723 resultados para Mécanisme enzymatique
Resumo:
Les fructose-1,6-bisphosphate aldolases (FBPA) sont des enzymes glycolytiques (EC 4.1.2.13) qui catalysent la transformation rversible du fructose-1,6-bisphosphate (FBP) en deux trioses-phosphates, le glycraldhyde-3-phosphate (G3P) et le dihydroxyactone phosphate (DHAP). Il existe deux classes de FBPA qui diffrent au niveau de leur mécanisme catalytique. Les classes I passent par la formation dun intermdiaire covalent de type iminium alors que les classes II, mtallodpendantes, utilisent gnralement un zinc catalytique. Contrairement au mécanisme des classes I qui a t trs tudi, de nombreuses interrogations subsistent au sujet de celui des classes II. Nous avons donc entrepris une analyse dtaille de leur mécanisme ractionnel en nous basant principalement sur la rsolution de structures cristallographiques. De nombreux complexes haute rsolution furent obtenus et ont permis de dtailler le rle de plusieurs rsidus du site actif de lenzyme. Nous avons ainsi corrig lidentification du rsidu responsable de labstraction du proton de lO4 du FBP, une tape cruciale du mécanisme. Ce rle, faussement attribu lAsp82 (chez Helicobacter pylori), est en fait rempli par lHis180, un des rsidus coordonant le zinc. LAsp82 nen demeure pas moins essentiel car il oriente, active et stabilise les substrats. Enfin, notre tude met en vidence le caractre dynamique de notre enzyme dont la catalyse ncessite la relocalisation du zinc et de nombreux rsidus. La dynamique de la protine ne permet pas dtudier tous les aspects du mécanisme uniquement par lapproche cristallographique. En particulier, le rsidu effectuant le transfert strospcifique du proton pro(S) sur le carbone 3 (C3) du DHAP est situ sur une boucle qui nest visible dans aucune de nos structures. Nous avons donc dvelopp un protocole de dynamique molculaire afin dtudier sa dynamique. Valid par ltude dinhibiteurs de la classe I, lapplication de notre protocole aux FBPA de classe II a confirm lidentification du rsidu responsable de cette abstraction chez Escherichia coli (Glu182) mais pointe vers un rsidu diffrent chez H. pylori (Glu149 au lieu de Glu142). Nos validations exprimentales confirment ces observations et seront consolides dans le futur. Les FBPA de classe II sont absentes du protome humain mais sont retrouves chez de nombreux pathognes, pouvant mme s'y rvler essentielles. Elles apparaissent donc comme tant une cible idale pour le dveloppement de nouveaux agents anti-microbiens. Lobtention de nouveaux analogues des substrats pour ces enzymes a donc un double intrt, obtenir de nouveaux outils dtude du mécanisme mais aussi dvelopper des molcules vise pharmacologique. En collaboration avec un groupe de chimistes, nous avons optimis le seul inhibiteur connu des FBPA de classe II. Les composs obtenus, la fois plus spcifiques et plus puissants, permettent denvisager une utilisation pharmacologique. En somme, cest par lutilisation de techniques complmentaires que de nouveaux dtails molculaires de la catalyse des FBPA de classe II ont pu tre tudis. Ces techniques permettront dapprofondir la comprhension fine du mécanisme catalytique de lenzyme et offrent aussi de nouvelles perspectives thrapeutiques.
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Une dite faible en sodium donne des rates lors de la dernire semaine de gestation induit une diminution de lexpansion volumique, du diamtre des artres utrines et du poids des placentas comparativement des rates tmoins. Ces perturbations suggrent une diminution de la perfusion placentaire affectant lapport foetal en nutriments. Les ratons naissent avec une restriction de croissance intra-utrine (RCIU). Chez le foetus, le substrat nergtique cardiaque principal est le glucose via la glycolyse. la naissance, la source principale dnergie est lutilisation des acides gras par la -oxydation. Nous mettons lhypothse que dans ce modle de RCIU, le coeur foetal rpond la diminution dapport nutritionnel due une atteinte maternelle en adaptant son mtabolisme nergtique cardiaque la baisse. Les rates gestantes (tmoins et recevant la dite faible en sodium) sont sacrifies au jour 22 de gestation (sur 23). Les coeurs foetaux sont prlevs afin de caractriser les protines dites limitantes in vitro des voies de la glycolyse et de la -oxydation. Les expressions protiques de GLUT1, GLUT4, HK1, HK2, CPT2, CPT1, cytochrome c, PFK1, PKM1/2, mesures par immunobuvardage de type Western, sont similaires entre les coeurs des foetus RCIU et tmoins, mles et femelles. Lexpression protique de CPT1 est diminue dans les coeurs des femelles RCIU seulement. Il nexiste aucune diffrence significative entre les diffrents groupes quant lactivit enzymatique de PKM1/2. Nos rsultats dressent un profil mtabolique gnral suggrant que le sexe du foetus peut avoir un effet sur la rponse cardiaque foetale une atteinte du volume sanguin maternel cause par la dite restreinte en sodium. Ce profil mtabolique semble dmontrer une atteinte du catabolisme des lipides. Afin de bien caractriser cette rponse du mécanisme nergtique, lactivit enzymatique des autres enzymes principales de la glycolyse (HK1, HK2, PFK1), le flux intra-mitochondrial dacyl CoA travers les CPTs ainsi que la quantit totale dactyl CoA devront tre quantifis.
