de expressão da enzima. A hibridização de Southern blot demonstrou que o número de cópias do gene chit1 integradas no genoma vegetal foi estimado entre uma e quatro. A primeira geração de plantas transgênicas geradas por autofecundação de parentais portadores de duas cópias do transgene foi testada com relação à estabilidade da herança do transgene e em 43 de um total de 67 descendentes, originados de quatro cruzamentos independentes, o padrão de segregação não diferiu das proporções Mendelianas esperadas. Ensaios de resistência, desafiando as plantas transgênicas com o basidiomiceto Rhizoctonia solani foram realizados e uma evidente diminuição da área foliar contendo lesões fúngicas foi observada entre as linhagens transgênicas, embora variações na atividade quitinolítica tenham influenciado o nível de resistência. Nossos resultados sugerem uma relação direta entre a atividade específica de quitinase e ao aumento nos níveis de resistência às lesões causadas pela infecção por R. solani.

Avaliação da eficiência de co-transformação de soja (Glycine max (L.) Merrill) via bombardeamento de partículas utilizando um gene de seleção e um gene de interesse em plamídeos diferentes

Visando aumentar a resistência a moléstias fúngicas, o presente trabalho teve como objetivo introduzir um gene (chit1) que codifica uma quitinase do fungo Metarhizium anisopliae em cultivares de soja [Glycine max (L.) Merrill]. A co-transformação foi a estratégia escolhida, visando a obtenção de plantas livres de transgenes marcadores na progênie das plantas transformadas. A co-transformação foi realizada via biolística, tendo como tecido-alvo conjuntos de embriões somáticos globulares das cultivares MG/BR46 Conquista e IAS-5. O plasmídeo pGusHyg, que contém o gene repórter gusA e o gene marcador hpt, foi bombardeado concomitantemente com o plasmídeo pMOG463chit1, que porta o gene chit1. Os conjuntos de embriões bombardeados foram transferidos para meio seletivo contendo higromicina, visando a obtenção de material estavelmente transformado. Os conjuntos embriogênicos higromicina-resistentes foram transferidos seqüencialmente para meios de proliferação D-20 (sem higromicina), maturação e regeneração. No total, foram obtidos 387 e 380 embriões histodiferenciados das cultivares MG/BR46 Conquista e IAS-5, respectivamente. Plantas transgênicas adultas e férteis foram regeneradas. Para avaliar a eficiência da estratégia de cotransformação, foram realizadas análises moleculares de embriões histodiferenciados e de plantas regeneradas. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram o cálculo da taxa de co-transformação de 44% para os embriões histodiferenciados da cultivar MG/BR46 Conquista e de 50% para plantas de IAS-5. Não existem, até o momento, relatos de trabalhos em soja utilizando embriões somáticos globulares em proliferação como alvo para estudos de co-transformação.

Resistência de genótipos de batata (Solanum spp.) a Diabrotica speciosa (Germar, 1824) (Coleoptera: Chrysomelidae)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Preferência alimentar de Dione juno juno (Cramer) por genótipos de maracujazeiro e avaliação do uso de extratos aquosos

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Preferência para oviposição de Bemisia tabaci (Genn.) biótipo B (Hemiptera: Aleyrodidae) em genótipos de soja, sob condições de campo

Dez genótipos de soja: IAC 100, IAC 74-2832, IAC 90-2971, IAC 78-2318, PI 227687, PI 229358, PI 274454, BR-82 12547, MG/BRS-68 (Vencedora) e FT-5 (Formosa), foram avaliados quanto a resistência, do tipo não-preferência para oviposição, à mosca-branca, Bemisia tabaci (Genn.) biótipo B. O ensaio foi realizado no campo experimental da FCAV/UNESP, Jaboticabal-SP, de outubro de 1999 a janeiro de 2000. Pretendeu-se, ainda, verificar a preferência de oviposição da referida espécie em relação às folhas unifolioladas e trifolioladas, e quanto à posição do folíolo na folha trifoliolada, e estabelecer o número mínimo de folíolos necessários para amostrar adequadamente a oviposição da mosca branca. Constatou-se que a oviposição foi menor nos genótipos BR-82 12547 e IAC 74-2832 em todas as avaliações (15, 30, 45, 65 e 85 dias após a emergência das plantas). As maiores taxas de oviposição ocorreram em IAC 90-2971, IAC 100, PI 227687 e PI 274454. O número médio de ovos depositados por seção de folha pelas fêmeas de B. tabaci biótipo B nas folhas trifolioladas não diferiu significativamente dos obtidos nas unifolioladas, 15 dias após a emergência das plantas (estádios de desenvolvimento entre V3 e V5), em 70% dos genótipos. Quanto à posição dos folíolos, a mosca-branca ovipositou indistintamente sobre os folíolos mediano e laterais. Também o número médio de ovos depositados por área foliar, pela mosca-branca, nos três folíolos da folha trifoliolada não diferiu significativamente da média obtida para dois ou um folíolo desta, o que sugere ser, um folíolo, uma unidade amostral representativa da oviposição de B. tabaci biótipo B em soja.

