Étude du rôle de l’auto-antigène nucléaire centromérique B (CENP-B) et des auto-anticorps anti-CENP-B dans l’activation des cellules musculaires lisses vasculaires : implication potentielle dans la pathophysiologie de la sclérose systémique

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune dont l’un des principaux auto-anticorps, dirigé contre la protéine centromérique B (CENP-B), est fortement associé à l’hypertension artérielle pulmonaire, l’une des causes majeures de décès dû à la ScS. L’hypertension résulte de l’occlusion progressive des vaisseaux suite à une hyperactivation des cellules musculaires lisses (CML) de la paroi vasculaire. Cependant, les facteurs responsables de ce remodelage vasculaire restent inconnus. Plusieurs études récentes ont démontré que certains auto-antigènes possèdent des fonctions biologiques additionnelles lorsqu'ils se retrouvent dans le milieu extracellulaire. En effet, une fois libérés par nécrose ou apoptose, ces auto-antigènes adoptent une activité biologique qui s'apparente à celles des cytokines et peuvent ainsi participer aux processus normaux de réparation de blessure et/ou acquérir une activité pathogène qui contribue au développement de certaines maladies auto-immunes. Nos résultats suggèrent que la CENP-B peut être ajoutée à cette liste de molécules bifonctionnelles. À l'aide des techniques d'immunofluorescence, d'ELISA cellulaire et de cytométrie en flux, nous avons démontré que la CENP-B se liait spécifiquement à la surface des CML vasculaire de l’artère pulmonaire avec une plus grande affinité pour le phénotype contractile que synthétique. Cette liaison provoquait la migration des cellules ainsi que la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine 6 et 8. Les mécanismes par lesquels la protéine exerçait ces effets impliquaient la phosphorylation de FAK et Src ainsi que la voie des MAP kinases, avec ERK1/2 et p38. Des études de signalisation intracellulaire effectuées à l’aide de plusieurs inhibiteurs spécifiques ainsi que des études de désensibilisation nous ont permis d’identifier le récepteur de la CENP-B en plus d’identifier les mécanismes complets de sa signalisation membranaire. Nous avons démontré que la CENP-B se liait de manière spécifique aux CML vasculaire via le récepteur de chémokine 3 (CCR3) pour ensuite transactiver le récepteur EGF, selon un mécanisme métalloprotéase-dépendant qui implique le relargage du HB-EGF. Cette transactivation est un processus important dans l’activation de la voie des MAP kinases ainsi que dans la sécrétion d’IL-8 induite par la CENP-B. Finalement, nous avons démontré que les auto-anticorps anti-CENP-B pouvaient abolir cette cascade de signalisation, empêchant ainsi la CENP-B d’exercer son rôle de cytokine. L’identification de la CENP-B comme ligand du CCR3 ouvre donc plusieurs perspectives quant à l’étude du rôle pathogène des auto-anticorps anti-CENP-B dans la ScS.

Isolation, culture et caractérisation phénotypique de cellules musculaires lisses endobronchiques équines.

