Isoelectric Point Determination for Glossoscolex paulistus Extracellular Hemoglobin: Oligomeric Stability in Acidic pH and Relevance to Protein-Surfactant Interactions

The extracellular hemoglobin from Glossoscolex paulistus (HbGp) has a molecular mass of 3.6 M Da, It has a high oligomeric stability at pH 7.0 and low autoxidation rates, as compared to vertebrate hemoglobins. In this work, fluorescence and light scattering experiments were performed with the three oxidation forms of HbGp exposed to acidic pH. Our focus is on the HbGp stability at acidic pH and also on the determination of the isoelectric point (pI) of the protein. Our results show that the protein in the cyanomet form is more stable than in the other two forms, in the whole range. Our zeta-potential data are consistent with light scattering results. Average values apt obtained by different techniques were 5.6 +/- 0.5, 5.4 +/- 0.2 and 5.2 +/- 0.5 for the oxy, met, and cyanomet forms. Dynamic light scattering (DLS) experiments have shown that, at pH 6.0, the aggregation (oligomeric) state of oxy-, met- and cyanomet-HbGp remains the same as that at 7.0. The interaction between the oxy-HbGp and ionic surfactants at pH 5.0 and 6.0 was also monitored in the present study. At pH 5,0, below the protein pI, the effects of sodium dodecyl sulfate (SDS) and cetyltrimethylammonium chloride (CTAC) are inverted when compared to pH 7.0. For CTAC, in acid pH 5.0, no precipitation is observed, while for SDS an intense light scattering appears due to a precipitation process. HbGp interacts strongly with the cationic surfactant at pH 7.0 and with the anionic one at pH 5.0. This effect is due to the predominance, in the protein surface, of residues presenting opposite charges to the surfactant headgroups. This information can be relevant for the development of extracellular hemoglobin-based artificial blood substitutes.

Amplificação gênica alelo-específica na caracterização das hemoglobinas S, C e D e as interações entre elas e talassemias beta

INTRODUÇÃO: As hemoglobinopatias resultam de alterações hereditárias, sendo prevalentes em muitas regiões do mundo, mas atingem a população brasileira de forma significativa. Elas são decorrentes de alterações em genes estruturais responsáveis pelo aparecimento das hemoglobinas variantes e/ou em genes reguladores, resultando nas talassemias. A identificação dessas patologias tem sido rotineiramente realizada por procedimentos eletroforéticos, contudo nossa experiência laboratorial evidencia que as mesmas nem sempre apresentam resoluções suficientes para a correta caracterização da mutação. CASUÍSTICAS E MÉTODOS: O propósito deste trabalho foi estabelecer uma metodologia válida para a caracterização das hemoglobinas S, C e D em homozigose ou heterozigose, e suas possíveis interações, baseada na amplificação gênica alelo-específica (PCR-AE) com a utilização de primers sense, antisense e primers que se acoplam na posição do alelo mutante e na respectiva posição do alelo normal. RESULTADOS E DISCUSSÃO: Os resultados evidenciaram a validade dessa metodologia na caracterização das mutações, sendo esse procedimento de fácil realização, reprodutível e possível de ser aplicado em um significativo número de amostras.

Investigação de hemoglobinopatias em sangue de cordão umbilical de recém-nascidos do Hospital de Base de São José do Rio Preto

As hemoglobinopatias são as doenças genéticas mais freqüentes na população humana. Cerca de 12 a 15% da população é portadora de uma ou mais formas de hemoglobinas anormais, resultando em um grande problema de saúde pública. O diagnóstico neonatal possibilita o tratamento e o aconselhamento genético precoce, incluindo a conscientização dos portadores sobre o risco do nascimento de homozigotos. O objetivo deste trabalho é apresentar os resultados da investigação de hemoglobinopatias em recém-nascidos do Hospital de Base de São José do Rio Preto. O estudo foi realizado em 913 amostras de sangue de cordão umbilical, que foram submetidas a testes eletroforéticos, bioquímicos e citológicos, específicos para análise de hemoglobinas. Foram identificadas 100 (10,95%) amostras com hemoglobinas anormais, das quais 40 (4,38%) com Hb Bart's, sugerindo alfa talassemia, 34 (3,72%) com Hb S, 23 (2,52%) com beta talassemia, duas (0,22%) com Hb C e uma (0,11%) amostra apresentou Hb rápida. A frequência elevada de alterações encontradas evidencia a necessidade da triagem neonatal de hemoglobinopatias que pode resultar em amplos benefícios para os portadores destas patologias e seus familiares.

