草鱼免疫球蛋白M重链基因的克隆及表达

用RACE-PCR方法扩增出草鱼免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)分泌型的重链全长cDNA。其cDNA全长为1 940nt,包含5′非编码区20nt,3′非编码区189nt,开放阅读框1 731nt,编码576个氨基酸。序列比对分析表明草鱼IgM与鲤的相似性高达68%,与斑马鱼、斑点叉尾鱼回、鳜以及大西洋鳕的相似性分别为61%、43%、33%和30%。ClustalX比对结果显示:草鱼IgM中存在半胱氨酸和色氨酸的保守位点。进化分析表明,草鱼IgM与斑马鱼的IgM聚为一枝。荧光定量P

柱状黄杆菌胞外多糖对草鱼的免疫促进作用

将柱状黄杆菌胞外多糖(EPS)溶液经腹腔注射免疫草鱼,以注射灭菌生理盐水作对照。免疫一周后,分别提取受免鱼与对照鱼肝脏、脾脏、体肾和头肾4种组织中的总RNA,并通过RT-PCR半定量的方法检测不同组织中C-反应蛋白(CRP)、白介素1(IL-1)、主要组织相容性复合体I(MHC I)、免疫球蛋白M(IgM)、干扰素(IFN)等5种免疫基因的表达情况。结果显示,CRP在受免鱼肝脏中的表达显著上升;MHC I在受免鱼脾脏、体肾中的表达显著下降;IgM在受免鱼4种组织中的表达皆显著上升;IL-1在受免鱼4种组织

四种方法对鲢血清免疫球蛋白的纯化及分子量测定

采用mannan-binding protein(MBP)、TG及免疫亲和层析法和饱和硫酸铵沉淀法纯化鲢血清免疫球蛋白IgM,并比较了4种纯化方法的纯化效果.SDS-PAGE显示鲢血清免疫球蛋白的重链和轻链分子量分别为76.4 kD和27.2 kD,推算其总分子量约828.8kD.

草鱼免疫应答的初步研究

研究了草鱼在不同水温条件下受抗原刺激后其中和抗体的变化。15℃培养条件下中和抗体上升缓慢,9周内滴度低于1:8;20℃时,3周后抗体可上升到1:256,最高达1:5270,而在25℃时,1周中和抗体即达到1:570,最高可达1:20000以上。并探索了从草鱼血清中提纯抗体的条件,研究其抗体的特性。草鱼血清中的抗体为大分子蛋白,容易解离为抗原性相同,分子量近似于人IgG的较小分子,含有较多的二硫键,具有类似IgM的某些特性。

Effects of cyanobacterial toxin microcystin-LR on the transcription levels of immune-related genes in grass carp Ctenopharyngodon idella

Recent studies in mammals have revealed that the cyanobacterial toxin MC-LR suppresses immune functions. Nevertheless, immunotoxic effects of microcystins have been little studied in fish. In this paper, we present the profiles of the immune modulation of MC-LR in grass carp, and quantitative real-time PCR methodology was developed for the measurement of relative transcription changes of six immune-related genes in the spleen and head kidney of the grass carp Ctenopharyngodon idella, which were intraperitoneally injected with 50 mu g MC-LR center dot kg(-1) body weight in a three-week period. This study was focused exclusively on gene transcription level changes at different time points after MC-LR exposure, so, only one dose was given. The investigated genes were interleukin-1 beta (IL-1 beta), tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha), type I interferon (Type I IFN), peptidoglycan recognition protein-L (PGRP-L), immunoglobulin M (IgM) and major histocompatibility complex class I (MHC-I) genes. The results demonstrated that the transcription levels of the TNF-alpha, type I IFN, and PGRP-L genes in the spleen and head kidney were significantly low at all time points, and those of IL-1 beta were significantly low in the head kidney at different time points. In addition, IgM and MHC-I transcription levels were only significantly low in the spleen and head kidney at 21 d postinjection. The changes in the transcription levels of immune-related genes induced by MC-LR confirmed its effect on inhibiting immune function at the transcription level.

