Essentielle Thrombozythämie

Retrospektive Analyse von 189 Patienten mit einer ETH, Auswertung von Diagnostik, Therapie, Nebenwirkungen und Komplikationen.

Atherosklerose und Apoptose

Subendothelial in den Arterienwänden abgelagertes LDL kann einer enzymatischen Modifikation unterliegen, die es in einen cytotoxischen Partikel überführt. In vitro Behandlung von LDL mit Proteasen (Trypsin) und Cholesterinesterase führt zu einem dem läsionalen LDL ähnlichen Produkt. Die Behandlung von humanen Endothelzellen mit enzymatisch verändertem LDL (E-LDL), das einen hohen Gehalt an freiem Cholesterin und freien Fettsäuren aufweist, führt zur Auslösung der Apoptose via ASK1 (apoptosis signal-regulating kinase 1) –abhängiger p38-Phosphorylierung. Durch eine Aktivierung der Effektor-Caspasen-3/-7 kommt es zur Fragmentierung der DNA und zur Spaltung des nukleären Enzyms Poly-(ADP-ribose)-Polymerase. Phosphatidylserin ist an der äußeren Zellmembran mittels Annexin-Bindung detektierbar. Natives oder oxidiertes LDL induziert bei gleicher Konzentration keinen programmierten Zelltod. In Depletions- und Rekonstitutionsexperimenten wurden freie Fettsäuren aus E-LDL als Auslöser der Apoptose identifiziert. In nativem LDL ist der Anteil an freien Fettsäuren gering, deshalb ist das Lipoprotein nicht cytotoxisch. E-LDL induziert weiterhin eine Erhöhung bzw. eine Hemmung der transkriptionellen Aktivität eines AP-1- bzw. NF-κB-Luciferase Reporterplasmids. Die Ausschaltung von ASK1 mittels RNA-Interferenz bzw. die Hemmung von p38 mit dem Inhibitor SB203580 rettet die Zellen vor dem programmierten Zelltod. E-LDL kann in Endothelzellen oxidativen Stress auslösen. Durch Vorbehandlung mit N-Acetyl-Cystein wird die Aktivierung sowohl von ASK1 als auch von p38 unterdrückt.

Wertigkeit der Magnetresonanzangiographie der Fußgefäße unter Verwendung eines intravaskulären Kontrastmittels

In der vorliegenden Arbeit soll der Stellenwert der ce-MRA unter Verwendung von MS-325, einem neuen intravaskulären Kontrastmittel, bei der Untersuchung der Fußgefäße im Vergleich zur DSA bewertet, und das Übereinstimmen der Befunde zweier unterschiedlich erfahrener Untersucher untersucht werden. Im Rahmen einer klinischen Phase-III-Studie wurden 18 Patienten mit pAVK und / oder diabetischem Fußsyndrom rekrutiert. Die ce-MRA-Untersuchungen wurden in einem 1,5-Tesla-Magnetom durchgeführt. Dabei wurden dynamische Serien und eine hochaufgelöste Steady-state-Sequenz des zu untersuchenden Fußes akquiriert. Als Kontrastmittel wurde MS-325 in einer an das Körpergewicht adap-tierten Dosis appliziert. Die DSA-Untersuchung enthielt eine komplette Becken-Bein-Angiographie mit selektiver Darstellung der Fußgefäße. Vor der Befundung wurden die Bilddaten der MR-Angiographie nachbearbeitet und MIP-Projektionen erstellt. Zwei Untersucher befundeten unabhängig voneinander und in zufälliger Reinfolge die MRA, die DSA wurde in einem Konsensusverfahren beider Unter-sucher beurteilt. In eine qualitative Analyse gingen die Bewertung der Bildquali-tät, die Sichtbarkeit von sieben Gefäßsegmenten und deren hämodynamisch relevanter Stenosegrad ein. Quantitativ wurde das Signal-Rausch-Verhältnis und das Kontrast-Rausch-Verhältnis untersucht. Die Bildqualität beider Modalitäten wurde im Median mit gut bewertet. Hinsichtlich der Sichtbarkeit der Gefäßsegmente zeigte sich die ce-MRA der DSA überlegen. Von insgesamt 126 Gefäßsegmenten waren nur 80 in der DSA sichtbar, dagegen waren 106 Gefäßsegmente in der ce-MRA sichtbar (p-Wert <0,001, McNemar-Test). Die Übereinstimmung zwischen beiden Untersuchern der ce-MRA war sehr gut, beide erkannten 105 von 126 Gefäßsegmenten (Kappa-Maß κ=0,97). Beide Modalitäten werteten übereinstimmend 46 Gefäßsegmente als hämodynamisch relevant stenosiert. 16 Gefäßstenosen wurden durch die ce-MRA im Gegensatz zur DSA überbewertet. Zwischen Untersucher 1 und Untersucher 2 der ce-MRA fand sich erneut eine sehr gute Übereinstimmung (Kappa-Maß к = 0,89). Die Messungen des SNR und des CNR ergaben sowohl in den dynamischen Se-quenzen als auch in der später akquirierten hochaufgelösten Steady-state Unter-suchung hohe Werte. Die Bildqualität der hochaufgelösten Steady-state ce-MRA war hervorragend, jedoch beeinträchtigt venöse Überlagerung die Interpretation. In der Literatur wird die ce-MRA als ein geeignetes Verfahren zur Darstellung von Fußgefäßen beschrieben. Zahlreiche Studien zeigen, dass mit der ce-MRA mehr Gefäßsegmente dargestellt werden können. Dieses Ergebnis konnte in der vor-liegenden Arbeit bestätigt werden. Eine mit MS-325 verstärkte Magnetresonanz-angiographie der Fußgefäße ist der selektiven DSA überlegen. Die Tatsache, dass mit der ce-MRA mehr Gefäßsegmente dargestellt werden können, hat den Begriff des angiographisch „verborgenen“ Blutgefäßes initiiert. In vielen klini-schen Zentren hat die ce-MRA die DSA weitgehend verdrängt. Aus diesem Grund wird in der Literatur vorgeschlagen, dass die ce-MRA die DSA als einen „verbes-serten Goldstandard“ ersetzten könnte. Kann mit der DSA kein passendes An-schlussgefäß für eine Revaskularisationsmaßnahme mittels Bypass gefunden werden, so sollte auf jeden Fall eine ce-MRA der Fußgefäße durchgeführt wer-den, um eine Amputation zu verhindern. In der Literatur wird von der Änderung der Behandlungsstrategie nach der Durchführung der ce-MRA berichtet. Bei der Klassifikation von Gefäßstenosen wertet die ce-MRA öfter höher als die DSA, diese Überbewertung ist in der Literatur bekannt und konnte ebenfalls in der vorliegenden Arbeit bestätigt werden. Diese Überschätzung resultiert aus „Spin-Dephasierung“ durch turbulente Blutströmung im Bereich einer Stenose oder besteht auf Grund von Partialvolumeneffekten. Die Verwendung eines intravaskulären Kontrastmittels, wie bsw. MS-325, zur MR-Angiographie bringt den Vorteil, dass sowohl dynamische als auch Steady-state Untersuchungen aller vaskulären Strukturen im menschlichen Körper durchge-führt werden können. Da eine hohe Signalintensität über einen langen Zeitraum besteht, können auch mehrere Körperregionen während einer einzigen Untersu-chung dargestellt werden. Nachteilig ist jedoch die Beeinträchtigung der Bildge-bung durch venöse Überlagerung. Mittels computergestützter Bildnachbearbeitung ist es jedoch möglich, Venen in Steady-state-Sequenzen zu unterdrücken und daraus ergibt sich die Möglichkeit, hochaufgelöste, überlage-rungsfreie Datensätze zu erhalten. Diese könnten dann der erste Schritt in Rich-tung einer Perfusionsbildgebung am Fuß sein, um bsw. den Erfolg von Revaskularisationsmaßnahmen auch auf Kapillarebene beurteilen zu können.

