Étude sur le rôle des mutations de novo dans l’étiologie génétique de la schizophrénie

La schizophrénie est une maladie psychiatrique grave qui affecte approximativement 1 % de la population. Il est clairement établi que la maladie possède une composante génétique très importante, mais jusqu’à présent, les études ont été limitées au niveau de l’identification de facteurs génétiques spécifiquement liés à la maladie. Avec l’avènement des nouvelles avancées technologiques dans le domaine du séquençage de l’ADN, il est maintenant possible d’effectuer des études sur un type de variation génétique jusqu’à présent laissé pour compte : les mutations de novo, c.-à-d. les nouvelles mutations non transmises de manière mendélienne par les parents. Ces mutations peuvent avoir deux origines distinctes : une origine germinale au niveau des gamètes chez les parents ou une origine somatique, donc au niveau embryonnaire directement chez l’individu. L’objectif général de la présente recherche est de mieux caractériser les mutations de novo dans la schizophrénie. Comme le rôle de ces variations est peu connu, il sera également nécessaire de les étudier dans un contexte global au niveau de la population humaine. La première partie du projet consiste en une analyse exhaustive des mutations de novo dans la partie codante (exome) de patients atteints de schizophrénie. Nous avons pu constater que non seulement le taux de mutations était plus élevé qu’attendu, mais nous avons également été en mesure de relever un nombre anormalement élevé de mutations non-sens, ce qui suggère un profil pathogénique. Ainsi, nous avons pu fortement suggérer que les mutations de novo sont des actrices importantes dans le mécanisme génétique de la schizophrénie. La deuxième partie du projet porte directement sur les gènes identifiés lors de la première partie. Nous avons séquencé ces gènes dans une plus grande cohorte de cas et de contrôles afin d’établir le profil des variations rares pour ces gènes. Nous avons ainsi conclu que l’ensemble des gènes identifiés par les études de mutations de novo possède un profil pathogénique, ce qui permet d’établir que la plupart de ces gènes ont un rôle réel dans la maladie et ne sont pas des artéfacts expérimentaux. De plus, nous avons pu établir une association directe avec quelques gènes qui montrent un profil aberrant de variations rares. La troisième partie du projet se concentre sur l’effet de l’âge paternel sur le taux de mutations de novo. En effet, pour la schizophrénie, il est démontré que l’âge du père est un facteur de risque important. Ainsi, nous avons tenté de caractériser l’effet de l’âge du père chez des patients en santé. Nous avons observé une grande corrélation entre l’âge du père et le taux de mutations germinales et nous avons ainsi pu répertorier certaines zones avec un grand nombre de mutations de novo, ce qui suggère l’existence de zone chaude pour les mutations. Nos résultats ont été parmi les premiers impliquant directement les mutations de novo dans le mécanisme génétique de la schizophrénie. Ils permettent de jeter un nouveau regard sur les réseaux biologiques à l’origine de la schizophrénie en mettant sous les projecteurs un type de variations génétiques longtemps laissé pour compte.

Études de nouvelles maladies neurogénétiques chez les Canadiens français.

Depuis déjà plusieurs décennies, nous sommes en mesure d'identifier les mutations responsable de diverses maladies mendéliennes. La découverte des gènes responsables de ces maladies permet non seulement un meilleur diagnostic clinique pour ces familles, mais aussi de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de ces maladies ainsi que mieux définir la fonction normale des gènes causales. Ultimement, ces découvertes mènent à l'identification de cibles thérapeutiques pour le traitement de ces maladies. Les progrès technologiques sont depuis toujours un facteur très important dans la découverte de ces gènes mutés. De l'approche traditionnelle de clonage positionnel en passant par la première séquence du génome humain et maintenant les technologies de séquençage à grande échelle, de plus en plus de maladies ont maintenant une entité génétique. Dans le cadre de ce projet de doctorat, nous avons utilisé tant les approches traditionnelles (leucodystrophies) que les nouvelles technologies de séquençage (polyneuropathie douloureuse) qui ont mené à l'identification du gène causal pour plusieurs de nos familles. L'efficacité de ces deux approches n'est plus à démontrer, chacune d'entre elles possèdent des avantages et des inconvénients. Dans le cadre de ces projets, nous avons utilisé la population canadienne-française connue pour ces effets fondateurs et la présence, encore aujourd'hui, de grandes familles. Les différents projets ont permis d'établir certains avantages et inconvénients quant à l'utilisation de ces techniques et de la population canadienne-française. Dans le cadre d'un phénotype assez homogène et bien défini comme celui du projet leucodystrophie, l'approche traditionnel par gène candidat nous a permis d'identifier le gène causal, POLR3B, sans trop de difficulté. Par contre, pour les autres projets où nous sommes en présence d'une hétérogénéité clinique et génétique une approche non-biaisée utilisant le séquençage exomique a obtenu un plus grand succès. La présence de grandes familles est un grand avantage dans les deux approches. Dans le projet polyneuropathie douloureuse, une grande famille originaire du Saguenay-Lac-St-Jean nous a permis d'identifier le gène NAGLU comme responsable suite à l'exclusion des autres variants candidats par analyse de ségrégation. Comme NAGLU était déjà associé à un phénotype qui diffère sur plusieurs points à celui de notre famille, une approche traditionnelle n'aurait pas été en mesure d'identifier NAGLU comme le gène causal. Dans l'analyse de nos données de séquençage exomique, nous avons observé que plusieurs variants rares, absents des bases de données, étaient partagés entre les différents individus Canadiens français. Ceci est probablement dû à la démographie génétique particulière observée chez les Canadiens français. En conclusion, les technologies de séquençage à grande échelle sont avantageuses dans l'étude de maladies hétérogènes au niveau clinique et génétique. Ces technologies sont en voie de modifier l'approche d'identification de gènes en permettant une analyse de génétique inversée, c'est-à-dire de la génétique vers la clinique.

