Développement d'un essai de complémentation protéique avec la Renilla luciférase et étude de la voie de biosynthèse des acides aminés aromatiques chez Saccharomyces cerevisiae

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Développement d'un essai de complémentation protéique avec la Renilla luciférase et étude de la voie de biosynthèse des acides aminés aromatiques chez Saccharomyces cerevisiae

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Assemblage oligomérique des récepteurs couplés aux protéines G avec les RAMPs

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) constituent la plus grande classe de récepteurs membranaires impliqués dans la transmission des signaux extracellulaires. Traditionnellement, la transmission de la signalisation par les RCPGs implique l’activation d’une protéine G hétéro-trimérique qui pourra à son tour moduler l’activité de divers effecteurs intracellulaires. Ce schéma classique de signalisation s’est complexifié au fils des années et l’on sait maintenant qu’en plus d’interagir avec les protéines G, les RCPGs s’associent avec une panoplie d’autres protéines afin de transmettre adéquatement les signaux extracellulaires. En particulier, la découverte d’une famille de protéines transmembranaires modulant la fonction des RCPGs, baptisées protéines modifiant l’activité des récepteurs (« receptor activity-modifying proteins » ; RAMPs), a changé la façon de concevoir la signalisation par certains RCPGs. Dans le cas du récepteur similaire au récepteur de la calcitonine (« calcitonin-like receptor » ; CLR), l’association avec les RAMPs permet l’acheminement à la surface cellulaire du récepteur tout en modulant ses propriétés pharmacologiques. Lorsqu’il est associé avec RAMP1, le CLR fonctionne comme un récepteur du peptide relié au gène de la calcitonine (« calcitonin gene-related peptide » ; CGRP), alors qu’il devient un récepteur de l’adrénomedulline lorsqu’il interagit avec RAMP2 ou RAMP3. D’autre part, en plus d’interagir avec des protéines accessoires transmembranaires telles les RAMPs, les RCPGs peuvent aussi s’associer entre eux pour former des oligomères de récepteurs. Dans cette thèse, nous nous sommes penchés sur les interactions entre les RCPGs et les RAMPs, et plus particulièrement sur l’interrelation entre ce type d’association RCPG/RAMP et l’assemblage en oligomères de récepteurs, en utilisant le récepteur du CGRP comme modèle d’étude. Une première étude nous a tout d’abord permis de confirmer l’interaction entre le récepteur CLR et RAMP1, dans un contexte de cellules vivantes. Nous avons démontré que ce complexe CLR/RAMP1 active la protéine G et recrute la protéine de signalisation -arrestine suite à une stimulation par le CGRP. Ensuite, nous avons déterminé que même s’il doit obligatoirement former un hétéro-oligomère avec les RAMPs pour être actif, le CLR conserve malgré tout sa capacité à interagir avec d’autres RCPGs. En plus d’observer la présence d’homo-oligomère de CLR, nous avons constaté que tout comme les RCPGs, les RAMPs peuvent eux-aussi s’associer entre eux pour former des complexes oligomériques pouvant comprendre différents sous-types (RAMP1/RAMP2 et RAMP1/RAMP3). Cette observation de la présence d’homo-oligomères de CLR et de RAMP1, nous a amené à nous questionner sur la stœchiométrie d’interaction du complexe CLR/RAMP1. Dans une deuxième étude ayant pour but d’établir la composition moléculaire du récepteur CGRP1 in vivo, nous avons développé une nouvelle approche permettant l’étude de l’interaction entre trois protéines dans un contexte de cellules vivantes. Cette technique baptisée BRET/BiFC, est basée sur le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence entre un donneur luminescent, la Renilla luciférase, et un accepteur fluorescent, la protéine fluorescente jaune (YFP), reconstituée suite au ré-assemblage de ces deux fragments. En utilisant cette approche, nous avons pu déterminer que le récepteur CGRP1 est constitué d’un homo-oligomère de CLR interagissant avec un monomère de RAMP1. En démontrant un assemblage oligomérique asymétrique pour le récepteur CGRP1 à partir d’une nouvelle approche biophysique, nous croyons que les travaux présentés dans cette thèse ont contribué à élargir nos connaissances sur le fonctionnement de la grande famille des RCPGs, et seront utile à la poursuite des recherches sur les complexes protéiques impliqués dans la signalisation.