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La division cellulaire est influence par les diffrents stimuli provenant de lextrieur ou de lintrieur de la cellule. Plusieurs rseaux enzymatiques labors au cours de lvolution relayent linformation gnre par ces signaux. Les modules MAP kinases sont extrmement importants au sein de la cellule. Chez lhumain, 14 MAP kinases sont regroupes en sept voies distinctes intervenant dans le contrle dune myriade de processus cellulaires. ERK3/4 sont des homologues de ERK1/2 pour lesquelles on ne connat que trs peu de choses concernant leurs fonctions et rgulation. Ces MAP kinases sont dites atypiques puisquelles ont des particularits structurales et des modes de rgulation qui diffrent des autres MAP kinases classiques. Ainsi, notre laboratoire a dmontr que lactivit de ERK3 est rgule par le systme ubiquitine-protasome et quelle pourrait avoir un rle jouer dans le contrle de la diffrenciation et la prolifration cellulaire. La premire tude prsente dcrit la rgulation de ERK3 au cours du cycle cellulaire. Nous avons observ que ERK3 est hyperphosphoryle et saccumule spcifiquement au cours de la mitose. Des analyses de spectromtrie de masse ont men lidentification de quatre sites de phosphorylation situs lextrmit du domaine C-terminal. Nous avons pu dmontrer que la kinase mitotique CDK1/cycline B phosphoryle ces sites et que les phosphatases CDC14A et CDC14B les dphosphorylent. Finalement, nous dmontrons que la phosphorylation mitotique de ERK3 a pour effet de la stabiliser. Au dbut de mes tudes doctorales, la kinase MK5 fut identifie comme premier partenaire et substrat de ERK3. MK5 a trs peu de fonctions connues. Des donnes dans la littrature suggrent quelle peut moduler le cycle cellulaire dans certaines conditions. Par exemple, MK5 a rcemment t identifi comme inducteur de la snescence induite par loncogne Ras. Dans la deuxime tude, nous dcrivons une nouvelle fonction de MK5 dans le contrle du cycle cellulaire. Nous dmontrons par des expriences de gain et perte de fonction que MK5 ralentit lentre en mitose suite un arrt de la rplication. Cette fonction est dpendante de lactivit enzymatique de MK5 qui rgule indirectement lactivit de CDK1/cycline B. Finalement, nous avons identifi Cdc25A comme un nouveau substrat in vitro de MK5 dont la surexpression supprime leffet de MK5 sur lentre en mitose. En conclusion, nos rsultats dcrivent un nouveau mécanisme de rgulation de ERK3 au cours de la mitose, ainsi quune nouvelle fonction pour MK5 dans le contrle de lentre en mitose en rponse des stress de la rplication. Ces rsultats dmontrent pour la premire fois limplication de ces protines au cours de la transition G2/M. Nos travaux tablissent de nouvelles pistes dtudes pour mieux comprendre les rles encore peu dfinis des kinases ERK3/4-MK5.