Molecular cloning and characterization analysis of immunoglobulin M heavy chain gene in European eel (Anguilla anguilla)

In this study, the immunoglobulin M heavy chain gene of European eel (Anguilla anguilla) was cloned and analyzed. The full-length cDNA of the IgM heavy chain gene (GenBank accession no. EF062515) has 2089 nucleotides encoding a putative protein of 581 amino acids. The IgM heavy chain was composed of leader peptide (L), variable domain (VH), CH1, CH2. Hinge, CH3, CH4, and C-terminus and two novel continuous putative N-glycosylation sites were found close to the second cysteine of CH3 in A. anguilla-H1 and A. anguilla-H2. The deduced amino acid sequence of the European eel IgM heavy chain constant region shared similarities to that of the Ladyfish (Elops saurus). Atlantic salmon (Salmo salar), rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), Grass carp (Ctenopharingodon idella), Common carp (Cyprinus carpio), Channel catfish (Ictalurus punctatus), and the orange-spotted grouper (Epinephelus coioides) with the identity of 46.1%, 39.7%, 38.9%, 32.4%, 32.3%, 31.7%, and 30.7%, respectively. The highest level of IgM gene expression was observed in the kidney, followed by the spleen, gills, liver, muscle and heart in the apparently healthy European eels. (C) 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.

Generation and characterization of monoclonal antibodies against the flounder Paralichthys olivaceus rhabdovirus

Two MAbs (3C7 and 3C9) against flounder Paralichthys olivaceus rhabdovirus (PORV) were generated with hybridoma cell fusion technology and characterized by an indirect enzyme-linked immunosorbent assay, isotype test, Western blot and immunodot analysis and immunofluorescence assay. Isotyping tests demonstrated that both of the two MAbs belonged to IgM subclass. Western blot analysis showed the MAbs reacted with 42, 30, and 22 kDa viral proteins, which were localized within the cytoplasm of PORV-infected grass carp ovary (GCO) cells analyzed by indirect immunofluorescences tests. The MAb 3C7 was also selected at random for detecting virus antigens in the inoculated grass carp tissues by immunohistochemistry assay. Flow cytometry tests showed that at the 36 h postinfection (0.25 PFU/cell), the 23% PORV-infected GCO cells could be distinguished from the uninfected cells with the MAb 3C7. Such MAbs could be useful for diagnosis and potential treatment of viral infection. (C) 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.

Characterization and application of monoclonal antibodies against turbot (Scophthalmus maximus) rhabdovirus

Five monoclonal antibodies (mAbs), 1G8, 1H9, 2D2, 2D3, and 2F5, against Scophthalmus maximus rhabdovirus (SMRV) were prepared. Characterization of the mAbs included indirect enzyme-linked immunosorbent assay, isotyping, viral inhibition assay, immunofluorescence staining of virus-infected cell cultures, and Western blot analysis. Isotyping revealed that 1G8 and 1H9 were of the IgG2b subclass and that the other three were IgM. 2D2, 2D3, and 2F5 partially inhibited SMRV infection in epithelioma. papulosum cyprinid (EPC) cell culture. Western blotting showed that all five mAbs could react with two SMRV proteins with molecular masses of approximately 30 kDa (P) and 26 kDa (M). These two proteins were localized within the cytoplasm of SMRV-infected EPC cells by immunofluorescence assay. Also, progressive foci of viral replication in cell cultures were monitored from 6 to 24 h, using mAb 2D3 as the primary antibody. A flow cytometry procedure was used to detect and quantify SMRV-infected (0.01 PFU/cell) EPC cells with mAb 2D3, and 10.8% of cells could be distinguished as infected 36 h postinfection. Moreover, mAb 2D3 was successfully applied for the detection of viral antigen in cryosections from flounder tissues by immunohistochemistry tests.