Étude moléculaire de la formation de complexes protéiques impliqués dans la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G

La communication cellulaire est un phénomène important pour le maintien de l’homéostasie des cellules. Au court des dernières années, cette sphère de recherche sur la signalisation cellulaire a connue des avancées importantes au niveau de l’identification des acteurs principaux impliqués dans la reconnaissance extracellulaire des signaux, ainsi que la compréhension des voies de signalisation engagées par les cellules pour répondre aux facteurs extracellulaires. Malgré ces nouvelles informations, les diverses interrelations moléculaires entre les acteurs ainsi que les voies de signalisation cellulaire, demeurent mal comprises. Le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET) permet la mesure d’interactions protéiques et peut être utilisé dans deux configurations, le BRET480-YFP (connu aussi comme le BRET1) et le BRET400-GFP (connu aussi en tant que BRET2). Suite à l’oxydation de son substrat, la luciférase de renilla peut transférer son énergie à une protéine fluorescente, uniquement si elles sont à proximité l’une de l’autre (≤100Å). La combinaison dans un seul essai des BRET480-YFP et BRET400-GFP, a permis de suivre trois paires d’interactions, sur une même population cellulaire. Par contre, l’utilisation de deux substrats pour la réaction de bioluminescence rend impossible la mesure simultanée des différents signaux de BRET, pour ce trois nouvelles configurations de BRET ont été mises au point en utilisant des nouvelles protéines fluorescentes. Ainsi deux des nouvelles couleurs de BRET ayant des émissions résolues, le BRET400-BFP et le BRET400mAmetrine ont pu être combinées pour mesurer l’engagement par un RCPG d’une protéine G, ainsi que l’accumulation du second messager. La combinaison de ces BRET a également permis de révéler la formation d’un complexe entre le récepteur α2A adrénergique (α2AAR), Gαi1, le dimère Gβγ ainsi que la kinase des récepteurs couplés aux protéines G (GRK2), suite à l’activation du récepteur. De plus, seule l’entrée de GRK2 semble être en mesure de causer la désensibilisation du α2AAR, en s’intercalant entre Gαi1 et Gβγ. Par contre, la stabilisation de l’interaction entre α2AAR et la β-arrestine2 semble nécessiter l’activité kinase de GRK2. Une autre étude a révélé l’importance de différentes Gα pour la mobilisation du calcium, suite à l’activation du récepteur aux opioïdes de type delta (DOR). Suite à la surexpression de Gα de la famille Gαq, il a été possible de mesurer une influence de ces Gα sur la mobilisation du calcium. Toutefois, cette réponse calcique mesurée en présence des Gαq demeure sensible aux prétraitements à la toxine de Bordetella pertussis, qui inhibe sélectivement l’activité des Gαi. De plus, la co-expression de Gαi et Gαq permet de potentialiser la mobilisation de calcium, démontrant une interrelation entre ces deux familles de protéine Gα, pour la signalisation du DOR. Afin de démontrer l’interrelation directe, des expériences de BRET ont été réalisées entre différentes Gα. En plus de montrer la formation de complexes sélectifs entre les Gα, les expériences de BRET réalisées en parallèle d’analyses de séquences de Gα, ont également mis à jour un site de sélectivité d’interaction entre les Gα, l’hélice α4. Suite à la transposition de cette hélice α4 de Gα12 sur Gαi1, qui normalement n’interagissent pas, il a été possible de forcer l’interaction entre Gα12 et Gαi1, confirmant ainsi que cette hélice α contient l’information permettant une sélectivité d’interaction. Au cours de cette thèse, il a été possible de générer de nouvelles méthodes de mesure d’interactions protéiques qui permettent de multiplexer différents signaux, ce qui a permis de mettre à jour de nouvelles interactions entre divers effecteurs de la signalisation de RCGP

Identification et caractérisation d'un domaine de transactivation dans l’hélicase E1 des papillomavirus humains

Les papillomavirus sont des virus à ADN qui infectent la peau et les muqueuses. Ils causent des verrues et peuvent aussi mener au développement de cancers, dont le cancer du col de l’utérus. La réplication de leur génome nécessite deux protéines virales : l’hélicase E1 et le facteur de transcription E2, qui recrute E1 à l’origine de réplication virale. Pour faciliter l’étude de la réplication du génome viral, un essai quantitatif et à haut débit basé sur l’expression de la luciférase a été développé. Parallèlement, un domaine de transactivation a été identifié dans la région régulatrice N-terminale de la protéine E1. La caractérisation de ce domaine a montré que son intégrité est importante pour la réplication de l’ADN. Cette étude suggère que le domaine de transactivation de E1 est une région protéique intrinsèquement désordonnée qui permet la régulation de la réplication du génome viral par son interaction avec diverses protéines.