Der Einfluss von Hypothermie oder Dexmedetomidin auf den neuronalen Zelluntergang nach inkompletter zerebraler Hemisphärenischämie und Reperfusion bei der Ratte

Es ist bekannt, dass sowohl Hypothermie (HT) als auch Dexmedetomidin (DEX) das neurologische Endergebnis verbessern können. In dieser Studie wird der Einfluss von HT oder DEX auf den neuronalen Zelluntergang bei 104 Ratten nach inkompletter zerebraler Hemisphärenischämie durch unilaterale Karotis-Okklusion unter hämorrhagischer Hypotension und anschließender Reperfusion untersucht. In beiden Behandlungs-Gruppen zeigt sich gegenüber der Kontroll-Gruppe in der Hämatoxylin-Eosin-Färbung eine tendentielle Reduktion des Ausmaßes der Schädigung und der Anzahl nekrotischer Zellen, in der immunhistologischen Färbung mit Antikörpern gegen aktivierte Caspase-3 eine tendentielle Verringerung apoptotischer Zellen. Diese Arbeit deutet darauf hin, dass sowohl HT als auch DEX den neuronalen Schaden nach zerebraler Ischämie tendentiell zu reduzieren vermögen.

Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme an nozizeptiven Spinalganglienneuronen der Ratte