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Le lait crm est utilis depuis plus dun demi-sicle comme diluant protecteur des spermatozodes de mammifres. Depuis quelques annes, il existe une demande grandissante pour des diluants exempts de produits dorigine animale. Toutefois, le mécanisme par lequel le lait protge les spermatozodes nest pas connu, ce qui rend difficile de lui trouver un substitut. Les protines majeures du plasma sminal de taureau, les protines Binder of SPerm (BSP), sont nfastes lors de la conservation de la semence. Les spermatozodes sont en contact avec une grande concentration de protines BSP qui stimulent une extraction continuelle de cholestrol/phospholipides de leur membrane plasmique. Les lipoprotines de faible densit (LDL) du jaune doeuf, un autre compos utilis dans les diluants, empcheraient les protines BSP de se lier la membrane des spermatozodes de taureaux et de stimuler un efflux des lipides membranaires, ce qui les protgerait durant la conservation. Notre hypothse tait que les protines du lait protgent les spermatozodes durant la conservation en squestrant les protines BSP. Premirement, nous avons dmontr par filtration sur gel quil y a une interaction entre les protines BSP bovines et les protines du lait. Le lait crm a t fractionn en trois fractions : F1 (alpha-lactalbumine, bta-lactoglobuline et casine kappa), F2 (toutes les protines du lait) et F3 (sels, sucres et petits peptides). Les protines BSP1 et BSP5 ont une affinit plus grande pour F1 que BSP3, tandis que toutes les protines BSP ont une affinit pour F2. Le titrage calorimtrique isotherme a permis de confirmer linteraction entre les protines BSP et les protines du lait. Lassociation entre la protine BSP1 bovine et les micelles de casines est caractrise par une constante daffinit (Ka) de 3.5 10^5 M-1 et un paramtre stoichiomtrique (n) de 4,5 BSP1 pour une casine. Lassociation entre la protine BSP1 bovine et lalpha-lactalbumine (une protine du srum principale), est caractrise par un Ka de 2.4 10^5 M-1 et une valeur n de 0,8. Ces rsultats indiquent que le lait protge les spermatozodes bovins en squestrant les protines BSP grce une interaction protine : protine, tandis que le jaune doeuf les protge grce une interaction protine : lipoprotine. Deuximement, nous avons dmontr par filtration sur gel que les protines homologues aux BSP bovines retrouves dans le plasma sminal de porc, dtalon et de blier ont une affinit avec les protines du lait, ce qui suggre que le mécanisme de protection des spermatozodes par le lait pourrait tre le mme chez ces espces. Troisimement, nous avons caractris linteraction entre BSP1 bovine et les LDL du jaune doeuf qui a un Ka de 3.4 0.4 10^6 M-1 et une valeur de n de 104 BSP1 pour une particule de LDL, indiquant quil existe des diffrences entre le mécanisme de protection des spermatozodes par le lait et le jaune doeuf. Nous croyons que les rsultats prsents dans cette thse aideront crer de nouveaux diluants ne contenant pas de produits dorigine animale afin de cryoconserver les spermatozodes des mammifres.
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Les diffrentes protines accessoires du VIH-1, lagent tiologique du SIDA, optimisent la rplication et la propagation du virus in vivo. Parmi ces dernires figure Vpu, lantagoniste du facteur de restriction nomm Tetherin qui prvient la relche des particules virales partir de la surface de cellules infectes. En diminuant son expression de surface, Vpu prvient lincorporation de ce facteur de restriction dans la particule virale en formation et consquemment, empche la formation dune ancre protique reliant le virus mature la membrane plasmique de la cellule infecte. La mcanistique sous-jacente ntait cependant pas connue. Cette prsente thse relate nos travaux excuts afin dlucider la dynamique des mécanismes cellulaires responsables de cet antagonisme. Une approche de mutagnse dirige a dabord permis didentifier deux rgions contenant des dterminants de la localisation de Vpu dans le rseau trans-Golgi (RTG), puis de dmontrer la relation existante entre cette distribution et laugmentation de la relche des particules virales. Des expriences subsquentes de marquage mtabolique suivi dune chasse excutes dans des systmes cellulaires o Tetherin est exprime de faon endogne ont suggr le caractre dispensable de linduction par Vpu de la dgradation du facteur de restriction lors de son antagonisme. En revanche, une approche de rexpression de Tetherin conduite en cytomtrie en flux, confirme en microscopie confocale, a mis en vidence une squestration de Tetherin dans le RTG en prsence de Vpu, phnomne qui sest avr ncessiter linteraction entre les deux protines. Lusage dun systme dexpression de Vpu inductible conjugu des techniques de cytomtrie en flux nous a permis dapprcier leffet majeur de Vpu sur la Tetherin no-synthtise et plus mineur sur la Tetherin de surface. En prsence de Vpu, la squestration intracellulaire de la Tetherin no-synthtise et la lgre acclration de linternalisation naturelle de celle en surface se sont avres suffisantes la rduction de son expression globale la membrane plasmique et ce, temps pour linitiation du processus de relche virale. la lumire de nos rsultats, nous proposons un modle o la squestration de la Tetherin no-synthtise dans le RTG prviendrait le rapprovisionnement de Tetherin en surface qui, combine avec linternalisation naturelle de Tetherin partir de la membrane plasmique, imposerait ltablissement dun nouvel quilibre de Tetherin incompatible avec une restriction de la relche des particules virales. Cette thse nous a donc permis didentifier un processus par lequel Vpu augmente la scrtion de virus matures et tablit une base mcanistique ncessaire la comprhension de la contribution de Vpu la propagation et la pathognse du virus, ce qui pourrait mener llaboration dune stratgie visant contrer leffet de cette protine virale.
