Diversidade de respostas de Corynebacterium diphtheriae frente a agentes oxidantes: resistência, adaptação e envolvimento do determinante de resistência ao telurito (TeR) e do sistema OxyR na virulência bacteriana

Corynebacterium diphtheriae é um importante patógeno humano e agente causal da difteria. Embora seja observada uma redução mundial no número de casos da doença, a difteria permanece endêmica em muitos países e surtos são esporadicamente notificados. No Brasil, o último surto ocorreu no estado no Maranhão e revelou mudanças em aspectos clínico-epidemiológicos da doença. Diferentemente da maioria das cepas de difteria brasileiras, que pertencem ao biovar mitis, nesse surto dois diferentes pulsotipos de C. diphtheriae biovar intermedius foram isolados. Além disso, sinais patognomônicos da doença não foram relatados em parte dos casos. C. diphtheriae também vem sendo relacionado com quadros de infecções invasivas, apesar de ser reconhecido como patógeno tipicamente extracelular. Em conjunto, estas mudanças no perfil das infecções por C. diphtheriae sugerem a existência de outros fatores de virulência além da produção da toxina diftérica. Neste sentindo, foram realizadas análises de tipagem molecular e de genômica comparativa para avaliar a diversidade genética e o potencial de virulência de cepas de C. diphtheriae isoladas de difteria clássica e infecções invasivas. Os resultados obtidos demonstram a circulação de diferentes clones invasores no Brasil. Além disso, revelaram diferenças marcantes na presença e na composição de ilhas de patogenicidade entre as amostras, bem como nos genes sob regulação do DtxR e nas sequências dos corinefagos integradas ao cromossomo bacteriano. Uma vez que o potencial invasor bacteriano e a persistência no ambiente podem estar relacionados à tolerância ao estresse oxidativo, foram procurados nos genomas sequenciados, genes possivelmente envolvidos neste processo. Dentre estes, os genes DIP0906, predito como gene de resistência ao oxidante telurito (TeO32-), e DIP1421, codificador do regulador transcricional OxyR, foram caracterizados funcionalmente e tiveram seus papéis na patogenicidade investigados. Ensaios in vivo utilizando o nematódeo Caenorhabditis elegans demonstraram que ambos são importantes para a virulência de C. diphtheriae. Além da resistência ao TeO32, DIP0906 parece contribuir para a resistência ao peróxido de hidrogênio (H2O2) e para a viabilidade no interior de células respiratórias humanas. Já OxyR, além de controlar negativamente a resposta ao H2O2, parece estar envolvido com a ligação de C. diphtheriae a proteínas plasmáticas e de matriz extracelular. Adicionalmente, foi investigada resistência e a capacidade de adaptação de C. diphtheriae frente a agentes oxidantes, através da indução de resposta adaptativa e/ou resistência cruzada e da formação de biofilme. As cepas de C. diphtheriae apresentaram diferentes níveis de resistência e um comportamento heterogêneo na presença dos agentes oxidantes, o que sugere a existência de diferentes estratégias de sobrevivência e adaptação de C. diphtheriae nas condições de estresse oxidativo.

Filogeografia e evolução molecular de lagostas sapateiras (Scyllarides spp.) da América do Sul