Die freien Endigungen von Spinalganglienneuronen sind für die Detektion schmerzhafter Reize verantwortlich. Dabei rufen thermische, chemische oder mechanische Reize Ionenströme über die Membran und dadurch Membranpotentialänderungen hervor. Diese noxisch induzierten Ströme sind in großem Ausmaß durch chemische Substanzen und andere Reize modulierbar. Der Ionenkanal TRPV1 ist für die Detektion zahlreicher chemischer Reize und zumindest eines Teils der noxischen Hitzereize verantwortlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurden einige der Mechanismen geklärt, die zur schnellen Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme führen. Hierfür wurden akut dissoziierte Spinalganglienneurone der Ratte als Modell ihrer peripheren Endigung verwendet und mittels Ganzzellableitung in der patch-clamp-Technik untersucht. Die Verwendung von Trypsin während der Präparation von Spinalganglienneuronen hat keinen funktionellen Einfluss auf hitze- oder capsaicininduzierte Ströme, verbessert aber die Untersuchungsbedingungen für das patch-clamp-Verfahren. Bei 144 akut dissoziierten Spinalganglienneuronen wurden die Stromantworten auf drei im Abstand von 40 s durch Überspülen mit 45,3 bis 46,3°C heißer Extrazellularlösung applizierte einsekündige Hitzereize gemessen. Dabei ließen sich repetitiv reproduzierbare hitzeinduzierte Einwärtsströme von etwa 160 pA erzielen; es konnte keine Tachyphylaxie und nahezu keine Inaktivierung beobachtet werden. Direkt vor dem zweiten Hitzereiz wurden die Neurone für zwei Sekunden mit Extrazellularlösung überspült, die Kontrolllösung, 0,5 μM Capsaicin, 10 μM Natriumnitroprussid oder 10 μM YC-1 enthielt. Es fand sich kein Hinweis, dass Stickstoffmonoxid oder die Guanylatzyklase einen signifikanten Beitrag zur Sensibilisierung von hitzeinduzierten Strömen in Spinalganglienneuronen leisten, wobei ein durch den Versuchsaufbau bedingtes Auswaschen zytosolischer Faktoren, die für den Signalweg notwendig sind, nicht ausgeschlossen werden kann. Bei einer Konzentration von 0,5 μM löst Capsaicin für zwei Sekunden einen sehr kleinen Einwärtsstrom von etwa 33 pA aus und führt innerhalb von zwei Sekunden zu einer schnell reversiblen Sensibilisierung von hitzeinduzierten Einwärtsströmen in Spinalganglienneuronen (p<0,01). Das Ausmaß der Sensibilisierung ist proportional zur Größe des capsaicininduzierten Stromes (r=−0,7, p<0,001). Konstant halten der intrazellulären Calciumkonzentration mittels des Calciumchelators BAPTA verhindert die capsaicininduzierte Sensibilisierung hitzeinduzierter Ströme an Spinalganglienneuronen. Demzufolge beruht die capsaicininduzierte Sensibilisierung trotz der schnellen Kinetik nicht auf einer synergistischen Wirkung der beiden Agonisten Capsaicin und Hitze auf ihren gemeinsamen Rezeptor; vielmehr ist sie von einer Erhöhung der intrazellulären freien Calciumkonzentration abhängig. Funktionelle Änderungen der zellulären Funktion werden häufig durch Proteinkinasen vermittelt. Die zur Gruppe der MAP-Kinasen gehörende ERK (extracellular signal related kinase) wird bei Membrandepolarisation und Calciumeinstrom in die Zelle durch MEK (MAPK/extracellular signal related kinase kinase) aktiviert. Blockade der MEK/ERK-Kaskade durch den spezifischen MEK-Hemmstoff U0126 führt ebenfalls zu einer Aufhebung der Sensibilisierung der Hitzeantworten durch Capsaicin. Applikation von Capsaicin führt innerhalb von zwei Sekunden zu einer schnell reversiblen Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme an nozizeptiven Spinalganglienneuronen. Diese Sensibilisierung wird durch einen Calciumeinstrom in die Zelle und die dadurch eintretende Aktivierung von Proteinkinasen hervorgerufen. Die MEK/ERK-Kaskade ist ein sehr schnell (deutlich unter 2 s) aktivierbares intrazelluläres Signalsystem, welches bei der Regulation der Empfindlichkeit nozizeptiver Spinalganglienneurone eine entscheidende Rolle spielt; die schnelle Kinetik ist dabei nur durch eine membranständige oder zumindest membrannahe Lokalisation dieser Proteinkinasen erklärbar. Durch Applikation zehnsekündiger Hitzereize lässt sich ebenfalls eine Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme auslösen, die ebenso ausgeprägt ist, wie die Sensibilisierung durch 0,5 μM Capsaicin (p<0,005). Durch das immer größere Verständnis der Funktionsweise des nozizeptiven Systems ergeben sich ständig neue Ansätze für die Entwicklung neuer Analgetika. So könnte durch Modulation spezifischer intrazellulärer Proteinkinasen der Phosphorylierungszustand und damit die Aktivierbarkeit von Ionenkanälen, die der Transduktion noxischer Reize dienen, positiv beeinflusst werden. Neuere, noch spezifischere Inhibitoren der MEK können der Forschung und später auch der Therapie neue Möglichkeiten eröffnen.

Sahaja Yoga im Vergleich mit der Progressiven Muskelrelaxation nach Jacobson

Fragestellung: In der vorliegenden Arbeit wird erstmals das Sahaja Yoga (SY) bezüglich seiner Effektivität in der komplementären Behandlung von Patienten mit Mamma- oder Prostatakarzinom untersucht und mit der Progressiven Muskelrelaxation nach Jacobson (PMR) verglichen. Methoden: Zu diesem Zweck wurden 16 Patienten mit Prostatakarzinom und 21 Patientinnen mit Mammakarzinom im Rahmen einer stationären Anschlußheilbehandlung (AHB) rekrutiert und jeweils mittels Zufallstabelle entweder einer SY-Gruppe oder einer PMR-Gruppe zugeteilt. Die Patienten übten während des dreiwöchigen Aufenthalts zusätzlich zu den jeweiligen physikalischen und physiotherapeutischen Therapien die entsprechenden Entspannungsverfahren (SY oder PMR) insgesamt acht mal und wurden dazu angehalten, die Verfahren auch in Eigenregie fortzuführen. Die Patienten füllten zu Beginn ihres Aufenthaltes (t1), nach 3 Wochen (Ende der AHB, t2) sowie 2 Monate nach dem Beenden der AHB (t3) folgende Fragebögen aus: den SF-36 von Bullinger et al. (1995) zur Erfassung von gesundheitsbezogener Lebensqualität, die HADS von Hermann et al. (1995) zur Erfassung von Angst und Depressivität und zwei vom Autor selbstkonzipierte Fragebögen, mit denen die Anzahl und Dauer der durchgeführten Übungen registriert wurden. Den MDBF von Steyer et al. (1997) (für aktuelle Befindlichkeit) füllten die Patienten jeweils direkt vor und nach der ersten (t1v und t1n) und letzten (t2v und t2n) Entspannungsübung und zum Zeitpunkt t3 aus. Ergebnisse: Fast alle Testwerte des Gesundheitsfragebogens SF-36 steigen (teils statistisch signifikant) bei beiden Gruppen von dem Zeitpunkt t1 über t2 zu t3 an. Es scheinen zwar die Verbesserungen der SY-Gruppe gegenüber der PMR-Gruppe etwas zu überwiegen, statistisch konnte dies jedoch nicht belegt werden. Bei den Subskalen der HADS (Angst und Depression) fallen die Werte bei beiden Gruppen von Zeitpunkt t1 über t2 zu t3 ab, statistisch signifikant ist der Abfall jedoch nur von t1 zu t2 bei den Werten der HADS-D (Depression) bei der SY-Gruppe. Die Testwerte sinken bei der SY-Gruppe im Verlauf etwas steiler ab als die Testwerte der PMR-Gruppe, signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen lassen sich jedoch nicht finden. Die Testwerte des MDBF (Kurzform A) steigen von dem Zeitpunkt t1v über t2v zu t3 bei beiden Gruppen (bei der SY-Gruppe etwas steiler, jedoch ohne signifikanten Unterschied zur PMR-Gruppe) nur zum Teil signifikant an. Die Werte vor und nach den jeweiligen Anwendungen (Zeitpunkt t1v zu t1n und t2v zu t2n) unterscheiden sich signifikant bei beiden Gruppen. Bezüglich der Dauer und Anzahl der durchgeführten Anwendungen zeigen sich keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen. Schlußfolgerungen: Die Patienten konnten beide Verfahren gleich gut annehmen. Bezüglich der gesundheitsbezogenen Lebensqualität, Angst und Depressivität sowie der aktuellen Befindlichkeit scheint sowohl das SY als auch die PMR (in dieser Studie) relevante Effekte zu haben. Diese Effekte scheinen sich auch nach 2 Monaten weiter positiv auszuwirken. Statistisch ließen sich zwischen beiden Verfahren keine Unterschiede hinsichtlich ihrer Wirkung belegen. Die Ergebnisse müssen allerdings durch weitere Untersuchungen mit größerer Probandenzahl genauer geprüft werden.