Prevention of Cardiometabolic Disease in Familial Hypercholesterolemia

L’hypercholestérolémie familiale (FH) est un désordre lipidique associé aux maladies cardiovasculaires les plus fréquentes. La FH est causée par des mutations dans les gènes LDLR, APOB et PCSK9. Toutefois, chez 20% des patients souffrant de FH, aucune mutation dans ces gènes n'a été détectée et ceci suggère que d’autres gènes seraient à l’origine de la FH. Actuellement, le seul traitement de la FH est une thérapie aux statines. En général les statines sont bien tolérées, cependant, une monothérapie ne permet pas d’atteindre des niveaux thérapeutiques acceptables et dans bien des cas, une thérapie combinée devient nécessaire. De plus, l’intolérance aux statines est présente dans environ 12% des patients. Dans les trois dernières décennies, la survie des patients avec la FH a augmentée de façon notoire mais on observe aussi l’apparition d’une calcification vasculaire sévère chez certains d’entre eux. Il est donc primordial de développer des nouvelles approches thérapeutiques afin de prévenir ces complications tardives. Dans cette thèse doctorat, nous présentons l’étude d’une famille avec un phénotype de FH sévère non causé par des mutations dans les gènes LDLR, APOB et PCSK9. Par des études biochimiques et par séquençage d’ADN utilisant les technologies de nouvelle génération (NextGenSeq), nous avons découvert une mutation dans le gène de l’APOE (Leu167del). Ceci nous permet de proposer le gène codant pour l’APOE comme le 4e locus responsable de la FH (FH4). Par la suite, nous avons effectué deux études de cohortes chez les patients atteints de FH. Premièrement, dans l’étude JUPITER, nous avons démontré que la rosuvastatin augmente les niveaux sanguins de la protéine PCSK9 et ceci limiterait l’efficacité du traitement aux statines. Nous avons aussi étudié l’influence du mutant naturel R46L (perte de fonction de la PCSK9) dans la réponse aux statines. Deuxièmement, nous avons examiné les effets de la perte de fonction de la PCSK9 sur le profil cardiométabolique au sein d’une population pédiatrique. Nous avons déterminé que le génotype de l’APOE est déterminant dans ce profil cardiométabolique. Enfin, nous avons étudié la calcification vasculaire chez les patients atteints de FH. Cette calcification vasculaire progresse de façon indépendante des niveaux de cholestérol sérique et n’est pas associée aux anomalies de l’homéostasie du calcium. En utilisant des modèles murins, nous avons démontré que les souris Ldlr-/- et Tg(Pcsk9) développent des calcifications vasculaires semblables à celles observées chez l’homme. De plus, nous avons confirmé l’implication de la voie de signalisation LRP5/Wnt dans la pathophysiologie de la calcification artérielle. Avec une étude interventionnelle, nous avons trouvé que l’inhibition de l’interleukine 1β (IL-1β) diminue fortement l’apparition de calcifications vasculaire dans notre modèle murin. En conclusion, nos études ont permis l’identification d’un nouveau gène impliqué dans la FH, ont démontré aussi que les statines augmentent les niveaux sériques de PCSK9 et que la perte de fonction de la PCSK9 altère le profil cardiométabolique. Enfin, nous avons établi que la calcification vasculaire représente une complication tardive chez les patients atteints de FH et que, dans notre modèle murin, la calcification vasculaire peut être retardée par l’inhibition d’IL-1β. Ces découvertes peuvent avoir d’importantes répercussions cliniques chez l’humain.