Régulation transcriptionnelle du gène HSPG2 codant pour Perlecan et son implication dans l’ostéoarthrite

De récents travaux ont mis en évidence une production accrue de Perlecan au stade terminal de l’arthrose ou ostéoarthrite (OA). L’équipe du Dr Moreau a mis en évidence qu’il y a une perte d’expression du facteur de transcription Pitx1 dans l’arthrose et que ce dernier pourrait agir comme un régulateur négatif du gène HSPG2 codant pour le Perlecan. Afin d’étudier la régulation transcriptionnelle de ce gène, des fragments du promoteur proximal ont été clonés en amont du gène rapporteur luciférase et testés en transfections transitoires. Des co-transfections avec des quantités variables de pSI-mPitx1 et avec des constructions comportant des fragments de différentes régions du promoteur mHSPG2 (jusqu’à 3926 pbs en amont de l’ATG) ont démontrées une activité transcriptionnelle et une stimulation de cette activité en présence de Pitx1, avec des résultats variables selon les types cellulaires. Parallèlement, des expériences en qPCR effectuées sur des ostéoblastes dérivés de souris transgéniques surexprimant Pitx1 ont aussi démontré qu’une surexpression de Pitx1 corrèle avec une augmentation de l’expression de p53, une cible connue de Pitx1, et de Perlecan. Le lien qui existe entre Pitx1 et Perlecan est encore très méconnu et la cascade régulatrice impliquant ces deux acteurs n’est pas encore établie. Une meilleure connaissance des mécanismes qui régulent la transcription normale et pathologique du gène HSPG2 permettrait sans aucun doute une avancée dans la compréhension du développement et du rôle possible de Perlecan dans la progression de l’ostéoarthrite.

GREBP, un nouveau facteur de transcription contrôlant l’expression de la guanylate cyclase A, récepteur de l’ANP, via l’élément de réponse au cGMP

La découverte du système des peptides natriurétiques (NP), au début des années 80, fut une découverte majeure qui révéla le rôle endocrinien du cœur. Les connaissances sur la relaxation vasculaire, la diurèse et la natriurèse provoquées par ce système ont évolué vers un niveau de complexité insoupçonné à cette époque. Nous savons à présent que les NP sont impliqués dans plusieurs autres mécanismes dont la prolifération cellulaire, l’apoptose, l’inhibition du système rénine-angiotensine-aldostérone (RAAS) et le métabolisme des adipocytes. Le métabolisme des lipides est maintenant devenu une cible de choix dans la lutte contre l’obésité. Cette condition aux proportions pandémiques est un facteur de risque majeur dans l’apparition de l’hypertension et du syndrome métabolique (MetS). La compréhension des mécanismes et des défauts de la voie des NP pourrait avoir un impact positif sur le contrôle du MetS et de l’hypertension. L’expression du récepteur des peptides natriuretiques de type 1 (NPR1/GCA) est contrôlée par plusieurs agents incluant son propre ligand, le peptide natriurétique de l’oreillette (ANP). La découverte d’une boucle de retro-inhibition, dans les années 90, a été un événement majeur dans le domaine des NP. En effet, suite à une stimulation à l’ANP, le NPR1/GCA peut inhiber l’activité transcriptionnelle de son propre gène par un mécanisme dépendant du cGMP. Notre groupe a identifié un élément cis-régulateur responsable de cette sensibilité au cGMP et mon projet consistait à identifier la ou les protéine(s) liant cet élément de réponse au cGMP (cGMP-RE). Nous avons identifié un clone liant le cGMP-RE en utilisant la technique du simple hybride chez la levure et une banque d’ADN complémentaire (ADNc) de rein humain. Ce clone provient d’un ADNc de 1083-bp dont le gène est localisé sur le chromosome 1 humain (1p33.36) et codant pour une protéine dont la fonction était inconnue jusqu’ici. Nous avons nommé cette nouvelle protéine GREBP en raison de sa fonction de cGMP Response Element Binding Protein. Des essais de liaison à l’ADN ont montré que cette protéine possède une affinité 18 fois plus élevée pour le cGMP-RE que le contrôle, tandis que des expériences de retard sur gel (EMSA) ont confirmé la spécificité des interactions protéine-ADN. De plus, l’immuno-précipitation de la chromatine (ChIP) a prouvé que GREBP lie le cGMP-RE dans des conditions physiologiques. La liaison de GREBP au cGMP-RE inhibe l’expression du gène rapporteur luciférase sous contrôle du promoteur de npr1/gca. L’inhibition de GREBP à l’aide d’ARN interférant active le promoteur de npr1/gca. Dans les cellules NCI-H295R, l’ANP stimule l’expression de grebp de 60% après seulement 3 heures et inhibe l’expression de npr1/gca de 30%. GREBP est une protéine nucléaire surtout exprimée dans le cœur et ayant le facteur eIF3F comme partenaire. Les variations nucléotidiques du gène sont plus fréquentes chez les patients hypertendus que chez des patients normotendus ou hypertendus souffrant de MetS. Nous rapportons ici l’existence d’un gène spécifique à l’humain qui agit comme répresseur transcriptionnel de npr1/gca et potentiellement impliqué dans le développement de l’hypertension.