FLUTUAÇÃO POPULACIONAL DE Dione juno juno (Cramer, 1779) (Lepidoptera: Nymphalidae) em MARACUJAZEIROS (Passiflora spp.), MÉTODOS DE AMOSTRAGEM E RESISTÊNCIA DE GENÓTIPOS

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Feeding non-preference by Spodoptera frugiperda and Spodoptera eridania on tomato genotypes

Lagartas do gênero Spodoptera spp. são altamente polífagas, podendo causar danos econômicos em diversas culturas agrícolas. em vista de sua emergente importância na cultura do tomate, principalmente o destinado à indústria, este trabalho teve por objetivo avaliar a não preferência, para alimentação, de lagartas de Spodoptera frugiperda (J. E. Smith, 1797) e Spodoptera eridania (Cramer, 1782) por genótipos de tomateiro, e classificá-los quanto aos graus de resistência. Como padrão susceptível, utilizou-se o cultivar comercial Santa Clara e, como resistente, a linhagem PI 134417, sendo avaliadas, ainda, as linhagens PI 134418, PI 126931, LA 462 e LA 716. Realizaram-se testes de não preferência, para alimentação, com e sem chance de escolha, avaliando-se a atratividade dos genótipos de tomateiro para as lagartas, em tempos pré-estabelecidos após sua liberação, além da massa foliar consumida. em geral, os genótipos LA 716 e PI 126931 foram os menos atrativos para a S. frugiperda, enquanto Santa Clara foi o mais atrativo e consumido. Quanto a S. eridania, os genótipos PI 126931, LA 462, LA 716 e PI 134418 foram os menos preferidos, para a alimentação, pelas lagartas, e Santa Clara e PI 134417 foram os mais atrativos e consumidos. Os genótipos LA e PI 126931 são moderadamente resistentes, do tipo não preferência para alimentação, para a S. frugiperda e S. eridania; PI 134418 e LA 462 são moderadamente resistentes a S. eridania; PI 134417 é susceptível a S. frugiperda e S. eridania; Santa Clara é altamente susceptível a S. frugiperda e S. eridania.

Adult attractiveness and oviposition preference of Bemisia tabaci (Genn.) (Homoptera: Aleyrodidae) B-biotype in cotton genotypes

Considerada importante praga do algodoeiro, a mosca-branca Bemisia tabaci biótipo B pode através de sua alimentação, diminuir o vigor das plantas, trasmitir vírus e prejudicar a qualidade da fibra. Visando avaliar a resistência de genótipos de algodoeiro, Gossypium hirsutum (L.), à mosca-branca Bemisia tabaci biótipo B, realizaram-se testes de atratividade e não-preferência para oviposição, com e sem chance de escolha, em telado, a temperatura ambiente. Verificou-se baixa atratividade das plantas dos genótipos Fabrika, CNPA Ita 90, Makina, Coodetec 407 e IAC 01-639 CPA 02-24 a adultos dessa mosca-branca, o que pode representar um componente de resistência destes materiais genéticos ao inseto. Os genótipos BRS Aroeira, Coodetec 406, Fabrika e Coodetec 401 apresentaram resistência do tipo não-preferência para oviposição, nos testes com e sem chance de escolha. Os números de tricomas e de glândulas de gossipol por cm² não foram adequados para se avaliar a não-preferência para oviposição de adultos da mosca-branca em genótipos de algodoeiro.