Approches bio-informatiques appliquées aux technologies émergentes en génomique

Les études génétiques, telles que les études de liaison ou d’association, ont permis d’acquérir une plus grande connaissance sur l’étiologie de plusieurs maladies affectant les populations humaines. Même si une dizaine de milliers d’études génétiques ont été réalisées sur des centaines de maladies ou autres traits, une grande partie de leur héritabilité reste inexpliquée. Depuis une dizaine d’années, plusieurs percées dans le domaine de la génomique ont été réalisées. Par exemple, l’utilisation des micropuces d’hybridation génomique comparative à haute densité a permis de démontrer l’existence à grande échelle des variations et des polymorphismes en nombre de copies. Ces derniers sont maintenant détectables à l’aide de micropuce d’ADN ou du séquençage à haut débit. De plus, des études récentes utilisant le séquençage à haut débit ont permis de démontrer que la majorité des variations présentes dans l’exome d’un individu étaient rares ou même propres à cet individu. Ceci a permis la conception d’une nouvelle micropuce d’ADN permettant de déterminer rapidement et à faible coût le génotype de plusieurs milliers de variations rares pour un grand ensemble d’individus à la fois. Dans ce contexte, l’objectif général de cette thèse vise le développement de nouvelles méthodologies et de nouveaux outils bio-informatiques de haute performance permettant la détection, à de hauts critères de qualité, des variations en nombre de copies et des variations nucléotidiques rares dans le cadre d’études génétiques. Ces avancées permettront, à long terme, d’expliquer une plus grande partie de l’héritabilité manquante des traits complexes, poussant ainsi l’avancement des connaissances sur l’étiologie de ces derniers. Un algorithme permettant le partitionnement des polymorphismes en nombre de copies a donc été conçu, rendant possible l’utilisation de ces variations structurales dans le cadre d’étude de liaison génétique sur données familiales. Ensuite, une étude exploratoire a permis de caractériser les différents problèmes associés aux études génétiques utilisant des variations en nombre de copies rares sur des individus non reliés. Cette étude a été réalisée avec la collaboration du Wellcome Trust Centre for Human Genetics de l’University of Oxford. Par la suite, une comparaison de la performance des algorithmes de génotypage lors de leur utilisation avec une nouvelle micropuce d’ADN contenant une majorité de marqueurs rares a été réalisée. Finalement, un outil bio-informatique permettant de filtrer de façon efficace et rapide des données génétiques a été implémenté. Cet outil permet de générer des données de meilleure qualité, avec une meilleure reproductibilité des résultats, tout en diminuant les chances d’obtenir une fausse association.

Caractérisation génétique d’une forme d’ataxie tardive.

Les ataxies forment un groupe de maladies neurodégénératives qui sont caractérisées par un manque de coordination des mouvements volontaires. Mes travaux ont porté sur une forme d'ataxie à début tardif (LOCA), après l’âge de 50 ans. Les principales caractéristiques cliniques sont: atrophie cérébelleuse à l’IRM (88%), dysarthrie (81%), atrophie du lobe frontal (50%) et nystagmus (52%). La ségrégation dans les familles de cette ataxie est en faveur d’une transmission récessive. Afin d'identifier le gène responsable de LOCA, nous avons recruté 38 patients affectés d'une forme tardive d'ataxie, issus du SLSJ, des Cantons de l’Est ou d’autres régions du Québec. Un premier criblage du génome a été effectué avec des marqueurs microsatellites sur une famille clé. Une analyse de liaison paramétrique nous a suggéré une liaison au chromosome 13 (4.4Mb). Une recherche d’un haplotype partagé entre 17 familles LOCA a diminué la taille de l'intervalle candidat à 1.6Mb, mais l’haplotype s’est avéré fréquent dans la population canadienne-française. Un second criblage du génome avec des marqueurs SNP nous a permis d’évaluer par cartographie d’homozygotie la possibilité qu’une mutation fondatrice partagée dans des sous-groupes de malades. Plusieurs stratégies d'analyse ont été effectuées, entre autre par regroupement régional. Aucun loci candidats ne fut identifié avec confiance. Nous avons donc combiné les données de génotypage avec le séquençage exomique afin d'identifier le gène responsable. L'analyse de six individus atteints nous a permis d'obtenir une liste de variants rare contenant quatre gènes potentiels. Cette analyse doit se poursuivre pour identifier le gène responsable de LOCA.