Neue palliative Therapieoptionen des kolorektalen Karzinoms

6. Zusammenfassung In der palliativen Therapie des metastasierten kolorektalen Karzinoms gibt es durch die Verbesserung der klassischen Therapien und die Entwicklung neuer Strategien inzwischen eine Vielzahl von Behandlungsoptionen. Die zwei Studien dieser Arbeit untersuchen das „älteste“ eingesetzte Zytostatikum in der Therapie des Kolonkarzinom, 5-Flurouracil, einmal in der Zweitlinientherapie als Hochdosisinfusionstherapie mit und Biomodulation mit Folinsäüre und einmal als Erstlinientherapie in Kombination mit Irinotecan im FOLFIRI-Protokoll. In der Zweitlinienbehandlung ergab sich hierbei ein geringer Vorteil in den Krankheitskontrollraten (57% vs. 44%) bei vergleichbaren Ansprechraten für die längere 5-FU-Infusion ohne Biomodulation. Bezüglich des Gesamtüberleben ab Beginn der Zweitlinientherapie und des Progressionsfreien Überleben zeigte die nicht biomodulierte Gruppe bessere, statistisch jedoch nicht signifikante Ergebnisse (16 vs. 9 bzw. 7,5 vs. 6 Monate). In der Erstlinientherapie erreichten wir eine Tumorkontrollrate von 74%, 4 komplette Remissionen (11%) und bei 3 Patienten die Möglichkeit einer Nachresektion der Lebermetastasen mit kurativem Ansatz. Der neoadjuvante Einsatz dieser Therapie sollte aufgrund dieser Ergebnisse weiter untersucht werden. Das Gesamtüberleben lag bei 17 Monaten (i.r. 9-25 Monate), die progressionsfreie Zeit mit 7 Monaten lag im Bereich unserer Zweitlinienstudie. Für beide Therapien befand sich die Toxizität im Rahmen der Erwartungen, die Symptome waren reversibel und im Allgemeinen akzeptabel. Ein Vergleich der Lebensqualität vor und während der Erstlinientherapie ergab für unsere Patienten keine deutlichen Veränderungen. Die Ergebnisse unserer untersuchten Studien zeigen, dass beide Therapien wirksame und gut verträgliche Optionen in der palliativen Behandlung des kolorektalen Karzinoms darstellen. Für jeden Patienten sollte aus der Vielzahl der bestehenden Möglichkeiten die für ihn bestmögliche individuelle Therapie ermittelt werden.