Interação entre Hb C [beta6(A3)Glu>Lys] e IVS II-654 (C>T) beta-talassemia no Brasil

Thalassemias are a heterogeneous group of inherited disorders characterized by a microcytic hypochromic anemia and an imbalance in the synthesis of the globin-chains. Hb C is the second most frequently variant of hemoglobin found in Brazil. The laboratory diagnosis of hemoglobinopathies, including thalassemias, is growing in importance, particularly because of an increasing requirement for neonatal diagnosis of abnormal hemoglobins. Screening tests were carried out using alkaline and acid electrophoresis, globin-chain analysis by cellulose acetate in alkaline pH, isoelectric focusing and HPLC. The molecular characterization was made by PCR-ASO for Hb C and beta thalassemia mutants. Large-scale screening and discriminative methodologies must provide information about the hemoglobin polymorphisms in Brazilian population. HPLC is a powerful tool in these cases. Molecular characterization is important to genetic counseling and clinical management, in particular for the Brazilian population that have an intense racial admixture, with great variability of hemoglobins. In this paper an association between Hb C and beta thalassemia (IVS-II-654) in a black family from Brazil was described.

Dificuldades no diagnóstico laboratorial das hemoglobinopatias

Há vários tipos de hemoglobinopatias que são caracterizados por variantes das hemoglobinas anormais (ex: Hb S, Hb C, Hb Instáveis,etc) e por talassemias (ex: tal. alfa, tal. beta, tal.beta/delta,etc) As hemoglobinopatias são consideradas como uma das doenças genéticas mais comuns em todo o mundo, com prevalência de portadores heterozigotos de seus principais tipos em aproximadamente 5% da população mundial. Devido à heterogenidade clínica e genética dessas alterações genéticas é fundamental estabelecer a investigação laboratorial das diferentes formas de hemoglobinas variantes e de talassemias. Este artigo apresenta as principais dificuldades laboratoriais que envolvem a complexidade molecular das hemoglobinopatias.

Diagnóstico de hemoglobinopatias em recém-nascidos do Hospital de Base de São José do Rio Preto-SP

The neonatal period is considered the most effective for the screening of hemoglobinopathies. This allows prophylaxis and prevention, improving the patient's survival and guidance of parents and heterozygote carriers. The present work aims at the early detection of abnormal hemoglobins, the establishment of standard analysis and to examine the viability of the prevention program. Blood samples were collected by heel stick and from blood cord of children born in the Hospital de Base São José do Rio Preto, from April 1998 to November 1999. Electrophoresis and cytological, biochemical, cromatographic analyses were made for abnormal hemoglobin characterization. A total of 1,478 neonatal blood samples were analyzed in which 14.62% presented with hemoglobins alterations: 3.32% had Hb S; 0.61% had Hb C; 7.44% were suggestive of alpha thalassemia; 1.55% were suggestive of beta thalassemia, and 1.70% had alpha/beta thalassemia interactions. The samples collected from the blood cord showed better results in all analyses while the blood samples collected by heel stick on filter paper, were applicable to only specific methodologies. The routine laboratory methods allowed identification of the thalassemic and variant forms, and isoelectric focusing presented sensitivity only for variant identification in this age range. The suspected cases were reassessed after six months, which permitted genetic counseling of their family members and clinic attendance. A multidisciplinary approach in programs of this kind is fundamental for its success.

HB D Los Angeles in a Brazilian family

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Avaliação de Hb A2 e Hb F em doadores de sangue de região malarígena da Amazônia Oriental brasileira por HPLC

In malaria endemic regions of Africa, resistance to infection by Plasmodium has been observed in under 6-month-old children, when there are higher fetal hemoglobin (Hb F) levels. Research performed in the São José do Rio Preto region, central-east Brazil, reported increased levels of Hb F in blood donors. The purpose of this work was to evaluate the A2 hemoglobin (Hb A2) and Hb F concentrations in blood donors deriving from the Brazilian malaria endemic region. Forty-five blood donor samples from Macapá, from patients with varying genders, ages and ethnic origins, were collected by venous puncture after informed consent was obtained. The samples were analyzed by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) - System Variant (Bio-Rad). The HPLC demonstrated sensitivity and rapidity in the identification and measurement of the hemoglobins and gave precise results. Moreover, it provided measurement of hemoglobin variants, even when they were present in small amounts, providing a diagnosis of hemoglobinopathies. Hb F levels above the normal were observed in 33.3% of the analyzed samples. The presence of increased Hb F can suggest resistance to infection by Plasmodium falciparum, as there have been reports that infected red blood cells interfere in the development of the parasite.