Le muscle lisse endobronchique est l’un des acteurs principaux de l’asthme. La description de ces caractéristiques phénotypiques reste cependant très elliptique, notamment à cause de la difficulté inhérente à l’échantillonnage. Le cheval offre un large champ d’investigation en raison de sa taille et un modèle d’asthme pertinent en regard de la similitude entre asthme et souffle. La technique de culture et de caractérisation du muscle lisse a été mise au point à partir de muscle lisse trachéal. Ce modèle a ensuite été transposé et réalisé à partir de biopsies endobronchiques chez le cheval. Les cellules du muscle lisse ont été isolées, mises en culture puis caractérisées par immunofluorescence, cytométrie de flux et immunobuvardage. Le maintien du phénotype contractile en culture restant un défi dans l’établissement d’un modèle d’asthme réaliste. Suite à l’isolement des cellules musculaires lisses à partir de muscle lisse trachéal équin et leur mise en culture en présence de 10% de FBS pendant 7 passages, 96.4% des cellules expriment l’α-smooth muscle-actine (α-sm-actine), tandis que 83.8% et 77% expriment la desmine et la myosine respectivement. Les cellules musculaires lisses issues de biopsies endobronchiques expriment après 7 passages à 84% l’α-sm-actine, à 57% la desmine et 69% la myosine. Ces résultats ont été obtenus par immunofluorescence et immunobuvardage. Le pourcentage de cellules exprimant les protéines d’intérêt, tout comme l’intensité moyenne de fluorescence ne présentent pas de variation significative ni entre le 4ième et le 7ième passage, ni avec la caractérisation initiale, lors du premier passage. Cette étude suggère qu’il est possible de maintenir le phénotype contractile en culture sur plastique en présence de 10% de FBS, et que les biopsies endobronchiques sont un support d’étude valable pour de futures investigations concernant le rôle du muscle lisse et ses caractéristiques.

Les cellules endothéliales peuvent acquérir un phénotype mésenchymateux associé avec l’expression de la protéine nestine dans un modèle d’hypertrophie cardiaque et de fibrose réactive

L’hypertrophie cardiaque représente la réponse primaire du cœur dans le but d’améliorer la fonction cardiaque qui est compromise suite à un accident ischémique ou une surcharge hémodynamique. Cependant, l’hypertrophie cardiaque a pour conséquence pathologique la fibrose réactive, qui est caractérisée par la synthèse incontrôlée et le dépôt du collagène par les myofibroblastes. Ainsi, l’accumulation accrue du collagène dans le cœur hypertrophié mène à l’augmentation de la rigidité cardiaque et la détérioration progressive de la fonction contractile du cœur. Plusieurs études ont démontré que la protéine nestine, appartenant à la famille des filaments intermédiaires, est ré-exprimée dans les myofibroblastes durant la fibrose réparative et est impliquée dans la prolifération cellulaire. Basée sur ces observations, cette étude teste l’hypothèse selon laquelle nestine est induite dans les myofibroblastes suivant le développement de la fibrose réactive dans le cœur des rats ayant subi une constriction aortique supra-rénale. Deux semaines suivant une constriction aortique supra-rénale chez le rat, un patron d’hypertrophie concentrique cardiaque a été observé et associé avec une réponse de fibrose réactive caractérisée par le dépôt accru de collagène dans le tissu interstitiel et la région péri-vasculaire de nombreux vaisseaux sanguins cardiaques. De plus, les niveaux de la protéine nestine sont augmentés significativement dans les cœurs des rats hypertrophiés, et ce, de façon corrélative avec la pression artérielle moyenne et la pression systolique du ventricule gauche. Les techniques d’immunofluorescences ont révélé une apparition accrue des cellules immunoréactives à nestine, qui présentent un phénotype mésenchymateux caractérisé par la co-expression de collagène dans le tissu interstitiel et la région péri-vasculaire des cœurs hypertrophiés. Ces données suggèrent que les fibroblastes résidents peuvent exprimer la protéine nestine ou que l’expression de nestine est induite en réponse aux facteurs pro-fibrotiques impliqués dans la fibrose réactive. En effet, l’exposition des myofibroblastes normaux et des myofibroblastes isolés des cœurs hypertrophiés à l’AII, TGF-B1 et EGF augmente significativement l’expression de la protéine nestine, tandis que l’expression de l’α-SMA demeure inchangée. De plus, de manière prédominante dans le cœur hypertrophié, des cellules non-vasculaires CD31(+) ont été détectées dans le tissu interstitiel et la région péri-vasculaire. Ces cellules co-expriment nestine et collagène suggérant une transition des cellules endothéliales vers un phénotype mésenchymateux. Finalement, la protéine nestine, sous sa forme filamenteuse, a été détectée dans les cellules endothéliales de l’artère coronaire humaine et leur exposition au TGF-B1, induit l’expression de collagène. En revanche, l’expression de collagène a été détectée dans les cellules microvasculaires de rats CD31(+), alors que l’expression de nestine est absente. En réponse aux traitements de TGF-B1 et EGF, l’expression de nestine, sous sa forme non-filamenteuse, est détectée dans les cellules microvasculaires de rats. Collectivement, ces données supportent la prémisse selon laquelle la réponse de fibrose réactive dans les cœurs hypertrophiés, suite à une constriction aortique supra-rénale, est attribuée en partie à l’augmentation de l’apparition des cellules mésenchymateuses positives à l’expression de nestine qui proviennent des fibroblastes résidents du ventricule. De plus, les données in vivo et in vitro suggèrent que les cellules endothéliales déplacées représentent une source additionnelle des cellules mésenchymateuses nestine(+) dans le cœur hypertrophié et contribuent au développement de la fibrose réactive. Cibler la protéine nestine peut représenter une approche thérapeutique afin d’atténuer la réponse de fibrose réactive indépendamment de l’origine des cellules mésenchymateuses.