tude du mécanisme par lequel la thrapie l'IL7 induit l'expansion homostatique des lymphocytes T CD4+
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Dans les cas de lymphopnie, les lymphocytes T rsiduels prolifrent exagrment dans un phnomne appel expansion homostatique priphrique (HPE), qui est efficace pour la rgnration des T CD8+, mais inefficace pour les T CD4+. Linterleukine-7 (IL7) est une cytokine homostatique utilise afin daugmenter les comptes lymphocytaires T des patients lymphopniques. Toutefois, la raison de lexpansion prfrentielle des lymphocytes T CD8+ par lIL7 demeure toujours inconnue. Nous montrons que cette expansion est due au fait que lIL7 induit une prolifration efficace des T CD8+ priphriques (CD8+PERI) ainsi que des migrants thymiques CD8+ (CD8+RTEs). Par contre, leffet prolifratif de lIL7 est restreint presquuniquement aux CD4+RTEs mme si les CD4+PERI survivent mieux que les CD4+RTEs. De plus faibles doses dIL7 sont ncessaires aux CD4+RTEs afin de phosphoryler STAT5 ou de prolifrer comparativement aux CD4+PERI et nous dmontrons que les contacts TCR/CMHII sont ncessaires la prolifration induite par lIL7 des CD4+RTEs en priphrie. De fait, augmenter au Flt3 ligand le nombre de cellules dendritiques priphriques dune souris donneuse, avant de transfrer ses TPERI dans des souris receveuses traites lIL7 induit une prolifration significative des CD4+PERI. Nos rsultats indiquent donc que labondance des contacts TCR/CMHII reus dans le thymus semble contrler la sensibilit lIL7 des CD4+RTEs. Finalement, lobservation que les CD8+PERI et CD8+RTEs prolifrent pareillement pendant la thrapie lIL7, alors que la prolifration des T CD4+ est largement restreinte aux RTEs expliquerait pourquoi, dans les cas de lymphopnie, la rgnration des T CD4+ est aussi dpendante de la thymopose.
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La thse a t ralise en cotutelle avec l'Universit Paul Cazanne (Aix Marseille III).
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Les mécanismes cellulaires anti-prolifratifs, lesquels comprennent lapoptose, aussi appele la mort cellulaire programme, larrt transitoire du cycle cellulaire et la snescence, permettent la cellule de prvenir, en rponse diffrents stress, laccumulation de mutations pouvant conduire une prolifration incontrle et, ventuellement, au dveloppement dune tumeur. La rgulation de ces diffrents mécanismes requiert lactivation de protines appeles des suppresseurs de tumeur, dont le principal est p53. p53 est un facteur de transcription dont la stabilisation et lactivation conduit une hausse de lexpression de gnes directement impliqus dans larrt de la prolifration. Au cours des dernires annes, lensemble des travaux sur p53 ont permis de mettre en vidence la complexit de sa fonction, de mme que la multitude de voies de signalisation et de protines avec lesquelles il coopre pour maintenir lintgrit du gnome. De ce fait, ltude des mécanismes dactivation de p53 est de mise pour la comprhension de sa rgulation et, ventuellement, pour la prvention et llaboration de nouvelles stratgies de traitement contre le cancer. Lobjet de cette thse est la mise en vidence dun mécanisme dactivation de p53 et de la snescence par la protine SOCS1, un suppresseur de la signalisation par les cytokines. Ce mécanisme implique une interaction directe entre les deux protines, plus prcisment entre le domaine SH2 de SOCS1 et le domaine de transactivation de p53. SOCS1 interagit galement, au niveau de son SOCS Box, avec les kinases ATM et ATR de la voie du dommage lADN de faon faciliter la phosphorylation de p53 en srine 15. Ainsi, en interagissant la fois avec p53 et ATM/ATR, SOCS1 contribue la stabilisation et lactivation de p53. En accord avec ce modle, linhibition de SOCS1 dans des fibroblastes humains normaux tend diminuer le nombre de cellules snescentes suite lexpression de loncogne ca-STAT5A et rduire laccumulation nuclaire de p53 dans ces cellules. De la mme faon, les lymphocytes T provenant de souris Socs1-/-Ifn-/- sont moins susceptibles dentrer en apoptose que les