大麻受体CB1及CB2在慢性吗啡成瘾大鼠中枢神经系统与免疫系统的分布和表达

吗啡是临床常用的镇痛药物之一，通过模拟内源性抗痛物质脑啡肽的作用，激活中枢神经阿片受体而产生强大的镇痛作用。吗啡属于阿片类生物碱，为阿片受体激动剂，是目前我国主要的毒品成瘾类型之一，对人民生命健康危害极大。目前我国登记在册的吗啡成瘾者约有100万，每年导致的直接经济损失超过1000亿元。因此吗啡成瘾机制的研究以及治疗，是目前神经疾病的研究重点之一。 吗啡成瘾与其结合的受体有关。吗啡除结合阿片受体外，也可能结合大麻素受体，现发现体内有两种大麻素受体的存在：CB1受体和CB2受体。大麻CB1、CB2受体都是G蛋白耦联受体。其中CB1受体主要位于脑、脊髓与外周神经系统中，脑内CB1受体主要分布于基底神经节（黑质、苍白球、外侧纹状体）、海马CA锥体细胞层，小脑和大脑皮层。因此推测大麻CB1受体的功能可能与成瘾、记忆、认知、运动控制的调节有关。而大麻CB2受体主要分布于外周组织，如脾脏边缘区、扁桃体等，它的这种分布可能与免疫抑制作用有关。近来的研究发现大麻CB2受体在中枢神经系统也有分布，目前对其在此分布的功能不明确，推测可能与成瘾、抑郁症等神经类疾病有密切关系。 在药物成瘾导致的精神依赖作用中，奖赏效应是各种药物成瘾的药理学基础。中脑—边缘系统（(mesolimbic dopamine system,MLDS)是药物奖赏效应的神经解剖学基础。目前认为内源性大麻素所起的药理作用与多巴胺能和阿片能的神经传递有密切的关系。因此推断大麻素CB1受体与慢性吗啡成瘾有密切关系，至少是部分参与到慢性吗啡成瘾过程中。 相较于较多的关于大麻CB1受体的研究，有关大麻CB2受体的研究很少。尽管近来证实大麻CB2受体也分布于中枢神经系统，但在慢性吗啡成瘾时，大麻CB2受体表达的改变仍不清楚。在本项目中，我们将对慢性吗啡成瘾动物通过分子生物学、蛋白质化学、免疫组织化学的方法，探讨大麻CB2受体在中枢神经系统的分布和表达，以及大麻CB2受体在吗啡成瘾中可能的作用。 吗啡对免疫系统有抑制作用, 包括抑制淋巴细胞增殖, 减少细胞因子的分泌，减弱自然杀伤细胞（NKC）的细胞毒作用。现已证实激活周围神经系统的CB2受体可诱导IL-4的生成，从而影响阿片μ型受体的转录。此发现提供了内源性大麻系统-阿片系统-免疫系统之间存在相互作用的关系。然而，吗啡吸食是否通过CB2受体从而导致免疫功能的抑制，现在还没有直接证据，在本实验中我们将探讨CB2受体与吗啡成瘾导致免疫功能的改变有关。 实验结果显示（1）应用RT-PCR法，检测到大麻素受体CB1在慢性吗啡成瘾大鼠的皮质和海马处mRNA表达水平与对照组大鼠有明显不同。（2）应用western免疫印迹法，检测到大麻素受体CB1在慢性吗啡成瘾大鼠的皮质，海马和脑干处蛋白表达水平与对照组大鼠有明显不同。在脑干处，虽然mRNA表达水平无变化，但蛋白质的表达水平上升。（3）应用免疫组化检测到大麻素受体CB1在大鼠的皮质，海马，脑干，小脑处都广泛分布。（4）应用RT-PCR法，检测到大麻素受体CB2在慢性吗啡成瘾大鼠的皮质，海马，脑干处mRNA表达水平与对照组大鼠有明显不同。（5）应用western免疫印迹法，检测到大麻素受体CB2在慢性吗啡成瘾大鼠的皮质，海马，脑干蛋白表达水平与对照组大鼠有明显不同。且蛋白质的表达改变趋势与mRNA表达水平的改变相似。（6）应用免疫组化法检测到大麻素受体CB2在大鼠的皮质，海马，脑干，小脑处都广泛分布。但数量明显少于大麻CB1受体。（7）应用直接ELISA法，检测到慢性吗啡成瘾大鼠的血清与对照组大鼠的血清比较，IgM表达下降；IgG表达上升。 实验结果提示大麻受体CB1和CB2 很可能在慢性吗啡成瘾过程起着重要的作用，至少是部分参与到慢性吗啡成瘾的过程中。因为大麻素受体CB1和CB2都属于G 蛋白耦连受体，长期持续使用吗啡，其表达的变化可能会导致cAMP信号通路的上调；提高了腺苷酸环化酶(AC)和蛋白激酶A(PKA)的活性从而激活下游相关基因的表达最终导致成瘾。此外大麻素受体CB1和CB2表达的变化可能与慢性吗啡成瘾后免疫功能的改变有相关性。 通过以上的的实验结果，可以得到以下的结论：（1）我们验证了大麻素受体CB1在慢性吗啡成瘾大鼠的皮质，海马和脑干处mRNA和蛋白质表达水平与对照组大鼠有明显不同，且大麻CB1受体在大鼠中枢神经系统中广泛大量分布，表明大麻素受体CB1很可能在慢性吗啡成瘾过程中起着重要的作用，至少部分参与到慢性吗啡成瘾的过程中。（2）我们第一次证实了大麻素受体CB2在吗啡成瘾大鼠的皮质，海马和脑干处mRNA和蛋白质表达水平与对照组大鼠有明显不同，且大麻CB2受体在大鼠中枢神经系统中少量广泛分布。表明大麻素受体CB2很可能在慢性吗啡成瘾过程中起着重要的作用，至少部分参与到慢性吗啡成瘾的过程中。（3）同时我们发现大麻素受体CB1和CB2在大鼠脑组织中广泛表达，表明内源性大麻系统有可能广泛的参与各种神经疾病，很可能成为治疗的新靶点。（4）最后我们发现慢性吗啡成瘾大鼠血液中IgM表达下降；IgG表达上升，表明慢性吗啡成瘾对机体的免疫功能有广泛的调节作用。慢性吗啡成瘾大鼠血清CB2受体mRNA表达上升。我们证实了大麻受体CB2可能正是把神经系统和免疫系统相联系的一个靶点。