(-)-CGP12177 increases contractile force through beta1l-adrenoceptors but not through beta3-adrenoceptors in human right atrial myocardium

(-)-CGP12177 is a non-conventional partial agonist that causes modest and transient increases of contractile force in human atrial trabeculae (Kaumann and Molenaar, 2008). These effects are markedly increased and maintained by inhibition of phosphodiesterase PDE3. As verified with recombinant receptors, the cardiostimulant effect of (-)-CGP12177 is mediated through a site at the beta1-adrenoceptor with lower affinity (beta1LAR) compared to the site through which (-)-CGP12177 antagonizes the effects of catecholamines (beta1HAR). However, in a recent report it was proposed that the positive inotropic effects of CGP12177 are mediated through beta3-adrenoceptors (Skeberdis et al 2008). We therefore investigated whether the effects of (-)-CGP12177 on human atrial trabeculae are antagonized by the beta3-adrenoceptor-selective antagonist L-748,337 (1 microM). (-)-CGP12177 (200 nM) caused a stable increase in force which was significantly reduced by the addition of (-)-bupranolol (1 microM), P = 0.002, (basal 4.45 ± 0.78 mN, IBMX (PDE inhibitor) 5.47 ± 1.01 mN, (-)-CGP12177 9.34 ± 1.33 mN, (-)-bupranolol 5.79 ± 1.08 mN, n = 6) but not affected by the addition of L-748,337 (1 microM), P = 0.12, (basal 4.48 ± 1.32 mN, IBMX 7.15 ± 2.28 mN, (-)-CGP12177 12.51 ± 3.71 mN, L-748,337 10.90 ± 3.49 mN, n = 6). Cumulative concentration-effect curves for (-)-CGP12177 were not shifted to the right by L-748,337 (1 microM). The –logEC50M values of (-)-CGP12177 in the absence and presence of L-748,337 were 7.21±0.09 and 7.41±0.13, respectively (data from 25 trabeculae from 8 patients, P=0.2) The positive inotropic effects of (-)-CGP12177 (IBMX present) were not antagonized by L-748,337 but were blunted by (-)-bupranolol (1 microM). The results rule out an involvement of beta3-adrenoceptors in the positive inotropic effects (-)-CGP12177 in human right atrial myocardium and are consistent with mediation through beta1LAR. Kaumann A and Molenaar P (2008) Pharmacol Ther 118, 303-336 Skeberdis VA et al (2008) J Clin Invest, 118, 3219-3227

Interaction of contractile activity and training history on mRNA abundance in skeletal muscle from trained athletes