Ansatz zur Generierung einer konditionalen, reversiblen Wt1 k.o.-Maus

Ansatz zur Generierung einer konditionalen, reversiblen Wt1 k.o.-Maus Der Wilms-Tumor (WT, Nephroblastom) ist ein embryonaler Nierentumor, der durch die maligne Transformation von undifferenziertem Nierengewebe, sog. nephrogenen Resten, entsteht. WT treten mit einer Inzidenz von 1 in 10.000 Lebendgeburten auf. Das Hauptmanifestationsalter, der normalerweise einseitig und sporadisch auftretenden Tumore, liegt zwischen dem 3. und 4. Lebensjahr. Etwa 10 % der Patienten entwickeln jedoch bilaterale Tumore. In diesen Fällen ist eine Assoziation mit komplexen genetischen Krankheitsbildern (u. a. WAGR-, Denys-Drash-, Frasier- und Beckwith-Wiedemann-Syndrom) festzustellen. In 15 % der sporadischen WT sind Mutationen im WT1 (Wilms-Tumor 1)-Gen beschrieben. WT1 besteht aus zehn Exons und weist typische Merkmale von Transkriptionsfaktoren (z. B. vier Zinkfinger) auf. Zwei alternative Spleißereignisse betreffen Exon 5 (+/−Exon 5) und Exon 9 (Transkripte mit bzw. ohne die codierenden Sequenzen für die AS Lysin-Threonin-Serin; +/−KTS). Die Lage der drei alternativ vorhandenen AS zwischen den Zinkfingern 3 und 4 bestimmt die verschiedenen Funktionen der WT1-Proteine (4 Isoformen) als Transkriptionsfaktor (−KTS) bzw. als RNA-bindendes Protein (+KTS). Das zunächst im Zusammenhang mit WT als Tumorsuppressorgen identifizierte WT1 ist ein Entwicklungsgen mit einem sehr komplexen Expressionsmuster in der Embryonalentwicklung. Dabei ist v. a. die Bedeutung in der Urogenitalentwicklung entscheidend. Konstitutive, homozygote Wt1−/− k.o.-Mäuse sind embryonal (~ E12,5 dpc) letal und bilden u. a. keine Gonaden und keine Nieren. Aus diesem Grund existiert bisher kein Wilms-Tumormodell. Die Herstellung eines konditionalen murinen Tiermodells auf Basis des Tet on/off-Systems zur Untersuchung der Nierenentwicklung bzw. zur Analyse der Wilms-Tumorpathogenese war Ziel dieser Arbeit. Hierfür wurden drei Mauslinien generiert: Zwei transgene sog. Responder-Linien, die eine chimäre spleißbare Wt1-cDNA der Variante musWt1+Exon 5;+/−KTS unter der Kontrolle eines Tet-responsiven Promotors im Genom tragen. Dieses tTA/Dox-abhängig regulierbare Wt1-Transgen (tgWt1) sollte (exogen regulierbar) die Expression des endogenen Wt1-Lokus ausreichend nachahmen, um die kritischen Phasen der Embryogenese zu überwinden und lebensfähige Tiere zu erhalten. Parallel dazu wurde die Wt1-Effektor-Mauslinie (WE2) generiert. Diese trägt einen tetrazyklinabhängigen Transaktivator (tTA) zur Steuerung Tet-regulierbarer Transgene unter der Kontrolle des endogenen Wt1-Promotors. Die durch homologe Rekombination in ES-Zellen erreichte Integration des tTA direkt am Translationsstartpunkt des Wt1-Lokus hat in den Tieren einen heterozygoten Wt1 knock out/tTA knock in zur Folge. Die bisher vorgenommenen Verpaarungen doppelt transgener Wt1-tTA+/−/Resp-Mäuse ergaben keinen Rescue des letalen Wt1 k.o. und es konnten bislang keine Wilms-Tumore induziert werden. Alle im Verlauf der Arbeit generierten Mauslinien wurden umfassend charakterisiert. So konnte für die Tiere der Responder-Linien Wt1-Resp1 (mit zusätzlichen Isolator-Sequenzen zum Schutz des Transgens vor Positionseffekten) und Wt1-Resp2 (ohne Isolatoren) konnte die Tet-induzierbare Expression und die Spleißbarkeit des tgWt1 in MEF-Assays und mittels Effektor-Mäusen auf RNA-Ebene nachgewiesen werden. Die genomische Charakterisierung der WE2-Linie ergab eine ungeklärte etwa 120 kb große Inversion am Wt1-Lokus, die alle 5'-regulatorischen Sequenzen mitsamt des tTA vom Rest von Wt1 trennt. Tiere dieser Linie weisen aber dennoch einen funktionalen Wt1 k.o. auf: Unter den Nachkommen aus Intercross-Verpaarungen von Wt1-tTA+/−-Mäusen lassen sich auf Grund der Letalität keine Wt1−/−-Genotypen nachweisen. Die Charakterisierung der Effektor-Linie auf RNA-Ebene und mittels Reporter-Mäusen liefert ein Wt1-analoges tTA-Expressionsmuster: So findet man eine deutliche tTA-Expression u. a. in Niere (Glomeruli), Uterus, Ovar und Testis. Die hier vorgestellten Experimente ergeben darüber hinaus eindeutige Hinweise einer Beteiligung von Wt1 in der Entstehung der glatten Muskulatur bzw. in der Vaskulogenese.

Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen über gamma-H2AX: Immunhistochemie nach Einwirkung gentoxischer Agenzien auf Säugerzellen