抗顶体反应人精子单克隆抗体的制备和鉴定

精子从男性生殖道释放后必须经过获能和顶体反应，才能与卵子结合。获能和顶体反应后，精子细胞内和精子表面的许多大分子都会发生改变。利用这些变化，可探索新的避孕方法和男性不育诊断及治疗的新途径。本文将正常人精子于体外在BWW－BSA培养基中获能，用钙离子载体A23187诱导人精子进行顶体反应，以三染和金霉素荧光染色两种方法检测这些精子的顶体反应率为50％左右，然后用这些经顶体反应处理的新鲜人精子（AR sperm）作为抗复，腹腔免疫Balb/C小鼠，利用最近发展起来的半固体培养及普通的液体培养方法制备单抗。分别用未经任何处理的人精子（NT sperm）及上述顶体反应的人精子包被酶标板，用ELISA法检测所得杂交瘤细胞分泌的抗体，得到了近百株阳性杂交瘤，其中已克隆并得到腹水的有23株，并对这些单抗进行了以下鉴定：腹水滴度测定；抗体分类；与人白细胞系U937，Raji和Jurkat的交叉反应；在NT和AR人精子、树（左鼠右句）和小鼠精子上的荧光定位；单抗对人精子的凝集（SA）和制动（SI）试验；免疫印迹测定单抗相应抗原的分子量。主要结果如下：1.单抗与NT和AR精子反应的ELISA结果表明，有12个单抗主要与AR精子抗原发生反应（A组抗体），6个单抗主要与NT精子抗原反应（B组抗体），而另外5个则与这两种精子抗原都呈阳性反应（C组抗体）。2.在得到的23个单抗中，绝大多数（21个）为IgM，只有两个分别是IgC_1和IgG_(2a)。3.23个单抗与白细胞系的交叉反应强度不同。A组单抗的交叉反应有的较强，有的较弱，有的居中；B组单抗的交叉反应为弱阳性或阴性；C组单抗则呈现要么很强、要么很弱的交叉反应。4.所得单抗的荧光定位主要在赤道板和中段，未发现定位于顶体及顶体后的单抗，而国内外其他实验室已获得的单抗，主要定位在顶体。某些单抗在两种不同精子（NT sperm, AR sperm）上有不同的荧光定位。这些结果表明，AR精子的免疫原性是十分特殊的，它明显不同于NT精子。5.有9个单抗显示较强的精子凝集作用，另有9个单抗的凝集作用稍弱，未发现有精子制动效应的单抗。6.免疫印迹结果表明，有9个单抗的靶抗原是蛋白质类物质，其分子量为16－146kDa，其余14个单抗的免疫印迹呈阴性反应。有关这些单抗及其抗原的鉴定仍在进行中。其中10个单抗已送世界卫生组织（WHO），参与WHO的抗人精子抗原的单克隆抗体的研究计划。