Genetic determinants of clinical heterogeneity in sickle cell disease

L’anémie falciforme est une maladie monogénique causée par une mutation dans le locus de la β-globine. Malgré le fait que l’anémie falciforme soit une maladie monogénique, cette maladie présente une grande hétérogénéité clinique. On présume que des facteurs environnementaux et génétiques contribuent à cette hétérogénéité. Il a été observé qu’un haut taux d’hémoglobine fœtale (HbF) diminuait la sévérité et la mortalité des patients atteints de l’anémie falciforme. Le but de mon projet était d’identifier des variations génétiques modifiant la sévérité clinique de l’anémie falciforme. Dans un premier temps, nous avons effectué la cartographie-fine de trois régions précédemment associées avec le taux d’hémoglobine fœtale. Nous avons ensuite effectué des études d’association pan-génomiques avec deux complications cliniques de l’anémie falciforme ainsi qu’avec le taux d’hémoglobine fœtale. Hormis les régions déjà identifiées comme étant associées au taux d’hémoglobine fœtale, aucun locus n’a atteint le niveau significatif de la puce de génotypage. Pour identifier des groupes de gènes modérément associés au taux d’hémoglobine fœtale qui seraient impliqués dans de mêmes voies biologiques, nous avons effectué une étude des processus biologiques. Finalement, nous avons effectué l’analyse de 19 exomes de patients Jamaïcains ayant des complications cliniques mineures de l’anémie falciforme. Compte tenu de la taille des cohortes de réplication disponibles, nous n’avons pas les moyens de valider statistiquement les variations identifiées par notre étude. Cependant, nos résultats fournissent de bons gènes candidats pour des études fonctionnelles et pour les réplications futures. Nos résultats suggèrent aussi que le β-hydroxybutyrate en concentration endogène pourraient influencer le taux d’hémoglobine fœtale. De plus, nous montrons que la cartographie-fine des régions associées par des études pan-génomiques peut identifier des signaux d’association additionnels et augmenter la variation héritable expliquée par cette région.

Syndrome du QT long: étude clinique à l’Institut Cardiologique de Montréal et recherche de nouvelles variantes causales par séquençage à haut débit

Le syndrome du QT long congénital (LQTS) est une canalopathie génétique, à l’origine de syncopes et mort subite. Le dépistage génétique identifie des variantes génétiques dans 50-70% des cas, suggérant l’implication d’autres gènes. Nous avons recueilli les caractéristiques des patients avec un LQTS à l’ICM, et recruté 12 patients avec un génotype négatif pour le LQTS pour un séquençage à haut débit des exons afin d’identifier de nouvelles variantes causales. Nous avons développé une approche analytique par étapes : (1) les gènes connus du, (2) les gènes dans des loci identifiés par des études d’association sur le QT, et (3) les gènes montrant la même variante chez plusieurs patients. L’analyse génétique a identifié de nouvelles variantes dans: (1) KCNJ2, ANK2 et AKAP9, et (2) dans NOS1AP. (3) Deux patientes avec des phénotypes semblables présentent la même variante homozygote dans TECRL, un nouveau gène candidat dont le rôle est inconnu.

Études génétiques de familles récessives d’ataxies et de paraplégies spastiques

Au cours des dernières années, la génétique a subi une progression phénoménale suite au développement de nouvelles technologies de séquençage. En effet, le séquençage de l’exome entier chez des familles a permis l’identification de nouveaux gènes impliqués pour plusieurs maladies. La neurologie a d’ailleurs bénéficié de ces avancées et plusieurs gènes ont été mis en évidence comme causatifs pour différents désordres neurologiques. Dans ce travail il sera question de deux désordres du mouvement pour lequel nous avons utilisés des technologies de séquençage traditionnelles, en l’occurrence le séquençage par Sanger, ainsi que de nouvelles technologies pour le séquençage de l’exome entier afin d’identifier de nouveaux gènes causatifs. Le premier désordre du mouvement qui sera décrit est l’ataxie, où ne seront abordées que les ataxies de cause génétiques, à transmission récessive. Le premier chapitre relatera les nouvelles mutations qui ont été trouvées chez des canadiens-français souffrant de l’ataxie de Beauce. Il sera aussi question de nouvelles mutations retrouvées dans deux autres populations, confirmant l’implication du gène SYNE1 dans les cas d’ataxie cérébelleuse à travers le monde. Le second chapitre fera la démonstration qu’il est souhaitable d’utiliser le séquençage de l’exome entier dans le but de poser un diagnostic clinique. En effet, il a été possible de trouver la cause génétique d’une famille comportant deux membres atteints d’atrophie congénitale du cervelet, où le symptôme prédominant est l’ataxie. Le séquençage de l’exome a permis la mise en évidence de mutations dans le gène PMM2, déjà connues pour cause le syndrome des glycoprotéines déficientes en hydrates de carbone. Dans un second temps, il sera question d’un autre désordre du mouvement la paraplégie spastique familiale (PSF). Le chapitre 3 relatera les mutations trouvées dans le gène CYP7B1 dans notre cohorte de patients PSF.