lymphocytes provenant de souris Socs1+/+Ifn+/+, suite une exposition des radiations. Dans les deux contextes, on observe une baisse de lexpression des gnes cibles de p53, ce qui dmontre que SOCS1 est implique dans lactivation de p53 in vivo. Cette thse a galement pour but de mettre en vidence limplication de SOCS1 dans lactivation dautres facteurs de transcription et, par le fait mme, de dmontrer quelle peut agir comme un rgulateur plus gnral de la transcription. Une tude approfondie de linteraction entre SOCS1 et p53 a permis de dmontrer que le domaine de transactivation II de p53 (acides amins 36-67) est suffisant pour linteraction. Plus prcisment, il semble que le tryptophane 53 (W53) et la phnylalanine 54 (F54) sont les principaux rsidus impliqus. Une analyse structurale de ce domaine de p53 a conduit lidentification dun motif conserv dans plusieurs autres facteurs de transcription pourvus dun domaine de transactivation acide, dont p63, p73 et E2F1. En accord avec ces rsultats, SOCS1 est en mesure dinteragir avec chacune des deux protines. Ainsi, la capacit de SOCS1 dinteragir et de rguler lactivit de p53 peut stendre dautres facteurs de transcription. En terminant, le mécanisme prsent dans cette thse contribue la comprhension de la rgulation de p53, le principal suppresseur de tumeur de la cellule. De plus, il met en vidence une nouvelle fonction de SOCS1, laquelle tait jusqualors essentiellement connue pour inhiber la voie de signalisation JAK/STAT. Ce nouveau rle pour SOCS1 permet dexpliquer de quelle manire une activation aberrante de la signalisation par les cytokines peut dclencher la snescence ou lapoptose. Enfin, le fait que SOCS1 puisse rguler diffrents facteurs de transcription permet de la qualifier de rgulateur gnral des facteurs de transcription composs dun domaine de transactivation acide.
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Tau est une protine associe aux microtubules enrichie dans laxone. Dans la maladie dAlzheimer, Tau devient anormalement hyperphosphoryle, saccumule dans le compartiment somato-dendritique et sagrge pour former des enchevtrements neurofibrillaires (NFTs). Ces NFTs se propagent dans le cerveau dans un ordre bien prcis. Ils apparaissent dabord dans le cortex transenthorinal pour ensuite se propager l o ces neurones projettent, cest--dire au cortex entorhinal. Les NFTs stendent ensuite lhippocampe puis diffrentes rgions du cortex et nocortex. De plus, des tudes rcentes ont dmontr que la protine Tau peut tre scrte par des lignes neuronales et que lorsquon injecte des agrgats de Tau dans un cerveau de souris, ceux-ci peuvent pntrer dans les neurones et induire la pathologie de Tau dans le cerveau. Ces observations ont men lhypothse que la protine Tau pathologique pourrait tre scrte par les neurones, pour ensuite tre endocyte par les cellules avoisinantes et ainsi propager la maladie. Lobjectif de la prsente tude tait donc de prouver la scrtion de la protine Tau par les neurones et didentifier par quelle voie elle est secrte. Nos rsultats ont permis de dmontrer que la protine Tau est scrte par des neurones corticaux de souris de type sauvage ainsi que dans un modle de surexpression dans des cellules HeLa et PC12. Nos rsultats indiquent que la scrtion de Tau se ferait par les autophagosomes. Finalement, nous avons dmontr que la protine Tau scrte est dphosphoryle et clive par rapport la protine Tau intracellulaire non scrte.
Resumo:
Thse numrise par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Universit de Montral.
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Thse numrise par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Universit de Montral
Resumo:
Thse diffuse initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Universit de Montral/Centre d'dition numrique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.
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Thse diffuse initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Universit de Montral/Centre d'dition numrique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.