Skeletal muscle displays enormous plasticity to respond to contractile activity with muscle from strength- (ST) and endurance-trained (ET) athletes representing diverse states of the adaptation continuum. Training adaptation can be viewed as the accumulation of specific proteins. Hence, the altered gene expression that allows for changes in protein concentration is of major importance for any training adaptation. Accordingly, the aim of the present study was to quantify acute subcellular responses in muscle to habitual and unfamiliar exercise. After 24-h diet/exercise control, 13 male subjects (7 ST and 6 ET) performed a random order of either resistance (8 × 5 maximal leg extensions) or endurance exercise (1 h of cycling at 70% peak O2 uptake). Muscle biopsies were taken from vastus lateralis at rest and 3 h after exercise. Gene expression was analyzed using real-time PCR with changes normalized relative to preexercise values. After cycling exercise, peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α (ET ∼8.5-fold, ST ∼10-fold, P < 0.001), pyruvate dehydrogenase kinase-4 (PDK-4; ET ∼26-fold, ST ∼39-fold), vascular endothelial growth factor (VEGF; ET ∼4.5-fold, ST ∼4-fold), and muscle atrophy F-box protein (MAFbx) (ET ∼2-fold, ST ∼0.4-fold) mRNA increased in both groups, whereas MyoD (∼3-fold), myogenin (∼0.9-fold), and myostatin (∼2-fold) mRNA increased in ET but not in ST (P < 0.05). After resistance exercise PDK-4 (∼7-fold, P < 0.01) and MyoD (∼0.7-fold) increased, whereas MAFbx (∼0.7-fold) and myostatin (∼0.6-fold) decreased in ET but not in ST. We conclude that prior training history can modify the acute gene responses in skeletal muscle to subsequent exercise.

Consecutive bouts of diverse contractile activity alter acute responses in human skeletal muscle

We examined acute molecular responses in skeletal muscle to divergent exercise stimuli by combining consecutive bouts of resistance and endurance exercise. Eight men [22.9 ± 6.3 yr, body mass of 73.2 ± 4.5 kg, peak O2 uptake (V?O2peak) of 54.0 ± 5.7 ml·kg-1·min-1] were randomly assigned to complete trials consisting of either resistance exercise (8 x 5 leg extension, 80% 1 repetition maximum) followed by a bout of endurance exercise (30 min cycling, 70% V?O2peak) or vice versa. Muscle biopsies were obtained from the vastus lateralis at rest, 15 min after each exercise bout, and after 3 h of passive recovery to determine early signaling and mRNA responses. Phosphorylation of Akt and Akt1Ser473 were elevated 15 min after resistance exercise compared with cycling, with the greatest increase observed when resistance exercise followed cycling (?55%; P < 0.01). TSC2-mTOR-S6 kinase phosphorylation 15 min after each bout of exercise was similar regardless of the exercise mode. The cumulative effect of combined exercise resulted in disparate mRNA responses. IGF-I mRNA content was reduced when cycling preceded resistance exercise (-42%), whereas muscle ring finger mRNA was elevated when cycling was undertaken after resistance exercise (?52%; P < 0.05). The hexokinase II mRNA level was higher after resistance cycling (?45%; P < 0.05) than after cycling-resistance exercise, whereas modest increases in peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1? mRNA did not reveal an order effect. We conclude that acute responses to diverse bouts of contractile activity are modified by the exercise order. Moreover, undertaking divergent exercise in close proximity influences the acute molecular profile and likely exacerbates acute "interference".

Changes in biomechanical properties of the coronary artery wall contribute to maintained contractile responses to endothelin-1 in atherosclerosis.