Exploration génomique de la déficience intellectuelle

La déficience intellectuelle (DI) définit un groupe de conditions génétiquement hétérogènes caractérisées par l’apparition de troubles cognitifs précoces chez l’enfant. Elle affecte 1-3% de la population dans les pays industrialisés. La prévalence de la DI est beaucoup plus élevée ailleurs dans le monde, en raison de facteurs sociodémographiques comme le manque de ressources dans le système de santé, la pauvreté et la consanguinité. Des facteurs non-génétiques sont mis en cause dans l’étiologie de la DI ; on estime qu’environ 25% des cas de DI sont d’origine génétique. Traditionnellement, les bases moléculaires de la DI ont été investiguées par des analyses cytogénétiques, les approches de cartographie génétique et le séquençage de gènes candidats ; ces techniques de génétiques classiques sont encore mises à rude épreuve dans l’analyse de maladies complexes comme la DI. La DI liée à l’X a été particulièrement étudiée, avec plus d’une centaine de gènes identifiés uniquement sur le chromosome X. Des mutations hétérozygotes composites sont mises en évidence dans la DI autosomique, dans le contexte d’unions non-consanguines. L’occurrence de ce type de mutations est rare, chez des individus non-apparentés, de sorte que les mutations dominantes de novo sont plus courantes. Des mutations homozygotes sont attendues dans les populations consanguines ou marquées par un effet fondateur. En fait, les bases moléculaires de la DI autosomique ont été presqu’exclusivement étudiées dans le contexte de populations avec des forts taux de consanguinité. L’origine de la DI demeure encore inconnue dans environ 60 % des cas diagnostiqués. En l’absence de facteurs environnementaux associés à la DI chez ces individus, il est possible d’envisager que des facteurs génétiques non identifiés entrent en jeu dans ces cas de DI inexpliqués. Dans ce projet de recherche, nous voulions explorer l’origine génétique de la DI, dans vingt familles, où une transmission de la maladie selon un mode autosomique récessif est suspectée. Nous avons mis de l’avant les techniques de séquençage de nouvelle génération, afin de mettre en évidence les déterminants génétiques de la DI, à l’échelle du génome humain. En fait, nous avons priorisé la capture et le séquençage de l’exome; soient la totalité des régions codantes du génome humain et leurs sites d’épissage flanquants. Dans nos analyses, nous avons ciblé les variants qui ne sont pas rapportés trop fréquemment dans différentes bases de données d’individus contrôles, ces mutations rares cadrent mieux avec une condition comme la DI. Nous avons porté une attention particulière aux mutations autosomiques récessives (homozygotes et hétérozygotes composites) ; nous avons confirmé que ces mutations ségréguent avec une transmission récessive dans la famille à l’étude. Nous avons identifié des mutations dans des gènes pouvant être à l’origine de la DI, dans certaines des familles analysées ; nous avons validé biologiquement l'impact fonctionnel des mutations dans ces gènes candidats, afin de confirmer leur implication dans la pathophysiologie de la DI. Nous avons élucidé les bases moléculaires de la DI dans huit des familles analysées. Nous avons identifié le second cas de patients avec syndrome de cassure chromosomique de Varsovie, caractérisé par des dysfonctions de l’ARN hélicase DDX11. Nous avons montré qu’une perte de l’activité de TBC1D7, une des sous-unités régulatrice du complexe TSC1-TSC2, est à l’origine de la pathologie dans une famille avec DI et mégalencéphalie. Nous avons mis en évidence des mutations pathogéniques dans le gène ASNS, codant pour l’Asparagine synthétase, chez des patients présentant une microcéphalie congénitale et une forme progressive d’encéphalopathie. Nous avons montré que des dysfonctions dans la protéine mitochondriale MAGMAS sont mises en cause dans une condition caractérisée par un retard prononcé dans le développement associé à une forme sévère de dysplasie squelettique. Nous avons identifié une mutation tronquant dans SPTBN2, codant pour la protéine spinocerebellar ataxia 5, dans une famille avec DI et ataxie cérébelleuse. Nous avons également mis en évidence une mutation dans PIGN, un gène impliqué dans la voie de biosynthèse des ancres de glycosylphosphatidylinositol , pouvant être à l’origine de la maladie chez des individus avec épilepsie et hypotonie. Par ailleurs, nous avons identifié une mutation - perte de fonction dans CLPB, codant pour une protéine chaperonne mitochondriale, dans une famille avec encéphalopathie néonatale, hyperekplexie et acidurie 3-méthylglutaconique. Le potentiel diagnostic des techniques de séquençage de nouvelle génération est indéniable ; ces technologies vont révolutionner l’univers de la génétique moléculaire, en permettant d’explorer les bases génétiques des maladies complexes comme la DI.

Vers une prise en charge améliorée des patients avec glycogénose : nouvelles approches diagnostique et thérapeutique

Les glycogénoses sont des maladies touchant la synthèse ou la dégradation du glycogène. Un diagnostic précoce et une diète optimale, incluant la prévention des hypoglycémies, sont d’une importante cruciale pour le devenir des patients. Les présents travaux visaient la confirmation génétique de glycogénose chez des patients inuits du Nunavik ainsi que l’évaluation de l’impact sur le sommeil et la qualité de vie d’une nouvelle thérapie nutritionnelle, GlycosadeTM, dans une cohorte de patients montréalaise. Par séquençage d’exome, nous avons identifié la mutation causale de glycogénose au Nunavik, permettant un diagnostic précoce et un dépistage des membres de la famille. Nous avons aussi introduit une fécule de maïs à action prolongée et évalué prospectivement le sommeil et la qualité de vie des patients avec glycogénose avant et après ce traitement. Nous avons mis en évidence des troubles de sommeil chez les patients et avons discuté du GlycosadeTM comme d’une option thérapeutique prometteuse.

