Régulation de l’expression du gène Six6 par les facteurs de transcription Lhx2 et Pax6 dans le contexte des cellules souches rétiniennes

La rétinogésèse des vertébrés est la culmination de processus biologiques complexes parfaitement exécutés. Cette délicate orchestration est principalement contrôlée par les facteurs de transcription qui permettent aux progéniteurs rétiniens de proliférer, de s’auto-renouveler et de se différencier de façon appropriée. Les facteurs de transcription à homéodomaine sont les protéines qui sont responsables de la démarcation du site du primordium optique et participeront même à la différenciation tardive des différents types cellulaires de la rétine. Le contrôle génétique concernant l‘activation de l’expression de facteurs de transcription est peu connu. Nous avons étudié les séquences génomique avoisinant le gène Six6 afin d’identifier et mieux comprendre son promoteur. Des expériences d’immunoprécipitation de chromatine et des essais luciférases ont confirmé la liaison et la transactivation synergique du promoteur potentiel de Six6 par Lhx2 et Pax6 in vitro. Cette présente étude confirme et précise également le rôle de Lhx2 au niveau du développement précoce de l’oeil. La compréhension détaillée des réseaux génétiques régulant les progéniteurs rétiniens à former une rétine fonctionnelle est essentielle. En effet, lorsque ces connaissances seront acquises, nous serons en mesure d’appliquer les thérapies cellulaires pour rétablir les fonctions rétiniennes lors de pathologies dégénératives.

Caractérisation moléculaire du rôle de Lhx2 dans le développement de l'oeil et du cerveau

Le développement du système nerveux central (SNC) chez les vertébrés est un processus d'une extrême complexité qui nécessite une orchestration moléculaire très précise. Certains gènes exprimés très tôt lors du développement embryonnaire sont d'une importance capitale pour la formation du SNC. Parmi ces gènes, on retrouve le facteur de transcription à Lim homéodomaine Lhx2. Les embryons de souris mutants pour Lhx2 (Lhx2-/-) souffre d'une hypoplasie du cortex cérébral, sont anophtalmiques et ont un foie de volume réduit. Ces embryons mutants meurent in utero au jour embryonnaire 16 (e16) dû à une déficience en érythrocytes matures. L'objectif principal de cette thèse est de caractériser le rôle moléculaire de Lhx2 dans le développement des yeux et du cortex cérébral. Lhx2 fait partie des facteurs de transcription à homéodomaine exprimé dans la portion antérieure de la plaque neurale avec Rx, Pax6, Six3. Le développement de l'oeil débute par une évagination bilatérale de cette région. Nous démontrons que l'expression de Lhx2 est cruciale pour les premières étapes de la formation de l'oeil. En effet, en absence de Lhx2, l'expression de Rx, Six3 et Pax6 est retardée dans la plaque neurale antérieure. Au stade de la formation de la vésicule optique, l'absence de Lhx2 empêche l'activation de Six6 (un facteur de transcription également essentiel au développement de l'œil). Nous démontrons que Lhx2 et Pax6 coopèrent en s'associant au promoteur de Six6 afin de promouvoir sa trans-activation. Donc, Lhx2 est un gène essentiel pour la détermination de l'identité rétinienne au niveau de la plaque neurale. Plus tard, il collabore avec Pax6 pour établir l'identité rétinienne définitive et promouvoir la prolifération cellulaire. De plus, Lhx2 est fortement exprimé dans le télencéphale, région qui donnera naissance au cortex cérébral. L'absence de Lhx2 entraîne une diminution de la prolifération des cellules progénitrices neurales dans cette région à e12.5. Nous démontrons qu'en absence de Lhx2, les cellules progénitrices neurales (cellules de glie radiale) se différencient prématurément en cellules progénitrices intermédiaires et en neurones post-mitotiques. Ces phénotypes sont corrélés à une baisse d'activité de la voie Notch. En absence de Lhx2, DNER (un ligand atypique de la voie Notch) est fortement surexprimé dans le télencéphale. De plus, Lhx2 et des co-répresseurs s'associent à la chromatine de la région promotrice de DNER. Nous concluons que Lhx2 permet l'activation de la voie Notch dans le cortex cérébral en développement en inhibant la transcription de DNER, qui est un inhibiteur de la voie Notch dans ce contexte particulier. Lhx2 permet ainsi la maintenance et la prolifération des cellules progénitrices neurales.