Impacts fonctionnels des variants génétiques dans les promoteurs des gènes associés à la survie et à la mort cellulaire

La régulation de l’apoptose est importante dans le maintient de l’homéostasie cellulaire et l’intégrité du matériel génétique. L’apoptose est un mécanisme cellulaire qui élimine les cellules endommagées. Le bon fonctionnement de cette voie biologique est crucial pour contrer la propagation des cellules avec leurs anomalies génétiques. La dérégulation des gènes codants pour des composantes de la voie intrinsèque de l’apoptose est fréquemment observée chez divers types de cancers, incluant la leucémie. Nous proposons que des polymor¬phis¬mes fonctionnels localisés dans la région régulatrice (rSNP) des gènes impliqués dans la voie d’apoptose intrinsèque auraient un impact significatif dans l’oncogenèse en modifiant le taux d’expression de ces gènes. Dans cette étude, nous avons validé, à l’aide d’une combinaison d’approches in silico et in vitro, l’impact fonctionnel de la variabilité génétique sous la forme d’haplotypes (rHAPs), au niveau du promoteur proximal, de 11 gènes codant pour des composantes de la voie intrinsèque de l’apoptose. Pour ce faire, nous avons sous-cloné les rHAPs majeurs dans un vecteur contenant le gène rapporteur luciférase (pGL3b). Ces constructions furent utilisées dans des essais de transfections transitoires dans 3 lignées cellulaires (Hela, Jeg3 et Jurkat). Nous avons observé qu’au moins 2 rHAPs influencent significativement l’activité transcriptionelle de façon allèle spécifique. Ces rHAPs sont associés aux gènes YWHAB et YWHAQ. Les analyses de retard sur gel d’électrophorèse (EMSA) ont permis d’identifier 2 sites de liaison ADN-protéine différentielles dans les rHAPs du gène YWHAB. La variabilité du niveau d’expression des gènes étudiés pourrait contribuer à la susceptibilité interindividuelle de développer un cancer, tel que la leucémie de l’enfant.

Régulation de l’expression de HYAL-1 par le récepteur de l’oestrogène alpha

HYAL-1 (hyaluronidase-1) appartient à la famille des hyaluronidases connues pour leur rôle dans la dégradation de l’acide hyaluronique. L’expression de HYAL-1 est élevée dans de nombreux type de cancers, notamment dans le cancer de la prostate, de la vessie, des reins et du sein où il est impliqué dans la croissance tumorale et les métastases. Récemment notre laboratoire a aussi démontré une expression élevée de HYAL-1 dans le cancer épithélial de l’ovaire (CEO) de type mucineux et à cellules claires, expression qui est inversement corrélée à celle du récepteur de l’oestrogène alpha (REα). Cependant, malgré le fait que le rôle de HYAL-1 dans le cancer soit bien établit, le mécanisme de sa régulation reste encore inconnu. Le REα est un facteur de transcription qui suite à sa liaison avec son ligand va réguler l’expression de plusieurs gènes. Le REα ainsi stimulé par l’hormone va activer la transcription de ces gènes cibles mais il est connu maintenant qu’une grande partie des gènes régulés par le REα sont en réalité réprimés par ce récepteur. Dans ce travail nous proposons d’étudier le mécanisme de la régulation du gène HYAL-1 par le REα dans le CEO à cellules claires et dans le cancer du sein. L’expression ectopique du REα dans la lignée TOV21G (RE-) de même que le traitement de la lignée MCF-7 (RE+) avec de l’oestrogène a induit une diminution du niveau d’expression de l’ARN m de HYAL-1. Ces résultats nous ont permis de confirmer que HYAL-1 est un gène cible du REα. Il est aussi connu que le REα peut exercer son action par différents mécanismes d’action, entre autres en interagissant avec une séquence d’ADN appelée élément de réponse à l’oestrogène (ERE), retrouvé sur le promoteur des gènes cibles ou bien indirectement par des interactions protéine-protéine en se liant à d’autres facteur de transcription tels que Sp1. Après avoir identifiés de telles séquences sur le promoteur proximal de HYAL-1, (1 ERE proximal à -900 pb, 3 distaux à -32350 pb, 48430, -50130 pb du site d’initiation de la transcription) en plus des 2 Sp1 connus (-60 et – 1020pb), nous avons démontrés par immunoprécipitation de la chromatine que le REα est recruté sur le promoteur de HYAL-1 au niveau de l’ERE proximal -900 pb et du distal -32350 pb de même que sur le site Sp1 -1020 pb. De plus, l’activité biologique de l’ERE -900 pb et du ii Sp1-1020pb à été confirmée par des essais de gènes rapporteurs à la luciférase. Avec son rôle connu dans la tumorigenèse, l’identification de HYAL-1 comme gène cible du REα pourrait être une avenue intéressante pour le traitement des cancers hormono-indépendants.