Genetic Landscape of Joubert syndrome in French Canadians

Le syndrome de Joubert est une maladie récessive caractérisée par une malformation congénitale distincte du tronc cérébral et du cervelet, associée à une anomalie des mouvements oculaires (apraxie oculomotrice), une respiration irrégulière, un retard de développement, et une ataxie à la démarche. Au cours de la dernière décennie, plus de 20 gènes responsables ont été identifiés, tous ayant un rôle important dans la structure et la fonction des cils primaires. Ainsi, le syndrome de Joubert est considéré une ciliopathie. Bien que le Syndrome de Joubert ait été décrit pour la première fois dans une famille canadienne-française en 1969, le(s) gène(s) causal demeurait inconnu dans presque tous les cas de syndrome de Joubert recensés en 2010 dans la population canadienne-française, soit début de mon projet doctoral. Nous avons identifié un total de 43 individus canadiens-français (35 familles) atteints du syndrome de Joubert. Il y avait un regroupement de familles dans la région du Bas-Saint-Laurent de la province de Québec, suggérant la présence d'un effet fondateur. L’objectif de ce projet était de caractériser la génétique du syndrome de Joubert dans la population canadienne-française. Notre hypothèse était qu’il existait un effet fondateur impliquant au moins un nouveau gène JBTS. Ainsi, dans un premier temps, nous avons utilisé une approche de cartographie par homozygotie. Cependant, nous n’avons pas identifié de région d’homozygotie partagée parmi les individus atteints, suggérant la présence d’une hétérogénéité génétique ou allélique. Nous avons donc utilisé le séquençage exomique chez nos patients, ce qui représente une approche plus puissante pour l’étude de conditions génétiquement hétérogènes. Nos travaux ont permis l’identification de deux nouveaux gènes responsables du syndrome de Joubert: C5orf42 et TMEM231. Bien que la localisation cellulaire et la fonction de C5orf42 soient inconnus au moment de cette découverte, nos résultats génétiques combinés avec des études ultérieures ont établi un rôle important de C5orf42 dans la structure et la fonction ciliaire, en particulier dans la zone de transition, qui est une zone de transition entre le cil et le reste de la cellule. TMEM231 avait déjà un rôle établi dans la zone de transition ciliaire et son interaction avec d’autres protéines impliquées dans le syndrome de Joubert était connu. Nos études ont également identifié des variants rares délétères chez un patient JBTS dans le gène ciliaire CEP104. Nous proposons donc CEP104 comme un gène candidat JBTS. Nous avons identifié des mutations causales dans 10 gènes, y compris des mutations dans CC2D2A dans 9 familles et NPHP1 dans 3 familles. Au total, nous avons identifié les mutations causales définitives chez 32 des 35 familles étudiées (91% des cas). Nous avons documenté un effet fondateur complexe dans la population canadienne-française avec de multiples mutations récurrentes dans quatre gènes différents (C5orf42, CC2D2A, TMEM231, NPHP1). Au début de ce projet de recherche, l’étiologie génétique était inconnue chez les 35 familles touchées du syndrome de Joubert. Maintenant, un diagnostique moléculaire définitif est identifié chez 32 familles, et probable chez les 3 autres. Nos travaux ont abouti à la caractérisation génétique du syndrome de Joubert dans la population canadienne-française grâce au séquençage exomique, et révèlent la présence d'un effet fondateur complexe avec une l'hétérogénéité allélique et intralocus importante. Ces découvertes ont éclairé la physiologie de cette maladie. Finalement, l’identification des gènes responsables ouvre de nouvelles perspectives diagnostiques ante-natales, et de conseils génétique, très précieuses pour les familles.

Bases moléculaires et cellulaires d’un trouble neurodéveloppemental causé par l’haploinsuffisance de SYNGAP1.