抗小鼠乳酸脱氢酶C4（LDH-C4）IgA单克隆抗体的制备及其对精子功能的影响

乳酸脱氢酶C4 （LDH-C4）是一种人和哺乳动物精子特有的乳酸脱氢酶同功酶。用纯化的小鼠LDH-C4 免疫动物，有一定的避孕效果。这种避孕效果与血清特异性抗体水平并不完全一致。这可能是由于受精过程是在生殖道内进行的，而生殖道内又有粘膜免疫因素存在。IgA抗体是生殖道内的主要抗体成分，研究抗LDH-C4 IgA抗体的抗精子作用有助于了解局部分泌性免疫系统在抗精子免疫避孕中的作用。由于足够量的特异性IgA抗体难于从动物或人粘膜分泌液中分离到，为了获得供体内外试验用的该种抗体，直接证明它在抗生育方面的作用，我们采用一种特殊的免疫方法制备了一系列的抗LDH-C4的单克隆抗体，包括6株IgA和9株IgM。这种免疫方法的主要特点是将抗原直接注射到派伊尔氏淋巴小结（PP）或小肠腔内。ELISA检测表明，按这种方法免疫后，分泌IgA的克隆出现的比例明显高于常规免疫的结果。这是因为PP是粘膜免疫的中枢，其中含有大量的IgA前体细胞，直接将抗原注射到PP内有助于刺激IgA前体细胞的分化和增殖，诱导局部分泌性免疫反应。我们用所得到的单克隆抗体研究了LDH-C4在人，小鼠和树鼩精子表面的定位。结果表明，大多数单克隆抗体可以结合到这些精子的表面；不同的单抗在同一物种的精子表面呈现不同的结合区域。这一方面说明来源于人，小鼠和树鼩的LDH-C4的抗原决定簇有很高的同源性；另一方面提示LDH-C4在精子表面不同的区域所暴露的抗原决定簇不同。初步的功能试验表明，某些抗LDH-C4的IgA单克隆抗体可以凝集或制动精子，说明生殖道内的IgA抗体可以通过凝集和制动作用来影响精子的功能，从而影响精子的受精力。

Immunoprotective analysis of VhhP2, a Vibrio harveyi vaccine candidate

VhhP2 is an Outer membrane protein identified in a pathogenic Vibrio harveyi strain, T4, isolated from diseased fish. When used as a Subunit Vaccine, purified recombinant VhhP2 affords high level of protection upon Japanese flounder against V harveyi challenge. Vaccination with VhhP2 induced the expression of a number of immune-related genes, especially those encoding immunoglobulin M (IgM) and major histocompatibility complex (MHC) II alpha. A VhhP2 surface display system, in the form of the fish commensal strain FIR harboring the vhhP2-expressing plasmid pJVP, was constructed. PF3/pJVP is able to produce and present recombinant VhhP2 on cell surface. Vaccination of fish with live PF3/pJVP via intraperitoneal injection elicited Strong immunoprotection. Vaccination of fish orally with live PF3/pJVP embedded in alginate microspheres also induced effective immunoprotection. In addition, a VhhP2-based surface display system was created, in which VhhP2 serves as a carrier for the Surface delivery of a heterologous Edwardsiella tarda immunogen, Et18, that is fused in-frame to VhhP2. DH5 alpha/pJVP18, which expresses and surface-displays the VhhP2-Et18 chimera, proved to be an effective vaccine that call protect fish against infections by V. harveyi and E. tarda to the extents comparable to those produced by vaccination with purified recombinant VhhP2 and Et18, respectively. These data suggest that VhhP2 may be applied as a vaccine and a vaccine carrier against infections by V. harveyi and other pathogens such as F. tarda. (C) 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Identification and analysis of a CpG motif that protects turbot (Scophthalmus maximus) against bacterial challenge and enhances vaccine-induced specific immunity

