Établissement d'une lignée de souris transgéniques exprimant l'isoforme p35 de la chaîne invariante et développement d'un anticorps polyclonal spécifique

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Impact de l’expression de l’isoforme p35 de la chaîne invariante humaine chez des souris déficientes en CD74 endogène

La chaîne invariante (Ii ; CD74) est une protéine membranaire de type II qui joue un rôle majeur dans la présentation antigénique. Dans le réticulum endoplasmique (RE), Ii favorise l’assemblage du CMH II et prévient la liaison indésirable de polypeptides. Grâce à son motif di-leucine, la chaîne invariante cible le CMH II dans les endosomes. Une fois dans ces compartiments acides, Ii est dégradé, permettant la liaison de peptides de forte affinité qui seront ensuite présentés aux cellules T CD4+. Chez les souris déficientes en Ii murin (mIi), le CMH II présente une conformation non compacte typique des molécules vides ou liées faiblement à un peptide. Le transport du CMH II est aberrant ce qui conduit à une réduction de son expression en surface ainsi qu’à un défaut de présentation antigénique. De plus, Ii diversifie le répertoire de peptides et assure la sélection thymique des cellules T CD4+. Enfin, il a un rôle dans la maturation des cellules B et les souris déficientes en Ii présentent des nombres réduits de cellules B matures folliculaires (FO). L’isoforme mineure humaine p35 (Iip35) n’existe pas chez la souris et possède une extension cytoplasmique de 16 acides aminés contenant un motif R-x-R de rétention dans le RE. La sortie du RE est conditionnelle à la liaison du CMH II qui permet de masquer le motif de rétention. Iip35 agit comme dominant et impose la rétention aux autres isoformes d’Ii. Cependant, le rôle physiologique du motif R-x-R et, plus globalement, celui d’Iip35, demeurent nébuleux. Pour mieux cerner la fonction d’Iip35, nous avons généré des souris transgéniques (Tg) exprimant l’isoforme humaine Iip35 et avons analysé la conformation et le trafic du CMH II, la sélection thymique et la maturation des cellules B ainsi que la présentation antigénique. Nos résultats ont démontré qu’Iip35 favorise l’assemblage du CMH II dans le RE. Il induit également une conformation compacte du CMH II et augmente l’expression du CMH II en surface. De plus, Iip35 cible le CMH II dans les endosomes où un peptide de forte affinité se lie dans la niche peptidique. Par ailleurs, Iip35 diversifie le répertoire de peptides et rétablit totalement la sélection des cellules T CD4+ ainsi que le niveau d’expression du TCR de ces dernières. Iip35 restaure également la présentation antigénique de l’ovalbumine dont la présentation requiert l’expression d’Ii. Par contre, Iip35 rétablit la présentation des superantigènes mais à un niveau moindre que celui des souris sauvages. Ensuite, Iip35 permet le rétablissement de la sélection des cellules iNKT démontrant qu’il assiste la présentation des lipides par les molécules CD1d. Enfin, les résultats ont démontré qu’Iip35 restaure le développement des cellules B matures folliculaires (FO) mais pas celui des cellules B de la zone marginale. Ceci suggère qu’Iip35 est capable d’induire le développement des cellules FO sans stimulation préalable par le MIF (macrophage migration inhibitory factor). Ainsi, l’ensemble de ces résultats démontre qu’Iip35 est fonctionnel et assure la majorité des fonctions d’Ii. Cependant, Iip35 ne remplace pas mIi endogène concernant la maturation des cellules B MZ suggérant qu’il pourrait avoir un rôle de régulateur.