La déficience intellectuelle est la cause d’handicap la plus fréquente chez l’enfant. De nombreuses évidences convergent vers l’idée selon laquelle des altérations dans les gènes synaptiques puissent expliquer une fraction significative des affections neurodéveloppementales telles que la déficience intellectuelle ou encore l’autisme. Jusqu’à récemment, la majorité des mutations associées à la déficience intellectuelle a été liée au chromosome X ou à la transmission autosomique récessive. D’un autre côté, plusieurs études récentes suggèrent que des mutations de novo dans des gènes à transmission autosomique dominante, requis dans les processus de la plasticité synaptique peuvent être à la source d’une importante fraction des cas de déficience intellectuelle non syndromique. Par des techniques permettant la capture de l’exome et le séquençage de l’ADN génomique, notre laboratoire a précédemment reporté les premières mutations pathogéniques dans le gène à transmission autosomique dominante SYNGAP1. Ces dernières ont été associées à des troubles comportementaux tels que la déficience intellectuelle, l’inattention, des problèmes d’humeur, d’impulsivité et d’agressions physiques. D’autres patients sont diagnostiqués avec des troubles autistiques et/ou des formes particulières d’épilepsie généralisée. Chez la souris, le knock-out constitutif de Syngap1 (souris Syngap1+/-) résulte en des déficits comme l’hyperactivité locomotrice, une réduction du comportement associée à l’anxiété, une augmentation du réflexe de sursaut, une propension à l’isolation, des problèmes dans le conditionnement à la peur, des troubles dans les mémoires de travail, de référence et social. Ainsi, la souris Syngap1+/- représente un modèle approprié pour l’étude des effets délétères causés par l’haploinsuffisance de SYNGAP1 sur le développement de circuits neuronaux. D’autre part, il est de première importance de statuer si les mutations humaines aboutissent à l’haploinsuffisance de la protéine. SYNGAP1 encode pour une protéine à activité GTPase pour Ras. Son haploinsuffisance entraîne l’augmentation des niveaux d’activité de Ras, de phosphorylation de ERK, cause une morphogenèse anormale des épines dendritiques et un excès dans la concentration des récepteurs AMPA à la membrane postsynaptique des neurones excitateurs. Plusieurs études suggèrent que l’augmentation précoce de l’insertion des récepteurs AMPA au sein des synapses glutamatergiques contribue à certains phénotypes observés chez la souris Syngap1+/-. En revanche, les conséquences de l’haploinsuffisance de SYNGAP1 sur les circuits neuronaux GABAergiques restent inconnues. Les enjeux de mon projet de PhD sont: 1) d’identifier l’impact de mutations humaines dans la fonction de SYNGAP1; 2) de déterminer si SYNGAP1 contribue au développement et à la fonction des circuits GABAergiques; 3) de révéler comment l’haploinsuffisance de Syngap1 restreinte aux circuits GABAergiques affecte le comportement et la cognition. Nous avons publié les premières mutations humaines de type faux-sens dans le gène SYNGAP1 (c.1084T>C [p.W362R]; c.1685C>T [p.P562L]) ainsi que deux nouvelles mutations tronquantes (c.2212_2213del [p.S738X]; c.283dupC [p.H95PfsX5]). Ces dernières sont toutes de novo à l’exception de c.283dupC, héritée d’un père mosaïque pour la même mutation. Dans cette étude, nous avons confirmé que les patients pourvus de mutations dans SYNGAP1 présentent, entre autre, des phénotypes associés à des troubles comportementaux relatifs à la déficience intellectuelle. En culture organotypique, la transfection biolistique de l’ADNc de Syngap1 wild-type dans des cellules pyramidales corticales réduit significativement les niveaux de pERK, en fonction de l’activité neuronale. Au contraire les constructions plasmidiques exprimant les mutations W362R, P562L, ou celle précédemment répertoriée R579X, n’engendre aucun effet significatif sur les niveaux de pERK. Ces résultats suggèrent que ces mutations faux-sens et tronquante résultent en la perte de la fonction de SYNGAP1 ayant fort probablement pour conséquences d’affecter la régulation du développement cérébral. Plusieurs études publiées suggèrent que les déficits cognitifs associés à l’haploinsuffisance de SYNGAP1 peuvent émerger d’altérations dans le développement des neurones excitateurs glutamatergiques. Toutefois, si, et auquel cas, de quelle manière ces mutations affectent le développement des interneurones GABAergiques résultant en un déséquilibre entre l’excitation et l’inhibition et aux déficits cognitifs restent sujet de controverses. Par conséquent, nous avons examiné la contribution de Syngap1 dans le développement des circuits GABAergiques. A cette fin, nous avons généré une souris mutante knockout conditionnelle dans laquelle un allèle de Syngap1 est spécifiquement excisé dans les interneurones GABAergiques issus de l’éminence ganglionnaire médiale (souris Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+). En culture organotypique, nous avons démontré que la réduction de Syngap1 restreinte aux interneurones inhibiteurs résulte en des altérations au niveau de leur arborisation axonale et dans leur densité synaptique. De plus, réalisés sur des coupes de cerveau de souris Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+, les enregistrements des courants inhibiteurs postsynaptiques miniatures (mIPSC) ou encore de ceux évoqués au moyen de l’optogénétique (oIPSC) dévoilent une réduction significative de la neurotransmission inhibitrice corticale. Enfin, nous avons comparé les performances de souris jeunes adultes Syngap1+/-, Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+ à celles de leurs congénères contrôles dans une batterie de tests comportementaux. À l’inverse des souris Syngap1+/-, les souris Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+ ne présentent pas d’hyperactivité locomotrice, ni de comportement associé à l’anxiété. Cependant, elles démontrent des déficits similaires dans la mémoire de travail et de reconnaissance sociale, suggérant que l’haploinsuffisance de Syngap1 restreinte aux interneurones GABAergiques dérivés de l’éminence ganglionnaire médiale récapitule en partie certains des phénotypes cognitifs observés chez la souris Syngap1+/-. Mes travaux de PhD établissent pour la première fois que les mutations humaines dans le gène SYNGAP1 associés à la déficience intellectuelle causent la perte de fonction de la protéine. Mes études dévoilent, également pour la première fois, l’influence significative de ce gène dans la régulation du développement et de la fonction des interneurones. D’admettre l’atteinte des cellules GABAergiques illustre plus réalistement la complexité de la déficience intellectuelle non syndromique causée par l’haploinsuffisance de SYNGAP1. Ainsi, seule une compréhension raffinée de cette condition neurodéveloppementale pourra mener à une approche thérapeutique adéquate.