Nos últimos anos, duas espécies de lagostas sapateiras, Scyllarides brasiliensis e S. deceptor, vêm se destacando nos desembarques pesqueiros de lagostas do Atlântico Sul Ocidental. Para espécies comercialmente importantes, o desenvolvimento de estudos que permitam conhecer a variabilidade e entender a dinâmica populacional é fundamental. Assim, o objetivo do primeiro capítulo desta tese foi avaliar a diversidade genética e a estrutura populacional dessas duas lagostas ao longo de aprox. 2.800 km da costa da América do Sul. Para as análises, foram empregados marcadores mitocondriais (citocromo oxidase I: COI; e a região controle: RC) e marcadores nucleares (13 loci de microssatélites desenvolvidos nesta tese). As duas espécies apresentaram altos níveis de variabilidade (S. deceptor: N = 200, mtDNA: h > 0,841, π > 0,005; microssatélites: He = 0,685; S. brasiliensis: N = 211, He = 0,554), distribuídos homogeneamente entre as localidades (S. deceptor: ΦST < -0,004, ΦCT < 0,016, FST global = 0,001, Dest global = 0,003, FCT < 0,002, P > 0,05, K = 1; S. brasiliensis: FST global = 0,004, Dest global = 0,001, FCT < 0,004, P > 0,05, K = 1). A ausência de estruturação nas duas espécies pode estar relacionada a características biológicas que promovem a conectividade entre localidades geograficamente distantes, como alta fecundidade e alto potencial de dispersão das larvas planctônicas. Além disso, os dados mitocondriais sugerem que a história demográfica de S. deceptor foi marcada por eventos de expansão populacionais e geográficos possivelmente relacionados às condições ambientais favoráveis dos episódios interglaciais do Pleistoceno Médio-Tardio. Diversos estudos têm mostrado que os fenômenos de inserção de regiões mitocondriais no DNA nuclear (NuMts) e heteroplasmia limitam a correta amplificação e identificação dos marcadores mitocondriais. Em estudos filogenéticos e de genética de populações, a presença inadvertida de sequências de diversas origens viola o principio de ortologia, o que pode resultar em inferências evolutivas erradas. Assim, o objetivo do segundo capítulo desta tese foi identificar e caracterizar os possíveis NuMts e sequências heteroplásmicas de três regiões mitocondriais (COI, RC e o gene da subunidade maior do RNA ribossomal: 16S) em quatro espécies do gênero Scyllarides (S. aequinoctialis, S. brasiliensis, S. deceptor e S. delfosi). A clonagem e sequenciamento de extratos de DNA genômico e DNA enriquecido com mtDNA revelaram que os genomas destas espécies podem exibir NuMts (que divergem entre 0,6 e 17,6% do mtDNA) e heteroplasmia (que divergem < 0,2% do mtDNA prevalente). Os NuMts surgiram possivelmente de vários eventos independentes de integração ao núcleo ao longo da história evolutiva do gênero Scyllarides. Dependendo do seu grau de similaridade com o mtDNA, a presença de NuMts nas análises filogenéticas no nível de gênero pode causar superestimativa do número de espécies e alterações nos comprimentos dos ramos e nas relações filogenéticas entre espécies.

A biotecnologia nos programas de melhoramento de forrageiras tropicais da Embrapa Gado de Corte.

Neste trabalho procurou-se apresentar e discutir, de forma ampla, o uso da biotecnologia e seu potencial para os programas de melhoramento de forrageiras tropicais realizados na Embrapa Gado de Corte. O uso da biotecnologia nesses programas é uma atividade recente, mas importantes resultados vêm sendo gerados a fim de auxiliar o processo de obtenção de novas cultivares forrageiras. A maioria dos trabalhos apresentados utiliza marcadores Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD) para aplicações em curto prazo: estudos de diversidade em acessos de bancos de germoplasma, identificação de híbridos e estimação da taxa de cruzamento. Aplicações em médio e longo prazos do uso de marcadores, como mapeamento genético e seleção auxiliada por marcadores moleculares (SAMM), ainda necessitam de maiores investimentos, tanto na busca de novos marcadores, quanto no desenvolvimento de populações adequadas para esses estudos. Em 2007, teve início uma nova linha de pesquisa nessa unidade, a prospecção de genes com características econômicas. Genes para a tolerância ao alumínio são o foco dessa pesquisa que pretende explorar a sintenia entre os genomas de gramíneas, visando ao desenvolvimento de cultivares de braquiária mais tolerantes ao alumínio. A Embrapa Gado de Corte vem investindo em pessoal e aquisição de equipamentos para avançar não só na produção de cultivares de forrageiras mais adaptadas às necessidades de um mercado cada vez mais exigente, como também no crescimento institucional do setor de biotecnologia.

Banano ornamental: diversificación del uso de germoplasma para atender a nuevos mercados.

El mercado de plantas ornamentales tropicales ha mostrado un crecimiento expresivo y la búsqueda por novedades es constante. Actualmente hay pocas variedades de bananos ornamentales disponibles para comercialización, y en su mayoría constituyen el uso directo de especies de las secciones Rhodoclamys (M. ornata y M. velutina) y Callimusa (M. coccinea). La generación de nuevas variedades de banano ornamental para diferentes usos constituye una alternativa para satisfacer esta demanda. La Embrapa Yuca y Frutales mantiene un banco de germoplasma de Musa spp. con 290 accesiones, que contemplan variedades y especies silvestres de la sección Eumusa, con un predominio de M. acuminata y M. balbisiana, con diferentes grados de ploidia y combinaciones de los genomas A y B. La colección también alberga representantes de las secciones Rhodochlamys y Callimusa. Tradicionalmente el uso de este germoplasma estaba direccionado sólo a la producción de cultivares para la alimentación, y ha generado varios cultivares productivos, con frutos de buena calidad y resistentes al mal de Panamá, Sigatoka amarilla y Sigatoka negra.