Rôle de l'isoforme p35 de la chaîne invariante humaine dans la formation et le transport de complexes de CMH II

La présentation antigénique par les molécules de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH II) est un mécanisme essentiel au contrôle des pathogènes par le système immunitaire. Le CMH II humain existe en trois isotypes, HLA-DP, DQ et DR, tous des hétérodimères composés d’une chaîne α et d’une chaîne β. Le CMH II est entre autres exprimé à la surface des cellules présentatrices d’antigènes (APCs) et des cellules épithéliales activées et a pour fonction de présenter des peptides d’origine exogène aux lymphocytes T CD4+. L’oligomérisation et le trafic intracellulaire du CMH II sont largement facilités par une chaperone, la chaîne invariante (Ii). Il s’agit d’une protéine non-polymorphique de type II. Après sa biosynthèse dans le réticulum endoplasmique (ER), Ii hétéro- ou homotrimérise, puis interagit via sa région CLIP avec le CMH II pour former un complexe αβIi. Le complexe sort du ER pour entamer son chemin vers différents compartiments et la surface cellulaire. Chez l’homme, quatre isoformes d’Ii sont répertoriées : p33, p35, p41 et p43. Les deux isoformes exprimées de manière prédominante, Iip33 et p35, diffèrent par une extension N-terminale de 16 acides aminés portée par Iip35. Cette extension présente un motif de rétention au réticulum endoplasmique (ERM) composé des résidus RXR. Ce motif doit être masqué par la chaîne β du CMH II pour permettre au complexe de quitter le ER. Notre groupe s’est intéressé au mécanisme du masquage et au mode de sortie du ER des complexes αβIi. Nous montrons ici que l’interaction directe, ou en cis, entre la chaîne β du CMH II et Iip35 dans une structure αβIi est essentielle pour sa sortie du ER, promouvant la formation de structures de haut niveau de complexité. Par ailleurs, nous démontrons que NleA, un facteur de virulence bactérien, permet d’altérer le trafic de complexes αβIi comportant Iip35. Ce phénotype est médié par l’interaction entre p35 et les sous-unités de COPII. Bref, Iip35 joue un rôle central dans la formation des complexes αβIi et leur transport hors du ER. Ceci fait d’Iip35 un régulateur clef de la présentation antigénique par le CMH II.

Avaliação da técnica de hemocultura pela reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando os iniciadores P35/P36 e TCZ1/TCZ2 para a detecção de Trypanosoma cruzi em cães e gatos

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Structure of a soluble secreted chemokine inhibitor vCCI (p35) from cowpox virus

Most poxviruses, including variola, the causative agent of smallpox, express a secreted protein of 35 kDa, vCCI, which binds CC-chemokines with high affinity. This viral protein competes with the host cellular CC-chemokine receptors (CCRs), reducing inflammation and interfering with the host immune response. Such proteins or derivatives may have therapeutic uses as anti-inflammatory agents. We have determined the crystal structure to 1.85-Å resolution of vCCI from cowpox virus, the prototype of this poxvirus virulence factor. The molecule is a β-sandwich of topology not previously described. A patch of conserved residues on the exposed face of a β-sheet that is strongly negatively charged might have a role in binding of CC-chemokines, which are positively charged.

Epstein–Barr virus-induced gene 3 and the p35 subunit of interleukin 12 form a novel heterodimeric hematopoietin

The Epstein–Barr virus-induced gene 3 (EBI3) is a novel soluble hematopoietin component related to the p40 subunit of interleukin 12 (IL-12). When EBI3 was expressed in cells, it accumulated in the endoplasmic reticulum and associated with the molecular chaperone calnexin, indicating that subsequent processing and secretion might be dependent on association with a second subunit. Coimmunoprecipitations from lysates and culture media of cells transfected with expression vectors for EBI3 and/or the p35 subunit of IL-12 now reveal a specific association of EBI3 with p35. Coexpression of EBI3 and p35 mutually facilitates their secretion. Most importantly, a large fraction of p35 in extracts of the trophoblast component of a human full-term normal placenta specifically coimmunoprecipitated with EBI3, indicating that EBI3 is in a heterodimer with p35, in vivo. Because EBI3 is expressed in EBV-transformed B lymphocytes, tonsil, spleen, and placental trophoblasts, the EBI3/p35 heterodimer is likely to be an important immunomodulator.