Investigation du rôle de Myo9b dans la migration des interneurones GABAergiques corticaux

Les encéphalopathies épileptogènes sont des maladies graves de l’enfance associant une épilepsie, souvent réfractaire, et un retard de développement. Les mécanismes sous-tendant ces maladies sont peu connus. Cependant, nous postulons que ces épilepsies puissent être causées par une dysfonction du réseau inhibiteur. En effet, des défauts de migration ou de maturation des interneurones GABAergiques (INs) corticaux induisent l’épilepsie, tant chez l’humain que chez la souris. Dans le but d’étudier les causes génétiques des encéphalopathies épileptogènes sporadiques inexpliquées, le laboratoire de la Dre Rossignol a procédé au séquençage d’exome entier d’une cohorte d’enfants atteints. Cela a permis d’identifier, chez un patient, une nouvelle mutation de novo, possiblement pathogène, dans le gène MYO9b. MYO9b est impliqué dans la migration de cellules immunitaires et cancéreuses et est exprimée durant le développement cérébral. Nous émettons l’hypothèse voulant que MYO9b puisse être importante pour la migration des INs corticaux. Les résultats présentés dans ce mémoire démontrent que Myo9b est exprimé dès le stade embryonnaire par les progéniteurs des INs corticaux et que son expression se restreint aux INs dans le cortex mature. De plus, nous démontrons que la répression ex vivo de Myo9b sélectivement dans les INs au sein de tranches corticales organotypiques embryonnaires mène à des défauts morphologiques majeurs de ces cellules en migration. En effet, ces cellules présentent une morphologie multipolaire et des neurites rostraux plus longs et plus complexes. Ces changements morphologiques pourraient avoir un impact majeur sur la migration des INs et ainsi perturber le développement des réseaux inhibiteurs.

Rare variants in LRRK1 and Parkinson's disease

Approximately 20 % of individuals with Parkinson's disease (PD) report a positive family history. Yet, a large portion of causal and disease-modifying variants is still unknown. We used exome sequencing in two affected individuals from a family with late-onset PD to identify 15 potentially causal variants. Segregation analysis and frequency assessment in 862 PD cases and 1,014 ethnically matched controls highlighted variants in EEF1D and LRRK1 as the best candidates. Mutation screening of the coding regions of these genes in 862 cases and 1,014 controls revealed several novel non-synonymous variants in both genes in cases and controls. An in silico multi-model bioinformatics analysis was used to prioritize identified variants in LRRK1 for functional follow- up. However, protein expression, subcellular localization, and cell viability were not affected by the identified variants. Although it has yet to be proven conclusively that variants in LRRK1 are indeed causative of PD, our data strengthen a possible role for LRRK1 in addition to LRRK2 in the genetic underpinnings of PD but, at the same time, highlight the difficulties encountered in the study of rare variants identified by next-generation sequencing in diseases with autosomal dominant or complex patterns of inheritance.

Genome-wide association study of response to cognitive behavioural therapy in children with anxiety disorders

Background Anxiety disorders are common, and cognitive–behavioural therapy (CBT) is a first-line treatment. Candidate gene studies have suggested a genetic basis to treatment response, but findings have been inconsistent. Aims To perform the first genome-wide association study (GWAS) of psychological treatment response in children with anxiety disorders (n = 980). Method Presence and severity of anxiety was assessed using semi-structured interview at baseline, on completion of treatment (post-treatment), and 3 to 12 months after treatment completion (follow-up). DNA was genotyped using the Illumina Human Core Exome-12v1.0 array. Linear mixed models were used to test associations between genetic variants and response (change in symptom severity) immediately post-treatment and at 6-month follow-up. Results No variants passed a genome-wide significance threshold (P = 5×10−8) in either analysis. Four variants met criteria for suggestive significance (P<5×10−6) in association with response post-treatment, and three variants in the 6-month follow-up analysis. Conclusions This is the first genome-wide therapygenetic study. It suggests no common variants of very high effect underlie response to CBT. Future investigations should maximise power to detect single-variant and polygenic effects by using larger, more homogeneous cohorts.