Rôle de l'acétylation du facteur de transcription IRF3

L’immunité innée est notre premier mécanisme de défense contre l’invasion des pathogènes. Cette défense est basée sur la reconnaissance d’éléments invariables des pathogènes par des récepteurs encodés dans les lignées germinales. Dans la réponse anti-virale, le facteur de transcription Interferon Regulatory Factor 3 (IRF3) joue un rôle clé dans la réponse interféron de type I, combattant ainsi la réplication virale et conférant un état anti-viral aux cellules infectées ainsi qu’aux cellules avoisinantes. IRF3 est une protéine dont l’activation et la phosphorylation sont régulées par les kinases TBK1 et IKKi. Nous proposons ici que l’acétylation est une modification post-traductionnelle importante dans la régulation de l’activité d’IRF3. Nous avons observé par immunobuvardage qu’IRF3 est acétylé de façon basale et que cette acétylation est induite par la présence du co-facteur CBP et est inhibée par la présence de la kinase TBK1. Par spectrométrie de masse, nous avons ensuite identifié huit lysines sujettes à l’acétylation sur IRF3. Aussi, par mutagénèse dirigée, nous avons muté de façon ponctuelle chacun de ces sites et avons déterminé que la mutation de la lysine 87 inhibe la capacité d’IRF3 à s’attacher à l’ADN en EMSA et à transactiver son élément de réponse en essai luciférase. Aussi, nous proposons que l’acétylation masque la charge positive de la lysine 87 et contrôle de façon négative l’activité du facteur de transcription IRF3. Notre groupe démontre ainsi pour la première fois l’acétylation du facteur de transcription dans un modèle cellulaire et propose que ce processus joue un rôle inhibiteur dans la régulation de la protéine.

Étude de la traduction IRES-dépendante du VIH-1

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est responsable de la pandémie du SIDA (syndrome de l’immunodéficience acquise). Des souches virales résistantes aux antirétroviraux actuellement utilisés apparaissent rapidement. Il est donc important d’identifier de nouvelles cibles dans le cycle de réplication du VIH-1 pour développer de nouveaux agents contre ce virus. La traduction des protéines de structure et des enzymes du VIH-1 est une étape essentielle du cycle de réplication virale. Ces protéines sont exprimées à partir de l’ARN messager (ARNm) pleine-longueur (ARNmPL) à la fin du cycle de réplication. L’ARNmPL du VIH-1 peut utiliser un mode d’initiation de la traduction coiffe-dépendant, comme la majorité des ARNm cellulaires, mais peut aussi utiliser un mode d’initiation alternatif, car sa région 5’ non-traduite (5’UTR) contient un site interne d’entrée du ribosome (IRES), ce qui lui permet d’initier la traduction suivant un mode IRES-dépendant. L’initiation IRES-dépendante permet à l’ARNmPL d’être traduit quand l’initiation coiffe-dépendante est inhibée. L’activité de l’IRES de la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1 (IRES5’UTR) est faible dans des conditions physiologiques, mais est stimulée lorsque la cellule est arrêtée à la transition G2/M du cycle cellulaire, un arrêt qu’induit l’infection par le VIH-1. Une grande portion de l’IRES5’UTR, que nous nommons IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux et a une activité semblable à celle de l’ IRES5’UTR, ce qui indique que le mode IRES-dépendant peut être utilisé par tous les messagers du VIH-1. Lors de mes études doctorales, j’ai caractérisé le fonctionnement de l’IRES5’UTR du VIH-1. J’ai transfecté des cellules lymphocytaires Jurkat T, dérivées des cibles naturelles du VIH-1, avec un vecteur dual-luciférase contenant les séquences codantes des luciférases de la Renilla (Rluc) et de la luciole (Fluc) séparées par la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1. La traduction de la Rluc est coiffe-dépendante alors que celle de la Fluc dépend de l’IRES5’UTR. J’ai d’abord effectué une analyse mutationnelle et j’ai identifié trois régions qui stimulent l’activité de l’IRES5’UTR et une tige-boucle qui réprime l’activité de cet IRES, que j’ai nommée IRENE (IRES negative element). J’ai montré que l’effet répresseur d’IRENE est aboli lorsque les cellules sont soumises à un stress oxydatif, un type de stress induit lors d’une infection par le VIH-1. Nous proposons que IRENE maintiendrait l’IRES5’UTR dans une conformation peu active dans des conditions physiologiques. On sait que les IRES sont activés par divers facteurs cellulaires, appelés ITAF (IRES trans-acting factors). Nous proposons que l’IRES5’UTR adopterait une conformation active suite à la liaison d’un ITAF exprimé ou relocalisé lors d’un stress oxydatif. Ces travaux ont fait l’objet d’une publication (Gendron et al., 2011, Nucleic Acids Research, 39, 902-912). J’ai ensuite étudié l’effet de la protéine virale Tat sur l’activité de l’IRES5’UTR. En plus de son rôle essentiel dans la transactivation de la transcription des ARNm viraux, Tat stimule leur traduction coiffe-dépendante, en empêchant l’inhibition d’un facteur d’initiation canonique, eIF2, induite par la protéine kinase modulée par l’ARN double-brin (PKR) et en déroulant la structure TAR présente à l’extrémité 5’ de tous les ARNm du VIH-1. Elle affecte aussi l’expression de plusieurs gènes cellulaires. J’ai montré que les isoformes Tat86 et Tat72, mais non Tat101, stimulent l’activité de l’IRES5’UTR. Cet effet est indépendant de PKR et de TAR, mais dépendrait de la conformation de Tat. Nous proposons que Tat activerait un facteur de transcription cellulaire qui déclenche l’expression d’un ITAF de l’IRES5’UTR ou encore qu’elle activerait directement un tel ITAF. J’ai de plus montré que PKR stimule l’activité de l’IRES5’UTR, ce qui est surprenant puisque PKR est une protéine antivirale. Cet effet est indépendant de l’inhibition d’eIF2 par PKR et pourrait résulter de l’activation d’un ITAF. Sachant qu’une portion active de l’IRES5’UTR, IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux, notre hypothèse est que la stimulation de cet IRES par PKR permettait de traduire l’ARNm de Tat au début du cycle de réplication, ce qui permettrait ensuite la traduction coiffe-dépendante des ARNm du VIH-1, qui est stimulée par Tat. Ces travaux font l’objet d’un manuscrit (Gendron et al., soumis à RNA). Mes résultats, couplés aux données de la littérature, me conduisent à la conclusion que, à la fin du cycle de réplication du VIH-1, l’activité de l’IRES5’UTR est stimulée par le stress oxydatif, l’arrêt en G2/M et la présence de quantités élevées de Tat, alors que la traduction coiffe-dépendante est compromise. L’initiation IRES-dépendante serait alors indispensable pour que le VIH-1 traduise l’ARNmPL. L’IRES5’UTR constituerait donc une cible très intéressante pour développer des agents anti-VIH.