Synergistic contributions of cyclin-dependant kinase 5/p35 and Reelin/Dab1 to the positioning of cortical neurons in the developing mouse brain

Cyclin-dependent kinase (Cdk) 5 is a unique member of the Cdk family, because Cdk5 kinase activity is detected only in the nervous tissue. Two neuron-specific activating subunits of Cdk5, p35 and p39, have been identified. Overlapping expression pattern of these isoforms in the embryonic mouse brain and the significant residual Cdk5 kinase activity in brain homogenate of the p35−/− mice indicate the redundant functions of the Cdk5 activators in vivo. Severe neuronal migration defects in p35−/−Cdk5 +/− mice further support the idea that the redundant expression of the Cdk5 activators may cause a milder phenotype in p35−/− mice compared with Cdk5−/− mice. Mutant mice lacking either Cdk5 or p35 exhibit certain similarities with Reelin/Dab1-mutant mice in the disorganization of cortical laminar structure in the brain. To elucidate the relationship between Cdk5/p35 and Reelin/Dab1 signaling, we generated mouse lines that have combined defects of these genes. The addition of heterozygosity of either Dab1 or Reelin mutation to p35−/− causes the extensive migration defects of cortical neurons in the cerebellum. In the double-null mice of p35 and either Dab1 or Reelin, additional migration defects occur in the Purkinje cells in the cerebellum and in the pyramidal neurons in the hippocampus. These additional defects in neuronal migration in mice lacking both Cdk5/p35 and Reelin/Dab1 indicate that Cdk5/p35 may contribute synergistically to the positioning of the cortical neurons in the developing mouse brain.

The brain-specific activator p35 allows Cdk5 to escape inhibition by p27Kip1 in neurons.

Cell cycle withdrawal in postmitotic cells involves cyclin-dependent kinase (Cdk) inhibitors that repress cell cycle Cdk activity. During mouse neurogenesis, cortical postmitotic neurons are shown here to accumulate high levels of the p27 Cdk inhibitor compared with their progenitor neuroblasts. Elevated p27 levels in staged embryo brain extracts correlate with p27 binding to Cdk2, and Cdk inactivation. Yet, Cdk5, which is associated with the noncyclin activator p35 in neurons, remains active in the presence of high p27 levels. Both in vitro and in vivo, p27 and related inhibitors can recognize a cyclin D-Cdk5 complex but not a p35-Cdk5 complex. The results indicate that the choice of activator determines the susceptibility of Cdk5 to p27 and related Cdk inhibitors, and thus its ability to act in postmitotic cells.

Rôle de l'isoforme p35 de la chaîne invariante humaine dans la formation et le transport de complexes de CMH II

La présentation antigénique par les molécules de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH II) est un mécanisme essentiel au contrôle des pathogènes par le système immunitaire. Le CMH II humain existe en trois isotypes, HLA-DP, DQ et DR, tous des hétérodimères composés d’une chaîne α et d’une chaîne β. Le CMH II est entre autres exprimé à la surface des cellules présentatrices d’antigènes (APCs) et des cellules épithéliales activées et a pour fonction de présenter des peptides d’origine exogène aux lymphocytes T CD4+. L’oligomérisation et le trafic intracellulaire du CMH II sont largement facilités par une chaperone, la chaîne invariante (Ii). Il s’agit d’une protéine non-polymorphique de type II. Après sa biosynthèse dans le réticulum endoplasmique (ER), Ii hétéro- ou homotrimérise, puis interagit via sa région CLIP avec le CMH II pour former un complexe αβIi. Le complexe sort du ER pour entamer son chemin vers différents compartiments et la surface cellulaire. Chez l’homme, quatre isoformes d’Ii sont répertoriées : p33, p35, p41 et p43. Les deux isoformes exprimées de manière prédominante, Iip33 et p35, diffèrent par une extension N-terminale de 16 acides aminés portée par Iip35. Cette extension présente un motif de rétention au réticulum endoplasmique (ERM) composé des résidus RXR. Ce motif doit être masqué par la chaîne β du CMH II pour permettre au complexe de quitter le ER. Notre groupe s’est intéressé au mécanisme du masquage et au mode de sortie du ER des complexes αβIi. Nous montrons ici que l’interaction directe, ou en cis, entre la chaîne β du CMH II et Iip35 dans une structure αβIi est essentielle pour sa sortie du ER, promouvant la formation de structures de haut niveau de complexité. Par ailleurs, nous démontrons que NleA, un facteur de virulence bactérien, permet d’altérer le trafic de complexes αβIi comportant Iip35. Ce phénotype est médié par l’interaction entre p35 et les sous-unités de COPII. Bref, Iip35 joue un rôle central dans la formation des complexes αβIi et leur transport hors du ER. Ceci fait d’Iip35 un régulateur clef de la présentation antigénique par le CMH II.