Wie im Rahmen dieser Arbeit bestätigt werden konnte, eignet sich die Quantifizierung von γ-H2AX-Foci mittels Immunfluoreszenz zur Quantifizierung von DNA-Doppelstrangbrüchen, welche durch ionisierende Strahlung erzeugt werden. Dabei erzeugt ein Gy Strahlung der verwendeten 60Co-Quelle 33,8 ± 2,1 DNA-Doppelstrangbrüche. Durch UV-Strahlung sowie alkylierende Substanzen wie MMS und MNNG werden in CHO-Zellen γ-H2AX-Foci induziert. Die Anzahl der induzierten γ-H2AX-Foci ist Dosis- und replikationsabhängig. Die im Rahmen dieser Arbeit erhobenen Daten sprechen für eine Phosphorylierung von H2AX an Läsionen, welche die DNA-Replikation beeinträchtigen und insbesondere aktive Replikationsgabeln blockieren. Diese Läsionen können zu DNA-Doppelstrangbrüchen an blockierten Replikationsgabeln führen H2AX wird in der unmittelbaren Umgebung von DNA-Doppelstrangbrüchen zu γ-H2AX phosphoryliert und eignet sich damit zur Quantifizierung dieser Läsionen. Ob γ-H2AX ausschließlich an DNA-Doppelstrangbrüchen phosphoryliert wird, oder auch an anderen Läsionen ist in der Literatur umstritten. Die bis dato publizierte Literatur geht mehrheitlich davon aus, dass γ-H2AX einen ausschließlichen Marker von DNA-Doppelstrangbrüchen darstellt (Burma et al., 2001; Fernandez-Capetillo et al., 2004; Foster und Downs, 2005; Furuta et al., 2003; Halicka et al., 2005; Huang et al., 2005; Paull et al., 2000; Redon et al., 2002; Stucki und Jackson, 2006; Takahashi und Ohnishi, 2005; Ward und Chen, 2001). Neuere Arbeiten postulieren jedoch, dass H2AX auch durch andere, bisher nicht genau klassifizierte, Störungen der Chromatinstruktur phosphoryliert wird (Marti et al., 2006; Stojic et al., 2004). Die im Rahmen dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse mit UV-Strahlung und den Alkylantien MMS und MNNG lassen sich gut durch die teils direkte, größtenteils jedoch replikationsabhängige Bildung von DNA-Doppelstrangbrüchen an blockierten Replikationsgabeln erklären. Ausschließen lässt sich die Hypothese, dass die beobachteten γ-H2AX-Foci auch aufgrund anderer Läsionen entstehen, auf Grundlage der erhaltenen Daten nicht. Die Quantifizierung von γ-H2AX eignet sich zur Darstellung von durch ionisierende Strahlung, UV-Strahlung sowie Alkylantien erzeugten Effekten. Eine abschließende Klärung, ob durch die hier angewandte Methode selektiv DNA-Doppelstrangbrüche detektiert werden, steht aber weiterhin aus.

Die organotypische Gewebekultur der adulten Retina als Analysesystem für funktionell intakte Photorezeptorzellen

Photorezeptorzellen der Vertebraten sind hoch spezialisierte, visuell sensorische Neurone in der Retina, die die Lichtinformation in ein neuronales Signal umwandeln. Durch ihre Einbindung in die Retina im Gesamtorgan Auge, sind Photorezeptorzellen im Organismus für zellbiologische Analysen, wie beispielsweise unter Einsatz pharmakologischer Substanzen, nur schwer zugänglich. Demgegenüber ist bei der Nutzung von Zellkulturtechniken eine Beeinflussung oder externe Manipulation von Zellen mit geringem Aufwand möglich. Bei Etablierungsversuchen von Primärkulturen von Photorezeptorzellen zeigte sich jedoch, dass diese rasch ihre spezifische Kompartimentierung und das damit verbundene (lichtsensitive) Funktionsvermögen verlieren. Eine Alternative zur Einzelzellkultur bietet die Kultivierung der Retina als organotypisches Gewebe, in der, durch den überlebenswichtigen Kontakt der retinalen Zellen zu einander, deren Morphologie und Funktionsvermögen erhalten bleibt. In der vorliegenden Arbeit konnte durch Optimierung der Kultivierungstechnik erstmals die adulte Retina für mehrere Tage intakt kultiviert und deren Vitalität und physiologische Aktivität nachgewiesen werden. Nach dem Nachweis der Eignung der organotypischen Retinakultur, stand diese nun für zellbiologische Analysen von Photorezeptorzellen zur Verfügung. Die Langzeitadaptation von Photorezeptorzellen geht einher mit der Translokation der Proteine Arrestin und Transducin. Doch sind die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen dieser lichtabhängigen molekularen Bewegungen bislang noch nicht verstanden. Im Kontext der Diskussion um Diffusion oder aktivem Transport der genannten Translokationen, wurden in der vorliegenden Arbeit Experimente zur Abhängigkeit vom Cytoskelett durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die gegensätzlichen Translokationen von Arrestin und Transducin während der Dunkeladaptation vom Aktin-, als auch Mikrotubulicytoskelett abhängig sind. Demgegenüber sind es die während der Helladaptation stattfindenden Translokationen nicht. Diese Befunde verweisen damit auf unterschiedliche Mechanismen für die untersuchten molekularen Bewegungen während der Dunkel- und Helladaptation, und das im Falle des Arrestins auch verschieden Mechanismen zusammen oder in einer Abfolge für die Bewegung durch verschiedene Zellkompartimente notwendig sind. Darüber hinaus konnte in der vorliegenden Arbeit die Eignung der Retinakulturtechnik für Gentransfers in retinale Zellen mittels verschiedener Methoden gezeigt werden. Die organotypische Gewebekultur der adulten Retina erweist sich als ein Analysesystem mit dem zellbiologische Untersuchungen an ausdifferenzierten Photorezeptorzellen durchgeführt werden können, die im lebenden Tier, bzw. der Zellkultur nicht möglich sind. Erfolgreiche Pharmakologische Beeinflussung, sowie Gentransfer in Zellen der Retinakultur prädestinieren die Retinakultur für zellbiologische und Proteinfunktionsanalysen. Dabei kann sie ferner als Modellsystem zur Evaluation von Therapiestrategien zu Retinadystrophien dienen und das ohne, oder zumindest in einer Reduktion von Tierversuchen.