Identification et caractérisation d’une souris mutante Skam26Jus comme un nouveau modèle des anomalies du tube neural

Les anomalies du tube neural (ATN) sont des malformations congénitales très fréquentes chez l’humain en touchant 1-2 nouveau-nés sur 1000 naissances. Elles résultent d’une fermeture incomplète du tube neural lors de l’embryogenèse. L’étiologie des ATN est complexe impliquant des facteurs environnementaux et des facteurs génétiques. La souris représente un outil puissant afin de mieux comprendre la génétique des ATN. Particulièrement, la souris modèle a impliqué fortement la voie de la polarité cellulaire planaire (PCP) dans ces malformations. Dans cette étude, nous avons identifié et caractérisé une nouvelle souris mutante, Skam26Jus dans le but d’identifier un nouveau gène causant les ATN. Skam26Jus a été générée par l’agent mutagène N-Ethyl-N-Nitrosuera. Cette souris est caractérisée par une queue en forme de boucle ou de crochet, soit un phénotype associé aux ATN. La complémentation génétique de la souris Skam26Jus avec une souris mutante d’un gène de la voie PCP Vangl2 (Looptail) a montré une interaction génétique entre le gène muté chez Skam26Jus et Vangl2, suggérant que ces deux gènes fonctionnent dans des voies de signalisation semblables ou parallèles. Un total de 50% des embryons doubles hétérozygotes avec un phénotype de la queue présentent un spina bifida. La cartographie par homozygotie du génome entier suivie par un clonage positionnel a permis d’identifier Lrp6 comme le gène muté chez Skam26Jus. Une mutation homozygote, p.Ile681Arg, a été identifiée dans Lrp6 chez les souris ayant une queue en boucle/crochet. Cette mutation était absente dans 30 souches génétiques pures indiquant que cette mutation est spécifique au phénotype observé. Une étude de phénotype-génotype évalue la pénétrance à 53 % de la mutation Ile681Arg. Lrp6 est connu pour activer la voie canonique Wnt/β-caténine et inhiber la voie non canonique Wnt/PCP. Le séquençage de la région codante et de la jonction exon-intron de LRP6 chez 268 patients a mené à l’identification de quatre nouvelles rares mutations faux sens absentes chez 272 contrôles et de toutes les bases de données publiques. Ces mutations sont p.Tyr306His ; p.Tyr373Cys ; p.Val1386Ile; p.Tyr1541Cys et leur pathogénicité prédite in silico indiquent que p.Val1386Ile est bénigne, et que p.Tyr306Hiset p.Tyr373Cys et p.Tyr1541Cys sont i possiblement dommageables. Les mutations p.Tyr306His, p.Tyr373Cys et p.Tyr1541Cys ont affecté l’habilité de LRP6 d’activer la voie Wnt/β-caténine en utilisant le système rapporteur luciférase de pTOPflash. Nos résultats suggèrent que LRP6 joue un rôle dans le développement des ATN chez une petite fraction de patients ayant une ATN. Cette étude présente aussi Skam26Jus comme un nouveau modèle pour étudier les ATN chez l’humain et fournit un outil important pour comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine des A TN.