Oligodeoxynucleotides (ODNs) containing unmethylated CpG motifs in certain contexts are known to be immunostimulatory in vertebrate systems. CpG ODNs with immune effects have been identified for many fish species but, to our knowledge, not for turbot. In this study, a turbot-effective CpG ODN, ODN 205, was identified and a plasmid, pCN5, was constructed which contains the CpG motif of ODN 205. When administered into turbot via intraperitoneal (i.p.) injection, both ODN 205 and pCN5 could (i) inhibit bacterial dissemination in blood in dose and time dependent manners, and (ii) protect against lethal bacterial challenge. Immunological analyses showed that in vitro treatment with ODN 205 stimulated peripheral blood leukocyte proliferation, while i.p. injection with ODN 205 enhanced the respiratory burst activity, chemiluminescence response, and acid phosphatase activity of turbot head kidney macrophages. pCN5 treatment-induced immune responses similar to those induced by ODN 205 treatment except that pCN5 could also enhance serum bactericidal activity in a calcium-independent manner. To examine whether ODN 205 and pCN5 had any effect on specific immunity, ODN 205 and pCN5 were co-administered into turbot with a Vibrio harveyi subunit vaccine, DegQ. The results showed that pCN5, but not ODN 205, significantly increased the immunoprotective efficacy of DegQ and enhanced the production of specific serum antibodies in the vaccinated fish. Further analysis indicated that vaccination with DegQ in the presence of pCN5 upregulated the expression of the genes encoding MHC class II alpha, IgM, Mx, and IL-8 receptor. Taken together, these results demonstrate that ODN 205 and pCN5 can stimulate the immune system of turbot and induce protection against bacterial challenge. In addition, pCN5 also possesses adjuvant property and can potentiate vaccine-induced specific immunity. (C) 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved.

鱼类疫苗的研究：I: 海水鱼类病原菌乳化口服疫苗的研究；II：迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌外膜蛋白疫苗的研究

本论文的目的是研究几种病原菌口服疫苗接种鱼类的免疫效果，并从常见病原菌株中筛选几个具有较好保护效果的蛋白抗原，利用口服免疫的方式，接种养殖动物，并检测免疫效果。 以10号白油为有机溶剂，采用搅拌与均浆方法制备鳗弧菌M3和SMP1的油乳化二价疫苗，用饵料包埋后以口服途径免疫养殖大菱鲆，评价免疫大菱鲆的免疫应答和疫苗的保护效果。结果显示，以油乳化和未油乳化疫苗分别连续口服免疫大菱鲆一周后，在后肠组织，乳化疫苗刺激产生的非特异性活力、特异性抗体水平均高于未乳化疫苗；而在血清，两种疫苗引起的两种酶的活力、SMP1抗体水平没有变化，但在乳化疫苗免疫的大菱鲆检测到明显高于未免疫对照大菱鲆的M3抗体水平。大菱鲆后肠组织原位杂交结果显示，口服免疫的大菱鲆后肠褶皱有IgM抗体的产生和分布。其中，乳化疫苗免疫大菱鲆的IgM抗体的产生和分布水平高于未乳化疫苗免疫的大菱鲆。攻毒实验显示，乳化疫苗免疫的大菱鲆对M3和SMP1的感染分别获得100%和50%的免疫保护率，而未乳化疫苗获得的免疫保护率分别为57.9%和0%，表明乳化疫苗比未乳化疫苗更有效地保护大菱鲆、抵抗病原的感染。在乳化疫苗免疫持续期的研究中，免疫的大菱鲆后肠在免疫后120天仍能检测到抗体效价，在免疫后90天还能观察到一定的免疫保护效果。免疫30天、60天、90天和120天的大菱鲆分别获得100%、66.7%、36.7%和13.3%的免疫保护力。 以鳗弧菌M3和SMP1、链球菌CF、迟缓爱德华菌SMW7作为细菌抗原制备油乳化多价口服疫苗和轮虫携带疫苗，口服途径免疫养殖大菱鲆与大菱鲆初孵仔鱼。结果显示，在免疫大菱鲆后肠可检测到抗M3抗体水平的提高（P<0.05），而在其胆汁、鳃、中肠、体表黏液、前肠与血清中抗体效价变化与对照组没有显示出差异；没有检测到免疫大菱鲆后肠抗SMP1、SMW7、CF抗体效价。M3浸泡攻毒实验显示，口服免疫的大菱鲆获得了100%的免疫保护力；在M3注射攻毒和SMP1、CF、SMW7浸泡攻毒大菱鲆的实验中，在每个攻毒组中，免疫组大菱鲆开始死亡的时间都要比对照组有不同程度的延迟，但攻毒大菱鲆都发生死亡，不能显示出与对照组的差异。轮虫携带免疫的结果显示，免疫的大菱鲆初孵仔鱼并未获得较好的保护效果，与对照大菱鲆没有体现出差异。 从致病性病嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）LSA34克隆并表达ahaI基因和gapA基因，从迟缓爱德华菌（Edwardsiella tarda）LSE40克隆并表达eseB，将所得蛋白分别通过腹腔注射途径免疫大菱鲆，检测蛋白的免疫原性和免疫保护。结果在免疫后7天就可以检测到AhaI、GapA蛋白免疫组大菱鲆产生的抗体，至第40天可以检测到明显的保护性抗体，之后抗体效价增加明显，直至第60天时达到最高值。EseB免疫的大菱鲆第一次免疫后15天就有较高的抗体效价产生，明显高于对照组大菱鲆血清抗体效价，到距第一次免疫60天时，抗体效价达到最高值。攻毒实验显示，与对照组相比，AhaI免疫组和GapA免疫组对LSA34感染的免疫保护力分别为80%和100%；AhaI免疫组和GapA免疫组对LSE40感染的免疫保护力分别为30%和10%。，而对照组牙鲆对人工攻毒不具有保护力。以AhaI和GapA作为疫苗免疫大菱鲆，使大菱鲆获得了对嗜水气单胞菌LSA34较高的免疫保护；而对迟缓爱德华氏菌LSE40的交叉保护能力没有明显提高。EseB免疫的大菱鲆在攻毒实验中并没有显示出较好的保护效果，与对照组相比，只是在死亡时间上有所延迟。 以从致病性嗜水气单胞菌中克隆的ahaI和gapA基因表达出的蛋白为蛋白抗原制备油乳化疫苗，用饵料包埋后以口服途径免疫养殖牙鲆，评价免疫牙鲆的免疫应答和疫苗的保护效果。结果显示，以油乳化和未油乳化疫苗分别免疫牙鲆一周后，在后肠组织，AhaI和GapA乳化疫苗免疫组牙鲆检测到抗体，且分别高于AhaI和GapA未乳化疫苗免疫的牙鲆；而在血清，GapA的两种疫苗引起的GapA抗体水平没有变化；但在AhaI乳化疫苗免疫的牙鲆第21天和第35天的血清中检测到高于未免疫对照牙鲆的AhaI抗体水平，AhaI未乳化疫苗免疫牙鲆血清对照组相比没有检测到AhaI抗体水平的变化。