AIMS: Our aim was to determine whether alterations in biomechanical properties of human diseased compared to normal coronary artery contribute to changes in artery responsiveness to endothelin-1 in atherosclerosis. MAIN METHODS: Concentration-response curves were constructed to endothelin-1 in normal and diseased coronary artery. The passive mechanical properties of arteries were determined using tensile ring tests from which finite element models of passive mechanical properties of both groups were created. Finite element modelling of artery endothelin-1 responses was then performed. KEY FINDINGS: Maximum responses to endothelin-1 were significantly attenuated in diseased (27±3 mN, n=55) compared to normal (38±2 mN, n=68) artery, although this remained over 70% of control. There was no difference in potency (pD2 control=8.03±0.06; pD2 diseased=7.98±0.06). Finite element modelling of tensile ring tests resulted in hyperelastic shear modulus μ=2004±410 Pa and hardening exponent α=22.8±2.2 for normal wall and μ=2464±1075 Pa and α=38.3±6.7 for plaque tissue and distensibility of diseased vessels was decreased. Finite element modelling of active properties of both groups resulted in higher muscle contractile strain (represented by thermal reactivity) of the atherosclerotic artery model than the normal artery model. The models suggest that a change in muscle response to endothelin-1 occurs in atherosclerotic artery to increase its distensibility towards that seen in normal artery. SIGNIFICANCE: Our data suggest that an adaptation occurs in medial smooth muscle of atherosclerotic coronary artery to maintain distensibility of the vessel wall in the presence of endothelin-1. This may contribute to the vasospastic effect of locally increased endothelin-1 production that is reported in this condition.

Contractile and mechanical properties of epithelia with perturbed actomyosin dynamics.

Mechanics has an important role during morphogenesis, both in the generation of forces driving cell shape changes and in determining the effective material properties of cells and tissues. Drosophila dorsal closure has emerged as a reference model system for investigating the interplay between tissue mechanics and cellular activity. During dorsal closure, the amnioserosa generates one of the major forces that drive closure through the apical contraction of its constituent cells. We combined quantitation of live data, genetic and mechanical perturbation and cell biology, to investigate how mechanical properties and contraction rate emerge from cytoskeletal activity. We found that a decrease in Myosin phosphorylation induces a fluidization of amnioserosa cells which become more compliant. Conversely, an increase in Myosin phosphorylation and an increase in actin linear polymerization induce a solidification of cells. Contrary to expectation, these two perturbations have an opposite effect on the strain rate of cells during DC. While an increase in actin polymerization increases the contraction rate of amnioserosa cells, an increase in Myosin phosphorylation gives rise to cells that contract very slowly. The quantification of how the perturbation induced by laser ablation decays throughout the tissue revealed that the tissue in these two mutant backgrounds reacts very differently. We suggest that the differences in the strain rate of cells in situations where Myosin activity or actin polymerization is increased arise from changes in how the contractile forces are transmitted and coordinated across the tissue through ECadherin-mediated adhesion. Altogether, our results show that there is an optimal level of Myosin activity to generate efficient contraction and suggest that the architecture of the actin cytoskeleton and the dynamics of adhesion complexes are important parameters for the emergence of coordinated activity throughout the tissue.

Review of Artificial Muscle Based on Contractile Polymers

An artificial muscle with strength and speed equal to that of a human muscle may soon be possible. Polymer gels exhibit abrubt volume changes in response to variations in their external conditions -- shrinking or swelling up to 1000 times their original volume. Through the conversion of chemical or electrical energy into mechanical work, a number of devices have already been constructed which produce forces up to 100N/cm2 and contraction rates on the order of a second. Through the promise of an artificial muscle is real, many fundamental physical and engineering questions remain before the extent or limit of these devices is known.

Dynamic Model and Control of an Artificial Muscle Based on Contractile Polymers

A dynamic model and control system of an artificial muscle is presented. The artificial muscle is based on a contractile polymer gel which undergoes abrupt volume changes in response to variations in external conditions. The device uses an acid-base reaction to directly convert chemical to mechanical energy. A nonlinear sliding mode control system is proposed to track desired joint trajectories of a single link controlled by two antagonist muscles. Both the model and controller were implemented and produced acceptable tracking performance at 2Hz.

Phénotype et localisation des cellules infiltrant l’interstitium rénal dans la néphropathie aux acides aristolochiques

10ème réunion commune de la Société de Néphrologie et de la Société Francophone de Dialyse (Marrakech, 26-29 novembre 2008)