Étude de la dynamique des interactions des constituants du complexe de biosynthèse et d’insertion de la sélénocystéine dans la traduction des sélénoprotéines in vivo

Les sélénoprotéines sont des protéines auxquelles des sélénocystéines, soit le 21e acide aminé, sont incorporées durant leur traduction. Plus précisément, la sélénocystéine (Sec) est un dérivé métabolique de la sérine, mais structurellement équivalent à une cystéine dont on a remplacé l'atome de soufre par du sélénium. Elle se distingue des autres acides aminés puisqu’elle possède sa propre synthétase qui sert à convertir la sérine en Sec alors que le résidu est déjà fixé à l’ARNt. La position d’une Sec sur l’ARNm est indiquée par le codon UGA étant habituellement un signal STOP introduisant le concept de recoding. Grâce à une machinerie métabolique spécifique à l'ARNtSec et à la présence d’un SecIS (Selenocystein Insertion Sequence) sur l’ARNm, ce codon permet la présence d'une Sec dans la protéine. Il est connu que la synthèse débute avec l’acétylation de l’ARNt[Ser]Sec par la seryl-ARNt synthétase (SerRS) afin de donner la seryl-ARNt[Ser]Sec. Cette dernière est subséquemment phosphorylée par l’O-phosphoséryl-ARNt[Ser]Sec kinase (PSTK) qui donnera l’O-phosphoséryl-ARNt[Ser]Sec. Par la suite, un complexe de plusieurs protéines et cofacteurs, agissant comme machinerie pour l’incorporation des Sec durant la traduction, s’associe avec l’ARNt[Ser]Sec puis l’ARNm et, finalement, les composantes du ribosome. Parmi ces protéines, SepSecS catalyse l’étape finale de la synthèse des Sec en convertissant le O-phosphoseryl-ARNt[Ser]Sec en selenocysteinyl-ARNt[Ser]Sec utilisant le sélénophosphate comme source de sélénium. Des études récentes montrent que l’association avec SECp43 serait nécessaire pour que SepSecS joue son rôle et soit ségrégée au noyau pour s’associer à la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines, soit le complexe moléculaire qui reconnaît le codon UGA. Parmi les protéines de la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines que nous avons analysées, il y a eEFSec, RPL30, SPS2, SPS1, SBP2 et NSEP1. Nos résultats d’analyse de la dynamique de l’interaction entre les constituants de la machinerie de biosynthèse et d’incorporation des Sec, confirment plusieurs données de la littérature, mais remettent en question le modèle jusqu’à maintenant établi. Une meilleure compréhension de la dynamique des interactions entre ses constituants et la régulation de cette dynamique permet d’émettre des hypothèses quant au rôle de la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines et de l’importance de sa complexité. Nous avons analysé les interactions in vivo dans des cellules HEK293T au moyen de la technique de Protein-Fragment Complementation Assay (PCA) en couplant, par un clonage moléculaire, les gènes de chacune des protéines d’intérêt avec des fragments des gènes de la protéine luciférase (hRluc). Nous avons ainsi réalisé une fusion en N-terminal et en C-terminal des fragments de luciférase pour chacune des protéines d’intérêt. Puis, nous avons analysé la dynamique des interactions avec les composantes de la machinerie de biosynthèse des Sec. D’autres travaux seront essentiels afin de bâtir sur les résultats présentés dans cette recherche.