Development of salinity tolerance in rice by constitutive-overexpression of genes involved in the regulation of programmed cell death

Environmental factors contribute to over 70% of crop yield losses worldwide. Of these drought and salinity are the most significant causes of crop yield reduction. Rice is an important staple crop that feeds more than half of the world’s population. However among the agronomically important cereals rice is the most sensitive to salinity. In the present study we show that exogenous expression of anti-apoptotic genes from diverse origins, AtBAG4 (Arabidopsis), Hsp70 (Citrus tristeza virus) and p35 (Baculovirus), significantly improves salinity tolerance in rice at the whole plant level. Physiological, biochemical and agronomical analyses of transgenic rice expressing each of the anti-apoptotic genes subjected to salinity treatment demonstrated traits associated with tolerant varieties including, improved photosynthesis, membrane integrity, ion and ROS maintenance systems, growth rate, and yield components. Moreover, FTIR analysis showed that the chemical composition of salinity-treated transgenic plants is reminiscent of non-treated, unstressed controls. In contrast, wild type and vector control plants displayed hallmark features of stress, including pectin degradation upon subjection to salinity treatment. Interestingly, despite their diverse origins, transgenic plants expressing the anti-apoptotic genes assessed in this study displayed similar physiological and biochemical characteristics during salinity treatment thus providing further evidence that cell death pathways are conserved across broad evolutionary kingdoms. Our results reveal that anti-apoptotic genes facilitate maintenance of metabolic activity at the whole plant level to create favorable conditions for cellular survival. It is these conditions that are crucial and conducive to the plants ability to tolerate/adapt to extreme environments.

Efecto de diferentes frijoles abonos sobre la dinámica de macronutrientes (N,P,K) del suelo, el aporte de materia orgánica, la incidencia de las diferentes pestes agrícolas y sobre el crecimiento y rendimiento de la pitahaya (Hylocereus undatus Britton y Rose)

Durante la época de postrera en 1997 se estableció un experimento de campo en la finca Frutas Tropicales y Cia Ltda, ubicada en el km 38 carretera MasayaTipitapa, Nicaragua para evaluar el efecto de diferentes frijoles abonos sobre la dinámica de macronutrientes del suelo, aporte de materia orgánica y la incidencia de las diferentes pestes agrícolas sobre el crecimiento y rendimiento de la pitahaya (Hylocereus undatus, Britton & Rose). El diseño experimental utilizado fue un bloque completo al azar con tres repeticiones. Los tratamientos evaluados fueron: Mucuna pruriens (L), Cajanus cajan (L), Canavalia ensiformis (L), Vigna unguiculata (L), Dolichos lablab (L) y el tratamiento sin frijol. Los fríjoles abonos ejercen un efecto positivo en el aporte de nutriente y reciclaje de los mismos mejoran la fertilidad del suelo. También aportan gran cantidad de materia orgánica a partir de los restos vegetales produciendo mayor biomasa C. ensiformis, C. cajan y M pruriens. Las malas hierbas fueron controladas eficazmente por los frijoles abonos, principalmente las monocotiledóneas; no así en el tratamiento sin frijol. Las malas hierbas que más predominaron fueron: Acalypha alopecuroides (L), Hybanthus attenuatus (H&B), Chamaesyce hirta (L), Rícharcdia scabra (L), Hyparrhenia rufa (Nees), Digitaria sanguinalis (L), Panicum decumbens (L), Panicum reptans (L) y Cynodon nlejluensis (Vanderyst). Las poblaciones de insectos plagas fueron menores en los tratamientos que predominaba el clon más resistente al ataque de insectos plagas. Los insectos plagas de suelo fueron controlados por los frijoles abonos, al igual que los nematodos. La incidencia de las enfermedades Colletotrichum goesporiodes Penz (Antracnosis) y Dotiorella sp (Ojo de Pescado) fue menor en los tratamientos donde predominaba el clon Cebra. La Erwinia carotovora Iones (Bacteriosis) presentó menor incidencia bajo el efecto de D. lablab y C. ensiformis. El efecto positivo del asocio de estos fríjoles abonos con la pitahaya mejora su crecimiento produciendo más brotes bajo la presencia de C. cajan, se obtuvieron incremento en los rendimientos tanto en el número de fiutos por hectárea como en el rendimiento en kg/ha bajo el efecto de C. cajan, M pruriens y D. lablab