Untersuchungen zur selektiven Deletion alloreaktiver Spender-T- Lymphozyten durch CD178-modifizierte dendritische Zellen im Rahmen der allogenen Blutstammzelltransplantation

Eine der häufigsten Komplikationen bei der allogenen Blutstammzelltransplantation stellt die Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (Graft versus Host Disease, GvHD) dar. Sie wird durch allogene Spender-T-Lymphozyten verursacht, die Gewebe des Transplantatempfängers erkennen und inflammatorische Entzündungsprozesse auslösen. Neben dieser Alloreaktivität induzieren Spender-T-Lymphozyten jedoch auch immuntherapeutisch erwünschte Transplantat-gegen-Leukämie-Reaktionen (Graft versus Leukemia, GvL-Reaktion), bei denen residuelle Tumor- bzw. Leukämiezellen im Patienten durch Spender-T-Zellen spezifisch erkannt und eliminiert werden. Im Rahmen einer verbesserten Immmuntherapie wird daher versucht, GvHD-reaktive und GvL-reaktive Spender-T-Lymphozyten effizient voneinander zu separieren und so eine wirkungsvolle GvHD-Prophylaxe bzw. optimierte GvL-Induktion zu erreichen. In diesem Kontext war es Ziel dieser Arbeit, murine dendritische Zellen (DZ) so zu modifizieren, daß sie für die spezifische Deletion alloreaktiver T-Zellen in murinen GvHD/GvL-Tiermodellen eingesetzt werden können. Die Modifikation der DZ sollte dazu führen, daß über das CD95/CD178-System Aktivierungs-induzierter Zelltod (activation induced cell death, AICD) in alloreaktiven T-Zellen ausgelöst wird. Hierzu wurden für die Modifikation der DZ zwei verschiedene Mechanismen angewandt: a) die Transfektion der DZ mit CD178-mRNA sowie b) die zielgerichtete Immobilisierung von hCD178-X-Fusionsproteinen auf Oberflächenmolekülen von DZ bzw. T-Zellen. Als Positivkontrolle für die Induktion CD95-vermittelter Apoptose diente der agonistische anti-CD95-Antikörper Jo2. Bei der Transfektion muriner DZ mit mRNA zeigte sich anhand des Reportergens EGFP, daß aus dem Knochenmark generierte DZ mit hoher Effizienz mit EGFP-mRNA transfizierbar waren. Im Falle von hCD178-mRNA führte die Transfektion jedoch zu einer insuffizienten CD178-Expression, die mit den regulatorischen Eigenschaften der zytoplasmatischen CD178-Region in Verbindung gebracht werden konnte. So führte die Verwendung einer zytoplasmatisch trunkierten Form der CD178-mRNA (CD178Dzyt) zu einer durchflußzytometrisch nachweisbaren CD178-Expression in DZ. Mit diesen CD178Dzyt-exprimierenden DZ konnte in einem Proliferationstest die Proliferation alloreaktiver T-Zellen inhibiert werden. Die Beladung von DZ bzw. von T-Zellen mit hCD178-X-Fusionsproteinen führte in vitro ebenfalls zu einer deutlichen Reduktion von Alloreaktivität. Dabei konnte eine spezifische Deletion/Inhibition alloreaktiver T-Zellen nachgewiesen werden. Die Elimination alloreaktiver T-Zellen erfolgte in beiden Verfahren über AICD. Darüber hinaus wurde eine Bifunktionalität der Fusionsproteine festgestellt, da sie neben der Induktion CD95-vermittelter Apoptose auch in der Lage waren, die Kostimulation allogener T-Zellen effizient zu inhibieren. Mit Hilfe adoptiver T-Zell-Transferexperimente konnten abschließend die in vitro gewonnenen Ergebnisse in vivo in zwei verschiedenen GvHD-Mausmodellen bestätigt werden.

Untersuchung zum Einfluss der ACD-CPR mit während der Dekompressionsphase blockiertem Gasfluss (ITD) im Vergleich zur Standard-Reanimationstechnik auf die Kurzzeit-Überlebensrate von Patienten mit präklinisch aufgetretenem Herzkreislaufstillstand

Untersuchung zum Einfluss der ACD-CPR (Aktive Kompressions- Dekompressions-Reanimation) mit während der Dekompressionsphase blockiertem Gasfluss (Impedance-Threshold-Device) im Vergleich zur Standardreanimationsrechnik auf die Kurzzeit-Überlebensrate von Patienten mit präklinisch aufgetretenem Herzkreislaufstillstand. Die Studie vergleicht die ACD-ITD-CPR gegen die Standard-CPR bei Patienten mit präklinischem Herkreislaufstillstand. Primär untersuchter Parameter war die Ein-Stunden-Überlebensrate nach Krankenhausaufnahme. Sekundär wurden die Tastbarkeit eines Pulses unter CPR, die Wiederkehr des Spontankreislaufs (ROSC), die Rate an Krankenhausaufnahmen, 24-Stunden-Überleben und Krankenhausentlassungen untersucht. Außerdem wurde das neurologische Outcome evaluiert. Die Studie fand in Mainz statt; Mainz bietet sich für die Durchführung notfallmedizinischer Studien in besonderem Maße an. Der Rettungsdienst der Stadt arbeitet nach dem in Deutschland üblichen zweigliedrigen System mit RA/RS auf RTWs und NA auf NAW/NEF. Die Studie wurde nach einer fünfmonatigen Pilotphase und extensivem Training beider Verfahren durchgeführt. Zusätzlich bestanden bei einigen der Beteiligten schon Erfahrungen mit ACD-CPR. Es ergaben sich signifikante Vorteile der ACD-ITD-CPR gegenüber der Standard-CPR hinsichtlich des primär untersuchten Parameters (51% vs. 32% p=0,006), außerdem statistisch auffällige Vorteile hinsichtlich der Pulstastbarkeit unter CPR (85% vs. 69%, p=0,008), der Wiederkehr des Spontankreislaufs (55% vs. 37%, p=0,016), der Rate der Krankenhausaufnahmen (52% vs. 36%, p=0.023) und des 24-Stunden-Überlebens (37% vs. 22%, p=0,033). Es ergaben sich keine statistisch auffälligen Unterschiede hinsichtlich der Rate an Krankenhausentlassungen und im neurologischen Outcome. Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die ACD-ITD die Kurzzeitüberlebensrate der Patienten mit außerklinischem Herzkreislaufstillstand verbessern kann. Eine Voraussetzung hierfür ist eine ausreichende und andauernde Ausbildung der beteiligten Helfer und/oder die Verfügbarkeit technisch verbesserter Lösungen. Weitere Untersuchungen zum Einfluss auf die Langzeitüberlebensraten und das neurologische Outcome scheinen angezeigt.