中国对虾病害的免疫防治研究

从不同方面研究了中国对虾免疫系统的组成及作用特点，并研究了天然免疫药物经口服后，对中国对虾免疫系统的作用。从提高对虾的自身免疫力入手，探讨全面有效地防治病害的新途径。用纸片法定量测定了11种天然免疫药物对弧菌的体外抑制效果，结果表明，有5种属高度敏感药物，其效果优于绝大多数抗菌素，可作为高效、低毒的天然抗菌药物应用于对虾养殖。于1994年4-9月，以海捕亲虾和养殖对虾为材料，用单向免疫扩散法（SRID）测定了不同机体状态对虾中的血淋巴因子，并进行了酚氧化酶（PO）活性测定及特性研究。在此基础上，以数种天然药物口服免疫养殖对虾后，运用SRID测定血淋巴免疫因子和运用改进后的方法测定PO活性。结果表明，对虾血淋巴中存在类似IgM样的物质，酚氧化酶在血细胞中以酶原形式存在，而在正常血清中也表现活力。类IgM的SRID测定及血清中PO活性测定可作为衡量对虾免疫功能的定性参考。口服免疫药物对中国对虾的免疫系统有激活作用。于1992年4月以海捕亲虾为材料，对其血淋巴中的抗菌、溶菌活力及PO活力进行了测定，并研究了经注射大肠杆菌、弧菌及酵母聚糖等刺激或感染后，上述活力的变化规律。结果表明，抗菌、溶菌活力变化与对虾免疫功能的增强或减弱呈相关性。可以此作为定量指标，研究对虾的机体状态、抗病机制及免疫药物的作用机理等。于1992年8-9月间，使用复合口服免疫药进行对虾免疫的中间试验，通过现场观测对虾的发病率、生长及增重速度，以及测定对虾体内的抗菌、溶菌活力和PO活力，证实口服免疫可显著提高对虾的抗病防病能力，并具有明显的促生长作用，可应用于大面积养殖。研究和实践表明，可以运用免疫学方法提高对虾的自身免疫力，从而全面有效地防治对虾病害。