Evaluación agronómica y fitosanitaria para la determinación de capacidad de extracción de nutrientes, acumulación de materia seca de dos variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) en tres sistemas de labranza (convencional, mínima y cero)

El presente trabajo fue realizado en la estación experimental "La Compañía" Carazo, en época de postrera 1995, en suelos jóvenes de origen de cenizas volcánicas, el suelo es franco-limoso con altos contenidos de potasio y deficientes en fósforo. De acuerdo a sus propiedades, este suelo puede ser considerado adecuado para la mayoría de los cultivos; pH neutro y buen drenaje. El propósito del experimento fue determinar la capacidad de extracción de macro elementos, elementos secundarios, acumulación de materia seca y la dinámica de plagas, enfermedades y enemigos naturales en el cultivo de frijol, para dos variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris L.). Las variedades evaluadas fueron: Dor 364, Revolución 84. El diseño utilizado fue en bloques completamente al azar (B.C.A.) con seis tratamientos y cuatro repeticiones, cada tratamiento era un tipo de labranza. Los datos se sometieron a un análisis de varianza (ANOEVA) y se utilizó la prueba de rangos múltiples según Tukey y SNK al 95 por ciento de confianza. Para la recopilación de información sobre plagas y enfermedades los datos se arreglaron en un diseño de parcelas divididas ubicándose los tipos de labranza en las parcelas grandes y las variedades en las parcelas pequeñas. El análisis de plagas se hizo usando el paquete estadístico (S.A.S.). El análisis estadísticos de datos se realizó a través de ANDEVA y se separaron los tratamientos por medio de la prueba de S.N.K . Los datos obtenidos se pueden sintetizar de la siguiente forma: La variedad Dor 364 alcanzó una mayor altura en el sistema de labranza mínima, las mayores extracciones de macro elementos y elementos secundarios (P, K, Ca, Mg, y S ), se obtuvo en el sistema de labranza cero + mulch + subsoleo y al mismo tiempo acumuló más materia seca. En cuanto a la variedad Revolución 84 la mayor altura se obtuvo en la labranza cero + mulch, las mayores extracciones y acumulación de materia seca se obtuvo en la labranza convencional La labranza con mejores rendimientos fue la convencional, para ambas variedades evaluadas en el ensayo. La planta indicadora (sorgo) mostró mayor extracción de P, K, Ca, Mg, y S en sus tejidos en comparación con las otras variedades estudiadas En los resultados referentes a plagas de suelo se encontró que labranza mínima presentó mayor número de especies de plagas de suelo. En cuanto insecto plagas de follaje, los mas importantes que se presentaron en el ensayo están; Diabrótica spp., Nodonata spp., y Empoasca spp., la mayor presencia fue de Empoasca spp, la cual estuvo en casi todos los muestreos realizados. De los seis sistemas de labranzas evaluados labranza mínima fue la que mejor disminuyó las poblaciones de insectos plagas del follage. La mayor cantidad de benéficos se observó en labranzas mínima mas incorporación, seguida muy de cerca por labranza convencional más subsoleo. En cuanto a la incidencia y severidad de las enfermedades, fue notorio que hubo poca incidencia en las plantas. Sin embargo en las pocas plantas que hubo presencia de agentes patógenos se observó una alta severidad, la cual fue mayor usando, cero labranzas más mulch.