Anais...

Situação atual do marco regulatório sobre o acesso ao patrimônio genético frente às atividades de pesquisa e desenvolvimento de produtos biológicos. Principais atividades da coordenação de fertilizantes, inoculantes e corretivos no biênio 2012-2014. Resultados das análises da fiscalização de produtos inoculantes para leguminosas nos anos de 2012-2013 e estabelecimento de um ensaio interlaboratorial. Perspectivas de uso de inoculantes microbianos no Brasil: a visão da ANPII. A rede ?FBN_ABC?: compromisso com a promoção dos benefícios da Fixação Biológica do Nitrogênio ( FBN) através dos inoculantes. Método alternativo para contagem e viabilidade celular para inoculantes: novo horizonte baseado em citometria de fluxo. Alternativa metodológica para contagem de Azospirillum em inoculantes. Sugestão para alterações nos meios de cultura e análises de Azospirillum nas instruções normativas Nº 30 e Nº 13 do MAPA. Análise de nodulação de soja e uso de um inoculante padrão em casa de vegetação para determinar a qualidade de produtos comerciais. Eficiência simbiótica de estirpes de Bradyrhizobium para a produção de mudas de Centrolobium paraense. Avaliação da eficiência agronômica de novas estirpes de rizóbio para a cultura do feijoeiro. Caracterização e avaliação agronômica de novos isolados de rizóbio obtidos de nódulos de genótipos silvestes de feijoeiro-comum. Resposta do feijoeiro irrigado à inoculação em fazendas do GTEC-feijão em Unaí-MG: safras 2012 e 2013. Recomendação de nova estirpe de Rhizobium para feijão-comum. Sobrevida en semillas de soja de esporas de Penicillium bilaiae. Uso y sistema de aplicación de promotores del crecimiento em semilla de soja. Novas tecnologias na cultura da soja: métodos de inoculação, densidades de plantas e novas estirpes de Bradyrhizobium. Relato dos resultados de ensaios de adubação nitrogenada na cultura da soja pelo CESB (Comitê Estratégico Soja Brasil). Resposta do amendoinzeiro à inoculação. Efeito de biofertilizante na promoção de crescimento e aumento de produtividade de arroz. Alterações de germinação e vigor de sementes da cultivar de arroz BRS pampa tratadas com indutores de crescimento. Promoção do crescimento de milho por novas estirpes de bactérias associativas: resultados de ensaios em rede conduzidos pelo instituto nacional de ciência e tecnologia da Fixação Biológica do Nitrogênio (INCT-FBN) Metodologias de inoculação de Azospirillum brasilense na cultura de milho. O conteúdo de exopolissacarídeos e polihidroxibutirato influenciam a sobrevivência de Azospirillum brasilense e o desenvolvimento de raízes de plântulas de milho. Reclassificação de espécies de estirpes autorizadas para as culturas da soja e do feijoeiro e revelações obtidas no sequenciamento dos seus genomas. Coinoculaçâo da soja e do feijoeiro com rizóbios e Azospirillum brasilense. Validação de estirpes de rizóbio para a inoculação de espécies arbóreas, adubos verdes e forrageiras visando metas do programa ABC e do novo código florestal. Evaluación de un inoculante formulado con cepas de Bacillus amyloliquefaciens para el control biológico de hongos fitopatógenos. Relação de membros credenciados na Relare. Ata técnica da assembleia geral ordinária da XVII Relare. Ata da eleição da diretoria da Relare para o biênio 2014 ? 2016. Relação dos participantes da XVII Relare.