Influência de genótipos de couve (Brassica oleracea L. var. acephala DC.) na biologia de Plutella xylostella (L., 1758) (Lepidoptera: Plutellidae)

Objetivou-se, com este trabalho, avaliar a influência de alguns genótipos de couve (Brassica oleracea L. var. acephala DC.) no desenvolvimento de Plutella xylostella (L., 1758) (Lepidoptera: Plutellidae). Os genótipos avaliados foram: Manteiga de Ribeirão Pires I-2620, Roxa I-919, Manteiga de São José, Manteiga de Monte Alegre, Pires 2 de Campinas, Couve Comum, Couve de Arthur Nogueira 2, Couve de Arthur Nogueira 1. Lagartas recém-eclodidas foram mantida em discos foliares de 8 cm de diâmetro para cada genótipo. Foram analisados os seguintes parâmetros: duração e viabilidade das fases larval e pupal, longevidade e fecundidade de adultos, utilizando análises paramétricas e de agrupamentos para interpretação dos dados. Observou-se um prolongamento em dias no ciclo de P. xylostella, aumento no peso de pupa e maiores valores de viabilidade e fecundidade, durante a segunda geração. O genótipo Couve de Arthur Nogueira 2 foi menos favorável ao desenvolvimento de P. xylostella nas duas gerações, e Couve Comum demonstrou maior influência negativa ao inseto na segunda geração. Manteiga de Ribeirão Pires I-2620 foi o mais suscetível nas duas gerações, agrupando com este na segunda geração Pires 2 de Campinas e Manteiga de São José.

Determinação dos tipos de resistência em genótipos de feijoeiro ao ataque de Zabrotes subfasciatus (Coleoptera: Bruchidae)

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Preferência alimentar de adultos de Diabrotica speciosa (Germar) (Coleoptera: Chrysomelidae) por genótipos de batata (Solanum spp.)

Avaliou-se a preferência alimentar de adultos de Diabrotica speciosa (Germar), pelos genótipos de batata Achat, Baronesa, Monalisa, N 140-201 e NYL 235-4. Foram realizados ensaios com e sem chance de escolha, em laboratórios e em casa de vegetação, na FCAV/UNESP, Jaboticabal, SP. em dois testes utilizaram-se discos de folíolos provenientes de plantios em vaso (plantas com 40 dias); em outros seis semelhantes (exceção ao genótipo N 140-201) foram utilizados discos de folíolos provenientes de plantio de campo (plantas com 30, 50 e 70 dias). Nas placas de Petri (repetições) foram liberados dois adultos/disco. Dois outros ensaios foram efetuados em gaiolas (sem chance de escolha), no interior de casa de vegetação, com plantas com 15 e 45 dias de idade, liberando-se três e 10 adultos/planta respectivamente, avaliando-se o consumo de área foliar quatro e cinco dias após. Nos testes em laboratório com material de vaso, o genótipo NYL 235-4 (com e sem chance) foi o menos consumido (1,08 a 1,12 mg de peso seco). Com material de campo (com e sem chance), o peso de matéria fresca consumida pela praga foi menor em NYL 235-4 (médias de 26,2 e 66,1 mg) e Baronesa (30,2 e 57,9 mg). Nos ensaios em gaiolas (sem chance) também verificou-se menor consumo em NYL 235-4 (3,35 cm² e 16,70 cm²/planta). Esses resultados revelam que o genótipo NYL 235-4 apresenta resistência do tipo não-preferência para alimentação em relação a D. speciosa.

Resistência e mecanismos envolvidos em genótipos de milho em relação ao ataque do gorgulho, Sitophilus zeamais Mots. (Coleoptera: Curculionidae)

A resistência de 30 genótipos de milho ao ataque de Sitophilus zeamais Mots. foi avaliada em teste sem chance de escolha, sendo efetuada uma seleção de 10 deles (M 9560, XHT 12, A 952, AG 5011, X 9557, Z 8452, C 615, C 435, DINA 888, C 606), os quais foram submetidos ao teste com chance de escolha, avaliando-se a atratividade e a preferência para oviposição. Pelos resultados concluiu-se que os genótipos menos atrativos foram Z 8452 (3,1%) e M 9560 (3,2%), enquanto o mais atrativo foi C 615 (24,7%). Os genótipos que apresentaram resistência do tipo não-preferência para oviposição foram A 952, M 9560 e XHT 12 com números médios de 2,0; 3,0 e 3,4 ovos por recipiente. A resistência do tipo não-preferência para alimentação e/ou antibiose foi observada nos genótipos M 9560, A 952 e Z 8452. Os genótipos com alta suscetibilidade ao gorgulho foram C 435, C 444, C 606 e AG 8010.

Resistência de genótipos de sorgo a Contarinia sorghicola (Coq.) (Diptera: Cecidomyiidae) e Diatraea saccharalis (Fabr.) (Lepidoptera: Pyralidae) e influência sobre parasitóides

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)