非洲爪蟾Brunol1 基因的功能以及文昌鱼肌动蛋白基因家族扩增的研究

BRUNOL 蛋白又称CELF（CUG-BP and ETR3 like factor）是一种典型的RNA 结合蛋白，它的N 端含有两个连续的RNA 识别结构域（RNA recognition motif，RRM)， C 端有一个RRM 结构域。主要参与对可变剪切、翻译、降解和编辑等基因表达转录后水平的调节。迄今在人类中已发现6 个Brunol 基因家族成员，即Brunol1-6；在非洲爪蟾中已发现了5 个：Brunol1-5。近期，我们克隆了爪蟾的Brunol1-5 并研究了它们在非洲爪蟾早期胚胎发育过程中的时空表达图式。结果显示，与以往研究结果一致， Brunol1 基因高量、特异地在神经管中表达，提示Brunol1 基因可能对于爪蟾的神经系统的发生和发育发挥着重要的作用。本实验利用Morpholino 和过表达等手段研究了爪蟾Brunol1 基因对于爪蟾早期胚胎发育的影响。结果显示，在下调和过表达Brunol 1 基因的情况下都会导致胚胎出现体轴弯曲，眼睛和头部发育不全等表型。而将 Brunol1 基因特异的Morpholino 与它的mRNA 共注射时可以明显挽救这一表型。我们通过原位杂交实验，检测了一些爪蟾神经系统的标记基因在Brunol1 过表达胚胎中的表达情况，结果发现过表达Brunol1 基因能显著地下调Krox-20, N-tubulin, Lhx2, Pax6 等的表达，而Sox2 和Otx2 的表达却未受影响。这说明Brunol1 的异常表达确实影响到了神经系统发育过程的信号调控网络，导致胚胎发育的畸形。该结果将有助于阐述Brunol1 基因对于脊椎动物神经系统发生的意义。肌动蛋白是一种分布广泛而且在进化上十分保守的蛋白，它是构成细胞骨架的关键组分。通常人们将肌动蛋白分成肌肉型和胞质型两种类型，它们各自行使着不同的功能。在此，我们通过对古老的脊索动物文昌鱼的肌动蛋白基因家族进行系统的分析发现，文昌鱼中该基因家族成员多达30 多个，而且它们中很多都有连锁现象；进化分析的结果显示，文昌鱼的肌动蛋白基因家族通过串联重复序列的复制发生扩增；从结构上看，它们的基因结构多样化, 包含2-7 个外显子；同时，我们还克隆了两个不同的文昌鱼肌肉型的肌动蛋白基因，并进一步比较了它们在文昌鱼早期胚胎中的表达图式。结果显示，这两个基因在表达上有着细微的差别，这提示文昌鱼肌动蛋白基因家族成员在功能上的分化。该结论将有助于阐述肌动蛋白基因家族的进化以及它们在脊索动物发育的中所扮演的功能。

Vestibular deficits do not underlie looping behavior in achiasmatic fish

Zebrafish belladonna (bel) mutants carry a mutation in the lhx2 gene that encodes a Lim domain homeobox transcription factor, leading to a defect in the retinotectal axon pathfinding. As a result, a large fraction of homozygous bel mutants is achiasmatic. Achiasmatic bel mutants display ocular motor instabilities, both reserved optokinetic response (OKR) and spontaneous eye oscillations, and an unstable swimming behavior, described as looping. All these unstable behaviors have been linked to the underlying optic nerve projection defect. Looping has been investigated under different visual stimuli and shown to be vision dependent and contrast sensitive. In addition, looping correlates perfectly with reversed OKR and the spontaneous oscillations of the eyes. Hence, it has been hypothesized that looping is a compensatory response to the perception of self-motion induced by the spontaneous eye oscillations. However, both ocular and postural instabilities could also be caused by a yet unidentified vestibular deficit. Here, we performed a preliminary test of the vestibular function in achiasmatic bel larval mutants in order to clarify the potential role of a vestibular deficit in looping. We found that the vestibular ocular reflex (VOR) is normally directed in both bel mutants and wild types and therefore exclude the possibility that nystagmus and looping in reverse to the rotating optokinetic drum can be attributed to an underlying vestibular deficit.

Conservation of the expression and function of apterous orthologs in Drosophila and mammals

The Drosophila apterous (ap) gene encodes a protein of the LIM-homeodomain family. Many transcription factors of this class have been conserved during evolution; however, the functional significance of their structural conservation is generally not known. ap is best known for its fundamental role as a dorsal selector gene required for patterning and growth of the wing, but it also has other important functions required for neuronal fasciculation, fertility, and normal viability. We isolated mouse (mLhx2) and human (hLhx2) ap orthologs, and we used transgenic animals and rescue assays to investigate the conservation of the Ap protein during evolution. We found that the human protein LHX2 is able to regulate correctly ap target genes in the fly, causes the same phenotypes as Ap when ectopically produced, and most importantly rescues ap mutant phenotypes as efficiently as the fly protein. In addition, we found striking similarities in the expression patterns of the Drosophila and murine genes. Both mLhx2 and ap are expressed in the respective nerve cords, eyes, olfactory organs, brain, and limbs. These results demonstrate the conservation of Ap protein function across phyla and argue that aspects of its expression pattern have also been conserved from a common ancestor of insects and vertebrates.