Influencia del sexo en la transmisión vertical del nucleopoliedrovirus de Spodoptera exigua (SeMNPV-Al1)

El ciclo ecológico de los baculovirus comprende dos vías de transmisión: la horizontal que se produce entre congéneres y la vertical, que implica el paso de genomas virales de los parentales a la progenie. Recientemente se ha estudiado la efectiva transmisión vertical del Nucleopoliedrovirus de Spodoptera exigua (SeMNPV-Al1) en una población de su húesped de los invernaderos de Almería (España). La detección de progenie infectada de hembras sanas, sugiere la necesidad de determinar el papel que juegan ambos sexos en la transmisión del virus. En el presente trabajo se establecieron infecciones subletales para obtener adultos con infecciones encubiertas y utilizando un esquema de apareamientos entre adultos sanos e infectados se verificó que la transmisión del virus es posible vía paterna o materna. La vía materna parece más constante en su respuesta de acuerdo a la medición de la carga viral obtenida en la descendencia (qPCR). El tratamiento de desinfección de la puesta no afectó a la detección de ADN viral en la descendencia, lo que sugiere una transmisión transovo. La carga viral por insecto fue similar independientemente del sexo de los parentales y la descendencia masculina y femenina se vio afectada de igual manera por la infección.

Selección de un aislado del nucleopoliedrovirus de Helicoverpa armigera (HearNPV) para su uso como base de un bioinsecticida

Helicoverpa armigera (Lepidoptera; Noctuidae), conocida como el taladro del tomate, es una especie polífaga y de amplia distribución, responsable de grandes pérdidas económicas en más de 60 cultivos a lo largo de las regiones tropicales y subtropicales del mundo. Estas plagas se controlan mayoritariamente con plaguicidas químicos, aunque existe un gran interés por desarrollar otros agentes de control biológico. Entre estos, se encuentra el nucleopoliedrovirus de Helicoverpa armigera (HearNPV, Baculoviridae), que por sus características de seguridad y eficacia, sería útil para impulsar los programas de gestión integrada de plagas que se fomentan desde la Directiva 2009/128/CEE. El objetivo de este trabajo fue realizar una caracterización bioquímica y biológica de varios aislados de HearNPV : un aislado silvestre español (Badajoz) HearNPV-SP1, un aislado chino HearSNPV-G4, tres aislados sudafricanos (HearNPV-Whl, HearNPV-Kzn, HearNPV-Alb) y la materia activa de un producto comercial en uso en Europa (HearNPV-Hx). El análisis con las enzimas de restricción determinó que la enzima BglII generaba perfiles similares pero con fragmentos característicos en todos los casos a excepción de los aislados HearNPV-Kzn y HearNPVAlb, que no pudieron ser diferenciados entre sí con ninguna de las enzimas probadas. El análisis filogenético, basado en las secuencias parciales de los genes poliedrina (polh), lef-8 y lef-9, donde se incluyeron las secuencias correspondientes a 18 genomas mostró que el aislado HearNPV-Whl es filogenéticamente próximo a las cepas de origen ibérico, mientras que los aislados HearNPV-Hx y HearNPV-Alb comparten la misma rama que los aislados asiáticos y australiano. La caracterización insecticida de los aislados HearNPV-SP1, HearNPV-Hx y HearNPV-G4 reveló que la virulencia (TMM) del aislado HearNPV-SP1 (104 h) fue significativamente menor que la de los aislados HearNPV-G4 (109 h) y HearNPV-Hx (111 h). En este trabajo, se determinó que el tiempo de acción del HearNPV-SP1 es menor al de otros bioinsecticidas en uso en Europa, por lo que se confirma la posibilidad de mejorar los productos activos en uno de los aspectos más sensibles de cara a su comercialización como es su tiempo de actuación.

Vírus e retrovírus

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Estudios de asociación genómica en poblaciones animales independientes