Estudio de la fertilidad y la dinámica del carbono en el suelo bajo diferentes manejos agronómicos en un cafetal de cuatro años de plantado en el Pacífico de Nicaragua

Se llevó a cabo un estudio en 2004, en el centro Jardín Botánico de UNICAFE (11º54’ N y 98º09’ W) y en el Centro Experimental de Campos Azules del INTA (11º53’59” N y 83º08’59” W), Masaya, Nicaragua. Se utilizó un diseño de bloques completos al azar con 2 repeticiones en Jardín Botánico y una en CECA, evaluándose la fertilidad y dinámica del Carbono en el suelo bajo diferentes manejos agronómicos en un cafetal de cuatro años de plantado. Los tratamientos consistieron en un factor A denominado tipos de sombra y nivel de insumo, siendo: Sombra de leguminosas ( Inga laurina + Samanea saman ) + Orgánico intensivo (MO) y Convencional extensivo (MC), Sombra mixta ( Inga laurina , Simaruba glauca ) + MO y MC, Sombra no leguminosa ( Simaruba glauca , Tabebuia rosea ) + MO y MC y a pleno sol + MC; y el factor B, definido como Sitio de muestreo de suelo con niveles de Calle e Hilera. El muestreo de suelo fue a las profundidades de 0 a 10 cm y de 10 a 20 cm. Se obtuvo una muestra compuesta de 6 submuestras de igual número de puntos distribuidos en la parcela útil, tomando árboles de ambas especies de sombra. La extracción de las submuestras se hizo en un área de un marco de 0.25 m 2 , realizando 3 perforaciones en forma diagonal; las submuestras se homogenizaron y se extrajo la muestra compuesta de 0.5 kg, este procedimiento se realizó en ambos años 2001 y 2004 con la variante que en este último año no se definió el segundo factor B (sitio de muestreo). A cada una de las muestras compuestas se les determinó: El carbono lento, pasivo y tota l para el año 2001, las variables de nitrógeno total (%), P, K, Ca, Mg y CIC (meq / 100 g de suelo) y pH en H 2 O para ambos años (2001 y 2004). Con respecto a las variables Carbono total (%), la biomasa microbiana (% del C), Na (meq / 100 g de suelo) y las relaciones básicas (Ca/K, Mg/K y Ca+Mg/K) se determinaron solamente en el año 2004. Estas se sometieron a un análisis estadístico de varianza (ANDEVA) con una probabilidad α = 0.05 de error, y al comparador de medias Diferencia Mínima Significativa. Los resultados obtenidos indican diferencias estadísticas (P=0.0003) en el pH del suelo a la profundidad de 0–10 cm en 2004, bajo los tratamientos con sombra leguminosa, no leguminosa y mixta con el nivel de insumo MO; manifestando valores mas altos en relación a los MC. Así mismo las vari ables P, K y el Ca disponibles, reflejaron diferencias estadísticas con valores mayores en el año 2004; bajo las sombra leguminosa, no leguminosa y mixta + MO, en ambas profundidades superando a los MC. Mientras que para las relaciones básicas del suelo Ca/K, Mg/K y Ca+Mg/K fueron mas altas bajos los tratamientos MC, principalmente en la combinación de sombra mixta ( I. laurina + S. glauca ). Las relaciones Mg/K y Ca+Mg/K manifestaron los valores mas altos bajo el sitio de hilera en la profundidad de 10 a 20 cm. La CIC y el Na disponible, manifestaron un comportamiento diferente con respecto al sitio de muestreo a la profundidad de 0 a 10cm, al reflejar el valor mas alto de CIC en la calle con 40.2 meq que en la hilera del cafeto; mientras que el Na y el P disponible reflejaron las concentraciones mas altas en el sitio de hilera con valores de 0.57 y 48.0 meq respectivamente. En cuanto a la variable de C lento y pasivo (%) del suelo mantuvieron concentraciones altas bajo todos los tratamientos evaluados en ambas profundidades, la misma tendencia se vio reflejada para la variable de porcentaje relativo de C total de la fracción lenta y pasiva del suelo; con respecto al C total del suelo (2001 y 2004) manifestó una disminución de éste; pero no significativa de su concentración en todos los tratamientos para el año 2004; sin embargo solamente la variable C-microbiano manifestó diferencias estadísticas en la profundidad de 0 - 10 cm reflejando contenidos altos; bajo las sombra mixta y leguminosa con el nivel de insumo MO