Hemoglobina Köln diagnosticada em programa de triagem neonatal em São José do Rio Preto, SP

Alterações genéticas em que a mutação de aminoácidos nas globinas afeta a estrutura da molécula tornando-a instável são classificadas como hemoglobinas instáveis. Devido à grande diversidade dos pontos de mutações por substituições e deleções de aminoácidos, as formas de instabilização se apresentam muito variadas. A hemoglobina Köln é a variante instável descrita com maior freqüência na literatura e a terceira descoberta no Brasil, as outras são Hb Niterói e Hb Hasharon. Anemia moderada, icterícia e presença de urina escura caracterizam as manifestações clínicas da Hb Köln. em programa de triagem neonatal identificamos uma criança com suspeita de heterozigose para hemoglobina Köln, confirmada por procedimentos eletroforéticos e HPLC. Avaliações por diferentes metodologias laboratoriais e estudo familiar auxiliam no diagnóstico precoce, possibilitando minimizar os sintomas decorrentes da hemoglobina anormal e a realização do aconselhamento genético e educacional destas alterações hereditárias.

Análise quantitativa e molecular de hemoglobina fetal em indivíduos da população brasileira

A hemoglobina fetal - Hb F, formada por duas cadeias gama e duas cadeias alfa, é característica do período fetal do desenvolvimento, tendo sua síntese diminuída no período pós-natal. em algumas alterações hereditárias, a Hb F permanece aumentada, como nas delta-beta talassemia, beta talassemia e persistência hereditária de Hb F (PHHF). A síntese da globina gama também pode ser estimulada por fatores externos como leucemias, transplantes de medula óssea, induções químicas, dentre outros. Através da observação de Hb F aumentada em doadores de sangue por procedimentos eletroforéticos objetivou-se avaliar a quantidade de Hb F em amostras de sangue de candidatos à doação, visando estabelecer seus limites de normalidade na população de São José do Rio Preto e região, por meio de desnaturação alcalina e cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), comparar as metodologias aplicadas e, nos indivíduos com Hb F aumentada, realizar estudos moleculares para identificar as mutações que alteram a expressão dos genes gama. Foram analisadas 208 amostras de sangue, sendo 119 de candidatos à doação e 89 de indivíduos sem sintomas de anemia ou achados hematológicos e com Hb F aumentada como grupo comparativo. Das 119 amostras de candidatos à doação, 110 foram utilizadas para traçar o perfil de normalidade de Hb F, comparando-se as metodologias de desnaturação alcalina e HPLC, onde se obteve a média de 1,48% e de 0,6%, respectivamente. A análise estatística por regressão linear mostrou diferença significativa na comparação entre as duas metodologias aplicadas, sendo a HPLC mais precisa para a quantificação de Hb F. Foram observados nos testes de rastreamento de hemoglobinas anormais nestas 110 amostras de sangue: 16,4% de alfa talassemia, 0,9% com Hb F aumentada, 0,9% com beta talassemia e 0,9% com hemoglobina variante de cadeia delta. Os outros nove doadores de sangue apresentaram Hb F acima de 10% em eletroforese e observou-se média de 32,28% para desnaturação alcalina e de 26,4% para HPLC. As análises moleculares por PCR-ASO foram realizadas na tentativa de se identificar um defeito genético que pudesse explicar o aumento de Hb F, pelo rastreamento de 16 mutações que originam talassemias do tipo beta. Encontraram-se 5,3% de heterozigotos para mutação CD6-A e 1,75% para as mutações CD 39, IVS1:6, -87 e IVS2:654, todas em heterozigose. Os resultados encontrados neste estudo evidenciam a necessidade de melhor caracterização dos perfis de hemoglobina obtidos pelos métodos clássicos e a importância de sua caracterização molecular.