En mejoramiento genético animal, uno de los principales enfoques para explicar la arquitectura genética de caracteres de importancia económica son los estudios de asociación del genoma completo (GWAS), que no suelen ser particularmente potentes dado el reducido tamaño muestral. Un enfoque para aumentar la potencia de detección de QTL es combinar datos de poblaciones diferentes en un análisis conjunto de asociación (JA). Sin embargo, este enfoque tiene limitaciones tales como la definición de efectos a ser modelados entre poblaciones y la dificultad en el acceso a los genotipos de poblaciones comerciales. Alternativamente, se pueden combinar resultados obtenidos de GWAS independientes mediante el meta-análisis (MA-GWAS). El objetivo central de esta tesis es describir e implementar métodos para GWAS a nivel poblacional y también, combinando datos de varias poblaciones (JA), así como combinando resultados de GWAS independientes (MA-GWAS). La aplicación en datos reales mostró que MA aumentó la potencia para detectar QTL significativos en contraste con los GWAS poblacionales y el JA, considerando la estructura genética, la heterogeneidad de los componentes de varianza entre poblaciones y evitando problemas del JA tales como el acceso a los datos y definición de los efectos fijos. Los resultados del MA fueron usados en la búsqueda de genes candidatos, identificando nuevas posiciones para algunos de los caracteres de calidad de carne porcina evaluados. En conclusión, el trabajo describe métodos novedosos para integrar resultados de evaluaciones genómicas independientes, a fin de detectar asociaciones significativas entre poblaciones e identificar nuevos genes asociados con caracteres de importancia económica.

Clonación de gametas y transgénesis mediada por fertilización in-vitro en bovinos

En la presente tesis se desarrolló un método de clonación del genoma del espermatozoide y del ovocito bovino mediante la producción de embriones androgenéticos y partenogenéticos haploides. Esta técnica también fue utilizada para generar embriones bovinos que expresan un gen exógeno (transgen) en forma homogénea. Las tasas de desarrollo de los embriones reconstruídos utilizando genomas espermaticos clonados (blastomeras androgenéticas), alcanzaron 85.1 por ciento de clivaje, 9 por ciento de blastocistos y todos los embriones expresaron el transgen (EGFP) durante el desarrollo in-vitro. Las tasas de clivaje y de blastocistos de los embriones reconstruídos utilizando genomas clonados de ovocitos (blastomeras partenogenéticas), alcanzaron 78.4 por ciento y 10.8 por ciento respectivamente. Todos los embriones reconstruidos utilizando blastomeras partenogenéticas que expresaban el transgen mostraron expresión de EGFP y el 96.6 por ciento de ellos en forma homogénea. Posteriormente se desarrolló un nuevo método de transgenesis que permite transfectar cigotos de fertilización in vitro (FIV) y ovocitos activados partenogeneticamente (AP). El 70 por ciento de los embriones clivados y el 50 por ciento de los blastocistos expresaron EGFP cuando complejos pCX-EGFP-liposomas fueron inyectados 16 h post-fertilizacion y utilizando una concentración de 500 ng ADN exógeno.ƒÊl. Al inyectar ovocitos 3 h post-activación partenogénetica se obtuvo una tasa de expresión de 48.4 por ciento. Por otro lado, evaluamos la incidencia de fragmentación del ADN tras la inyección del transgen, demostrando que su expresión afecta la integridad del ADN en blastocistos bovinos de FIV, pero no así las tasas de desarrollo in vitro. En resumen, la presente tesis conforma una base sólida para concluir que es posible la clonación de genomas de ovocitos y espermatozoides con capacidad de generar embriones biparentales que evolucionan hasta estadio de blastocisto. Además, este procedimiento demostró ser una herramienta eficiente para la incorporación de genes exógenos en un embrión. Finalmente se demostró que la inyección intracitoplasmática de liposomas es una estrategia eficiente para introducir ADN exógeno en embriones de FIV y AP.

Aplicación de cadenas absorbentes de Markov a un modelo de autofecundación en alohexaploides

p.21-27

Estudios de asociación genómica en poblaciones animales independientes

En mejoramiento genético animal, uno de los principales enfoques para explicar la arquitectura genética de caracteres de importancia económica son los estudios de asociación del genoma completo (GWAS), que no suelen ser particularmente potentes dado el reducido tamaño muestral. Un enfoque para aumentar la potencia de detección de QTL es combinar datos de poblaciones diferentes en un análisis conjunto de asociación (JA). Sin embargo, este enfoque tiene limitaciones tales como la definición de efectos a ser modelados entre poblaciones y la dificultad en el acceso a los genotipos de poblaciones comerciales. Alternativamente, se pueden combinar resultados obtenidos de GWAS independientes mediante el meta-análisis (MA-GWAS). El objetivo central de esta tesis es describir e implementar métodos para GWAS a nivel poblacional y también, combinando datos de varias poblaciones (JA), así como combinando resultados de GWAS independientes (MA-GWAS). La aplicación en datos reales mostró que MA aumentó la potencia para detectar QTL significativos en contraste con los GWAS poblacionales y el JA, considerando la estructura genética, la heterogeneidad de los componentes de varianza entre poblaciones y evitando problemas del JA tales como el acceso a los datos y definición de los efectos fijos. Los resultados del MA fueron usados en la búsqueda de genes candidatos, identificando nuevas posiciones para algunos de los caracteres de calidad de carne porcina evaluados. En conclusión, el trabajo describe métodos novedosos para integrar resultados de evaluaciones genómicas independientes, a fin de detectar asociaciones significativas entre poblaciones e identificar nuevos genes asociados con caracteres de importancia económica.