La régulation du gène CYP19A1 dans les cellules de granulosa bovine in vitro

L’oestradiol joue un rôle important dans la reproduction en général, particulièrement dans la croissance folliculaire chez la vache. La production de l’œstradiol nécessite l’expression du gène CYP19A1 suite à la stimulation des cellules de granulosa par l’hormone folliculostimulante (FSH) ou le facteur de croissance insulinique de type 1 (IGF-1). Chez la vache, il existe six promoteurs (1.1 ; 1.2 ; 1.3 ; 1.4 ; 1.5 et 2) qui dirigent la transcription du gène CYP19A1 dans les cellules de la granulosa. Le principal promoteur qui dirige la transcription au niveau de l’ovaire (cellules de granulosa) est le promoteur 2 (P2). Cependant, l’effet de la FSH et de l’IGF-1 sur l’activation de ces promoteurs d’aromatase demeure mal connu. De plus, la demi-vie du transcrit CYP19A1 est très courte avec une région 3’UTR relativement longue. L’analyse de la séquence 3’UTR montre la présence des motifs ARE (séquence riche en AU), des études antérieur montrent que ces séquences impliquent dans la régulation de la stabilité ou la dégradation de l’ARNm, ce qui est fort probable que la courte demi-vie de l’ARNm CYP19A1 est sous le contrôle post-transcriptionel. L’objectif de la thèse visait à étudier la régulation de l’expression du gène CYP19A1 chez la vache. Il y a deux thèmes soit étude de la régulation transcriptionnelle ciblant le promoteur et soit étude de la régulation post-transcriptionnelle impliquant la région 3’non traduite (3’UTR). Le premier objectif vise à étudier la régulation transcriptionnelle du gène CYP19A1. Nous avons étudié l'activité du promoteur ovarien bovin dans deux modèles de cellules de la granulosa, les cellules lutéinisées et nonlutéinisées in vitro, suite à une stimulation des cellules par la FSH ou IGF-1. Nous avons également évalué la voie de signalisation impliquée dans la régulation des différents promoteurs en utilisant un RT-PCR et un gène rapporteur (les différents promoteurs d’aromatase ont été insérés dans le vecteur pGL3promoter en amont du gène exprimant la luciférase). Les résultats de RT-PCR démontrent que la FSH et l’IGF-1 augmentent les concentrations d’ARNm provenant des deux promoteurs 2 et 1.1 dans les cellules de la granulosa non lutéinisées. Des expériences subséquentes ont montré que la FSH stimule le promoteur 2 via la voie PKA tandis que l'IGF-1 stimule le promoteur 2 via la voie PKC. La FSH et l’IGF-1 stimulent l’expression du promoteur 1.1 via la voie PI3K. L’analyse de l’activité luciférase démontre que dans les cellules de granulosa lutéinisées, la FSH stimule le promoteur 1.1 de façon dose dépendante et ne semble y avoir aucun effet significatif sur le promoteur 2. Nous avons donc comparé l’activité du promoteur PII/P2 humain, du rat, de la chèvre et de la vache dans les cellules de granulosa bovine lutéinisées. Le résultat le plus significatif est que le promoteur 2 bovine (et caprine) dépend de plusieurs facteurs de transcription (NR5A2, FOXL2) comparé au promoteur PII humain et celui du promoteur proximal du rat qui dépendent principalement de l'AMPc. En effet, nos résultats ont démontré une expression raisonnablement robuste du P2 bovine lorsque les cellules sont traitées à la forskoline, NR5A2 et FOXL2. Le facteur FOXL2 semble déterminer l'activité du promoteur 2 chez le ruminant. Le deuxième objectif vise à étudier la régulation post-transcriptionnelle du gène CYP19A1. Pour ce faire, nous avons déterminé la séquence minimale de l'ARNm CYP19A1 requise pour la régulation de sa demi-vie. Différents séquences de la région 3’UTR ont été insérés dans le vecteur pGL3promoter en aval du gène exprimant la luciférase ou soit dans le vecteur pGEMTeasy. Le vecteur pGL3promoter a été transfecté dans les cellules de granulosa lutéinisées pour évaluer l'impact de la séquence 3'UTR sur l'expression du gène rapporteur de la luciférase, alors que le vecteur pGEMTeasy a été utilisé pour la transcription in vitro afin de générer de l’ARNm. Ce dernier sera utilisé en réaction croisée au UV avec des extraits protéiques pour démontrer l’association du complexe ARNm/protéine. L’analyse de l’activité luciférase a permis d’identifier une séquence de 200 pb située entre 926 et 1134 pb de la région 3'UTR de l’ARNm CYP19A1 qui a réduit significativement l’activité de la luciférase. Selon les analyses de la réaction croisée au UV, une ou plusieurs protéines de 66 et 80 kDA se lient spécifiquement à la séquence de 200 pb qui réduit l’activité de luciférase. Cette protéine s'exprime dans les cellules de granulosa, mais n’a pas été détectée dans d'autres tissus comme le foie et le cœur. Par ailleurs, l’utilisation du gène rapporteur sensible à la FSH a suscité l’intérêt d'une compagnie pharmaceutique qui vend de l’equine chorionic gonadotropin (eCG) pour lui permettre de distinguer facilement l’eCG ayant une forte activité FSH et donc, avoir un produit commercial plus efficace et de meilleure qualité. Dans cette étude, nous avons développé un système de bioessai à la FSH basé sur la transfection des cellules avec un récepteur à la FSH et un gène rapporteur colorimètrique qui permet d’estimer l’activité de la FSH dans le sérum de la jument et qui pourrait être applicable au niveau de la ferme/industrie.