Avaliação do polimorfismo de grupos sanguíneos e fenótipo de hemoglobinas em um grupo de universitários de São José do Rio Preto, SP

The studies of the phenotypes of the blood groups are important for blood transfusions, for obstetrics, neonatology and law medicine, apart from its application in anthropology where it can be used as genetic markers in population studies. Works with hemoglobin polymor-phisms as a genetic marker of populations has been increased over the last few years, particularly for different population groups of Brazil. In the investigation the hemoglobin polymorphisms of 200 university students from São José do Rio Preto, Brazil were studied to establish a possible relation between the different phenotypes. Statistical analysis of the phenotypes showed that the differences observed were not significant, without a relationship among the polymorphisms of blood groups and hemoglobins.

Crystal structure of hemoglobin from the maned wolf (Chrysocyon brachyurus) using synchrotron radiation

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Rastreamento de hemoglobinas variantes e talassemias com associação de métodos de diagnóstico

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Diagnóstico laboratorial de hemoglobinas semelhantes à HbS

A hemoglobina S (HbS) está presente na população brasileira com prevalência variável, dependente dos grupos raciais formadores de cada região. A migração eletroforética em pH alcalino apresenta similaridade com outras hemoglobinas, e estudos complementares para sua correta caracterização são necessários. No presente estudo objetivamos traçar um fluxograma com as metodologias disponíveis para a caracterização da hemoglobina S e das hemoglobinas que apresentam migração semelhante em pH alcalino. No período de janeiro a junho de 2000, analisamos amostras de sangue com suspeita de hemoglobina S encaminhadas ao Laboratório de Hemoglobinas da Unesp. Caracterizamos diferentes mutantes e formas interativas com hemoglobina S, por procedimentos eletroforéticos, em variados pH, análises citológicas e testes bioquímicos específicos. Os procedimentos de análise aplicados resultaram em orientação fornecida aos laboratórios de rotina sobre como proceder no diagnóstico laboratorial destas alterações de hemoglobina. Desta forma contribuímos para um melhor conhecimento sobre a variabilidade genética das hemoglobinas em nossa população, auxiliando no acompanhamento clínico e no aconselhamento genético das hemoglobinopatias com fisiopatologia relacionada à alteração.

Avaliação dos produtos da degradação oxidativa da Hb S nos genótipos SS, SF (S/beta0 talassemia) e AS, em comparação com hemoglobinas normais

A doença falciforme é um termo genérico usado para determinar um grupo de alterações genéticas caracterizadas pelo predomínio de hemoglobina (Hb) S. Os principais genótipos que compõem o grupo de doença falciforme são os seguintes: SS, SF [S/beta0 talassemia e S/persistência hereditária de Hb fetal (PHHF)], SFA (S/beta+ talassemia), SC, SD e SH (S/alfa talassemia). O presente trabalho analisa os resultados das avaliações de produtos provenientes da oxidação da Hb S, identificados pela concentração da metemoglobina e de eritrócitos com corpos de Heinz em dois genótipos da doença falciforme (SS e S/beta0 talassemia) e no traço falcêmico (AS), em comparação com o genótipo normal (AA). A análise dos produtos da degradação oxidativa da hemoglobina, evidenciados pelo aumento dos valores das médias referentes à concentração de metemoglobina e do número de eritrócitos com corpos de Heinz, está diretamente relacionada com o aumento da concentração da Hb S. Assim, a degradação oxidativa da hemoglobina decresce entre os genótipos estudados da seguinte forma: SS>SF>AS>AA. É importante destacar que as análises indicaram que a simples presença de Hb S no eritrócito, como é o caso do genótipo AS, é capaz de causar elevação da concentração de metemoglobina em 52,62% das amostras analisadas e de induzir a precipitação de corpos de Heinz em 73,68% dos casos estudados. Explicações referentes aos processos oxidativos e redutores das hemoglobinas estudadas são apresentados no texto. Destaca-se, entre os resultados apresentados, a identificação por meio de eletroforese em agarose alcalina da fração de globina alfa-livre em todas as amostras do genótipo SF provenientes de pessoas com Hb S/beta0 talassemia. É proposto um esquema para explicar a origem da globina alfa-livre, especialmente para o genótipo S/beta0 talassemia, e a importância da sua identificação no diagnóstico laboratorial de Hb S/beta0 talassemia.