Molecular study of cell degeneration and evolution induced by mRNA mistranslation

As proteínas existentes nas células são produzidas pelo mecanismo de tradução do mRNA, no qual a informação genética contida nos genes é descodificada em cadeias polipeptídicas. O código genético, que define as regras de descodificação do genoma, minimiza os erros de tradução do mRNA, garantindo a síntese de proteínas com elevada fidelidade. Esta é essencial para a estabilidade do proteoma e para a manutenção e funcionamento dos processos celulares. Em condições fisiológicas normais, os erros da tradução do mRNA ocorrem com frequências que variam de 10-3 a 10-5 erros por codão descodificado. Situações que aumentam este erro basal geralmente estão associadas ao envelhecimento, stresse e a doenças; no entanto, em certos organismos o código genético é traduzido naturalmente com elevado erro, indicando que a síntese de proteínas aberrantes pode de algum modo ser vantajosa. A fim de estudar a resposta celular aos erros de tradução do mRNA, construímos leveduras que incorporam serina no proteoma em resposta a um codão de leucina, usando a expressão constitutiva de um tRNASer mutante. Este fenómeno genético artificial provocou uma forte diminuição da esporulação, da viabilidade e da eficiência de mating, afectando imensamente a reprodução sexual da levedura. Observou-se também uma grande heterogeneidade no tamanho e na forma das células e elevada instabilidade genómica, com o aparecimento de populações poliplóides e aneuplóides. No sentido de clarificar as bases celulares e moleculares daqueles fenótipos e compreender melhor a biologia do erro de tradução do mRNA, construímos também células de levedura que inserem serina em resposta a um codão de leucina de modo indutível e controlado. Utilizaram-se perfis de mRNA total e de mRNA associado a polissomas para elucidar a resposta celular ao erro de tradução do mRNA. Observou-se a indução de genes envolvidos na resposta ao stresse geral, stresse oxidativo e na unfolded protein response (UPR). Um aumento significativo de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e um forte impacto negativo na capacidade das células pós-mitóticas re-iniciarem o crescimento foram também observados. Este fenótipo de perda de viabilidade celular foi resgatado por scavangers de ROS, indicando que o stresse oxidativo é a principal causa de morte celular causada pelos erros de tradução. Este estudo levanta a hipótese de que o stresse oxidativo e a acumulação de ROS, ao invés do colapso súbito do proteoma, são as principais causas da degeneração celular e das doenças humanas associadas aos erros de tradução do genoma. ABSTRACT: Proteins are synthesized through the mechanism of translation, which uses the genetic code to transform the nucleic acids based information of the genome into the amino acids based information of the proteome. The genetic code evolved in such a manner that translational errors are kept to a minimum and even when they occur their impact is minimized by similar chemical properties of the amino acids. Protein synthesis fidelity is essential for proteome stability and for functional maintenance of cellular processes. Indeed, under normal physiological conditions, mistranslation occurs at frequencies that range from 10-3 to 10-5 errors per codon decoded. Situations where this basal error frequency increases are usually associated to aging and disease. However, there are some organisms where genetic code errors occur naturally at high level, suggesting that mRNA mistranslation can somehow be beneficial. In order to study the cellular response to mRNA mistranslation, we have engineered single codon mistranslation in yeast cells, using constitutive expression of mutant tRNASer genes. These mistranslating strains inserted serines at leucine-CUG sites on a proteome wide scale due to competition between the wild type tRNALeu with the mutant tRNASer. Such mistranslation event decreased yeast sporulation, viability and mating efficiencies sharply and affected sexual reproduction strongly. High heterogeneity in cell size and shape and high instability in the genome were also observed, with the appearance of some polyploid or aneuploid cell populations. To further study the cellular and molecular basis of those phenotypes and the biology of mRNA mistranslation, we have also engineered inducible mRNA misreading in yeast and used total mRNA and polysome associated mRNA profiling to determine whether codon misreading affects gene expression. Induced mistranslation up-regulated genes involved in the general stress response, oxidative stress and in the unfolded protein response (UPR). A significant increase in reactive oxygen species (ROS) and a strong negative impact on the capacity of post-mitotic cells to re-initiate growth in fresh media were also observed. This cell viability phenotype was rescued by scavengers of ROS, indicating that oxidative stress is the main cause of cell death caused by mRNA mistranslation. This study provides strong support for the hypothesis that oxidative stress and ROS accumulation, rather than sudden proteome collapse or major proteome disruption, are the main cause of the cellular degeneration observed in human diseases associated mRNA mistranslation.