Die Rolle Prolin-reicher Sequenzmotive des Core-Proteins in der Morphogenese des Hepatitis-B Virus

Diese Arbeit hatte zum Ziel, den Ausschleusungsmechanismus des Hepatitis-B Virus zu beleuchten. Es ist bisher unbekannt, wie das virale Nukleokapsid umhüllt und das reife Virion aus der Leberzelle freigesetzt wird. Bei einigen RNA-Viren, beispielsweise HIV-1, Ebola oder RSV, vermitteln so genannte Late-Domänen im viralen Kapsid- oder Matrix-Protein die Knospung der Viren an intrazellulären Membranen oder der Plasmamembran. Da das HBV-Core-Protein ähnliche Sequenzen trägt, wurde in der vorliegenden Arbeit überprüft, welche Rolle diese im viralen Replikationszyklus spielen. Meine Ergebnisse zeigen, dass die beiden Prolin-reichen Sequenzen PPAY (129-132) und PPNAP (134-138), die retroviralen Late-Domänen ähneln, für die HBV-Morphogenese essentiell sind. Mutationen einzelner Aminosäuren innerhalb dieser Motive führen zu Phänotypen mit verändertem Kapsid-, Nukleokapsid- und Virus-Bildungs-Vermögen. Insbesondere sind die Aminosäure Tyrosin 132 des Motivs PPAY und die Prolinreste 134 und 135 des Motivs PPNAP erforderlich, da diese schon für die Bildung der Kapside unentbehrlich sind. Charakteristisch für beide Motive sind auch die hier gezeigten Interaktionen mit speziellen Wirtszellfaktoren, deren physiologische Funktion es ist, zelluläre Proteine in den endosomalen Sortierungsprozess einzuschleusen. Im Vordergrund stehen hier die E3 Ub-Ligase Nedd4, welche Proteine mit Ub konjugiert und diese so signifikant für die Einschleusung in das endosomale System markiert, und Tsg101, das als zentrale Komponente des ESCRT-I-Komplexes für die Erkennung von ubiquitinierten Proteinen zuständig ist und diese dadurch in die ESCRT-Kaskade des multivesikulären Endosoms einführt. Für die genannten Interaktionen ist das Motiv PPAY und hier wieder speziell das Tyrosin 132 des HBV-Core-Proteins für die Wechselwirkung mit Nedd4 notwendig. Hingegen vermittelt die L-Domänen-ähnliche Sequenz PPNAP die Assoziation von Core mit Tsg101, wobei die beiden Prolinreste 134 und 135 und auch das Asparagin 136 für die Interaktion essentiell sind. Sowohl Nedd4 als auch Tsg101 wirken im Zusammenhang mit Ubiquitin, weshalb eine Ubiquitinierung von Core, trotz bislang negativer Nachweise, wahrscheinlich ist. Zugunsten dieser Annahme spricht auch mein Nachweis, dass der Lysinrest an Position 96 des Core-Proteins, als potentieller Ub-Akzeptor, gerade in späten Schritten eine essentielle Rolle spielt. Weiterhin klärungsbedürftig ist auch die Frage, ob Core direkt mit Tsg101 und Nedd4 interagiert, oder ob andere Faktoren dazwischen geschaltet sind. Auch könnte mit Hilfe von siRNA-vermittelten Depletionsversuchen die physiologische Relevanz der Tsg101/Core-und Nedd4/Core-Interaktion weiterführend untersucht werden. Zudem zeigen meine Arbeiten, dass Core mit intrazellulären Membranen assoziiert, weshalb es interessant wäre, zu untersuchen, ob es sich hierbei um Membranen des endosomalen Systems handelt, an denen die finalen Schritte der Virus-Morphogenese stattfinden könnten.

Die eNOS als ein therapeutisches Zielmolekül kardiovaskulärer Erkrankungen

Die endotheliale NO-Synthase (eNOS) erfüllt – solange sie funktionell ist – vasoprotektive und anti-atherosklerotische Funktionen im kardiovaskulären System. So stellt die eNOS ein therapeutisches Zielmolekül kardiovaskulärer Erkrankungen dar. Unter pathophysiologischen Bedingungen wurden Hinweise auf eine „eNOS-Entkopplung“, d.h. die NOS-katalysierte Produktion von reaktiven Sauerstoff-Spezies, gefunden. Wir haben in den letzten Jahren Substanzen identifiziert, die die eNOS-Expression steigern, aber auch gleichzeitig die eNOS-Entkopplung revertieren können. Midostaurin z.B. korrigierte einerseits die eNOS-Entkopplung durch Unterdrückung der Expression der vaskulären NADPH-Oxidasen und erhöhte andererseits die eNOS-Expression im Gefäß-Endothel. Kombination dieser beiden Wirkungen führte zur Relaxation der Widerstandsgefäße in atherosklerotischen Mäusen und zur Blutdrucksenkung in spontan-hypertensiven Ratten. So scheint es eine praktikable Strategie für kardiovaskuläre Erkrankungen zu sein, die eNOS-Expression zu steigern und gleichzeitig die eNOS-Entkopplung zu verhindern bzw. eine bereits bestehende eNOS-Entkopplung zu revertieren.