Sistema computacional para o estudo da estrutura primária e redesenho de genes

Um dos maiores avanços científicos do século XX foi o desenvolvimento de tecnologia que permite a sequenciação de genomas em larga escala. Contudo, a informação produzida pela sequenciação não explica por si só a sua estrutura primária, evolução e seu funcionamento. Para esse fim novas áreas como a biologia molecular, a genética e a bioinformática são usadas para estudar as diversas propriedades e funcionamento dos genomas. Com este trabalho estamos particularmente interessados em perceber detalhadamente a descodificação do genoma efectuada no ribossoma e extrair as regras gerais através da análise da estrutura primária do genoma, nomeadamente o contexto de codões e a distribuição dos codões. Estas regras estão pouco estudadas e entendidas, não se sabendo se poderão ser obtidas através de estatística e ferramentas bioinfomáticas. Os métodos tradicionais para estudar a distribuição dos codões no genoma e seu contexto não providenciam as ferramentas necessárias para estudar estas propriedades à escala genómica. As tabelas de contagens com as distribuições de codões, assim como métricas absolutas, estão actualmente disponíveis em bases de dados. Diversas aplicações para caracterizar as sequências genéticas estão também disponíveis. No entanto, outros tipos de abordagens a nível estatístico e outros métodos de visualização de informação estavam claramente em falta. No presente trabalho foram desenvolvidos métodos matemáticos e computacionais para a análise do contexto de codões e também para identificar zonas onde as repetições de codões ocorrem. Novas formas de visualização de informação foram também desenvolvidas para permitir a interpretação da informação obtida. As ferramentas estatísticas inseridas no modelo, como o clustering, análise residual, índices de adaptação dos codões revelaram-se importantes para caracterizar as sequências codificantes de alguns genomas. O objectivo final é que a informação obtida permita identificar as regras gerais que governam o contexto de codões em qualquer genoma.

Análise de tripletos e de repetições em estruturas primárias de DNA

O desenvolvimento de equipamentos de descodificação massiva de genomas veio aumentar de uma forma brutal os dados disponíveis. No entanto, para desvendarmos informação relevante a partir da análise desses dados é necessário software cada vez mais específico, orientado para determinadas tarefas que auxiliem o investigador a obter conclusões o mais rápido possível. É nesse campo que a bioinformática surge, como aliado fundamental da biologia, uma vez que tira partido de métodos e infra-estruturas computacionais para desenvolver algoritmos e aplicações informáticas. Por outro lado, na maior parte das vezes, face a novas questões biológicas é necessário responder com novas soluções específicas, pelo que o desenvolvimento de aplicações se torna um desafio permanente para os engenheiros de software. Foi nesse contexto que surgiram os principais objectivos deste trabalho, centrados na análise de tripletos e de repetições em estruturas primárias de DNA. Para esse efeito, foram propostos novos métodos e novos algoritmos que permitirem o processamento e a obtenção de resultados sobre grandes volumes de dados. Ao nível da análise de tripletos de codões e de aminoácidos foi proposto um sistema concebido para duas vertentes: por um lado o processamento dos dados, por outro a disponibilização na Web dos dados processados, através de um mecanismo visual de composição de consultas. Relativamente à análise de repetições, foi proposto e desenvolvido um sistema para identificar padrões de nucleótidos e aminoácidos repetidos em sequências específicas, com particular aplicação em genes ortólogos. As soluções propostas foram posteriormente validadas através de casos de estudo que atestam a mais-valia do trabalho desenvolvido.