Aplicación de técnicas de PCR en tiempo real a la trazabilidad y autenticidad de los piensos

La trazabilidad y el correcto etiquetado de los piensos y sus ingredientes son factores esenciales para prevenir fraudes y garantizar la seguridad alimentaria. En el ámbito de la lucha contra las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (EETs), la prohibición de la Unión Europea (UE) de alimentar a rumiantes y otros animales de granja con harinas de carne y huesos derivadas de animales, hace necesaria la disponibilidad de metodologías que permitan identificar el origen de las materias primas e ingredientes presentes en los piensos. El método oficial de análisis microscópico tradicionalmente empleado para este fin presenta limitaciones a la hora de diferenciar entre los huesos de mamíferos y de aves, así como para determinar el origen animal específico de las partículas detectadas. Por ello, una de las prioridades de la UE en los últimos años ha sido potenciar la búsqueda y desarrollo de técnicas analíticas alternativas que permitan la detección específica de todos los componentes que integran los piensos. Teniendo en cuenta estos aspectos, en esta Tesis Doctoral se han desarrollado técnicas de PCR en tiempo real con sondas TaqMan® para el control de autenticidad y trazabilidad de ingredientes de origen animal utilizados en la fabricación de los piensos. Las especies objeto de este trabajo han sido: vaca (Bos taurus), oveja (Ovis aries), cabra (Capra hircos), grupo rumiante, cerdo (Sus scrofa), pollo (Gallus gallos), pavo (Meleagris g-allopavo), pato (Anal platyrhynchos x Cairina moschata), oca (Anser anser), grupo aviar, caballo (Equus caballus), conejo (Oryctolagus cuniculus), liebre (Lepus capensis), grupo lepórido (conejo y liebre) y pescados...

Avaliação da viabilidade da aplicação de técnicas biomoleculares na autenticação de produtos alimentares

A carne continua a ser a fonte proteica mais comum no quotidiano das pessoas. Além disso, os produtos cárneos processados apresentam-se como uma mais-valia nas suas vidas agitadas. Este tipo de produto torna difícil a diferenciação das carnes utilizadas na sua confecção, sendo por isso propícios a adulteração. A Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) tem ganho cada vez mais importância nos laboratórios de biologia molecular, revelando-se uma técnica de análise rápida, sensível e altamente específica na identificação de espécies em produtos alimentares. No entanto, vários factores podem interferir com o processo de amplificação, pelo que alguns cuidados devem ser implementados desde a aquisição da amostra a analisar, ao seu acondicionamento e posterior extração de ADN. Existem inúmeros protocolos de extração de ADN, devendo para cada estudo avaliar-se e optar-se pelo mais adequado, considerando a finalidade estabelecida para a amostra extraída. O trabalho laboratorial apresentado nesta dissertação baseou-se em três etapas principais. Inicialmente, avaliaram-se diferentes protocolos de extração de ADN, utilizando-se amostras de carne adquiridas num talho. Entre os protocolos testados, o método de Brometo de Cetil-Trimetil-Amónio (CTAB) modificado foi o que permitiu obter amostras de ADN com maior concentração e elevado nível de pureza. Posteriormente, foram testados e optimizados diferentes protocolos de amplificação, por PCR em tempo real, para a detecção das espécies Bos taurus (vaca), Sus scrofa (porco), Equus caballus (cavalo) e Ovis aries (ovelha). Foram empregues primers específicos de espécie para a detecção de genes mitocondriais e genómicos, consoante cada protocolo. Para o caso concreto do porco, foi efectuada a avaliação de dois protocolos, singleplex com EvaGreen® e tetraplex com AllHorse, para possível aplicação dos mesmos na sua quantificação. Os resultados demonstraram elevada especificidade e sensibilidade das reacções para esta espécie, permitindo a sua detecção até um limite de 0,001 ng e 0,1%, respectivamente. Somente a primeira metodologia se mostrou adequada para quantificação. Por último, as metodologias sugeridas foram aplicadas com sucesso na análise de 4 amostras comerciais de hambúrgueres, tendo-se verificado a consistência da rotulagem em todos os casos, no que concerne a composição em termos de espécies animais. O interesse de trabalhos neste âmbito recai na importância da autenticidade dos rótulos de produtos alimentares, principalmente nos produtos cárneos, para segurança dos consumidores e salvaguarda dos produtores.

Preferência alimentar e identificação das principais fontes de repasto sanguíneo de fêmeas Lutzomyia (Diptera: Psychodidae) em áreas endêmicas para leishmaniose visceral na grande Natal

Leishmaniasis are endemic diseases wild spread in the New and Old World, caused by the flagelated protozoan Leishmania. In the New World, the distribution of different forms of leishmaniasis is mostly in tropical regions. In the State of Rio Grande do Norte, Northeast Brazil, 85% of the captured sand flies fauna is Lutzomyia longipalpis. The distribution of the sand fly vector in the state overlaps with the disease distribution, where the presence of sand flies is associated with presence of animals shelters. The aim of this study was to analyse the blood meal preference of sand flies vector from the genus Lutzomyia spp. in laboratory conditions, to verify the vector life cicle at different temperatures sets and to identify the main blood meal source in endemic areas for visceral leishmaniasis (VL) at peri-urban regions of Natal. Sand flies samples were collected from the municipalities of São Gonçalo do Amarante and Nísia Floresta where female sand flies were grouped for the colony maintenance in the laboratory and for the analysis of the preferred source of sand fly blood meal in natural environment. The prevalence of blood meal preference and oviposition for the females sand flies was 97% for Cavia porcellus with oviposition of 19 eggs/female; 97% for Eqqus caballus with 19 eggs/female; 98% for human blood with 14 eggs/female; 71.3% for Didelphis albiventris with 8.4 eggs/female; 73% for Gallus gallus with 14 eggs/female; 86% for Canis familiaris with 10.3 eggs/female; 81.4% for Galea spixii with 26 eggs/female; 36% for Callithrix jachus with 15 eggs/female; 42.8% for Monodelphis domestica with 0% of oviposition. Female sand flies did not take a blood meal from Felis catus. Sand flies life cycle ranged from 32-40 days, with 21-50 oviposition rates approximately. This study also showed that at 32°C the life cycle had 31 days, at 28° C it had 50 days and at 22°C it increased to 79 days. Adjusting the temperature to 35°C the eggs did not hatch, thus blocking the life cycle. A total of 1540 sand flies were captured, among them, 1.310 were male and 230 were female. Whereas 86% of the sand flies captured were Lu. longipalpis as compared to 10.5% for Lu. evandroi and, 3.2% for L. lenti and 0.3% for Lu whitmani. The ratio between female and male sandfly was approximately 6 males to 1 female. In Nísia Floresta, 50.7% of the collected females took their blood meal from armadillo, 12.8% from human. Among the female sand flies captured in São Gonçalo do Amarante, 80 of them were tested for the Leishmania KDNA infectivity where 5% of them were infected with Leishmania chagasi. Female Lutzomyia spp. showed to have an opportunistic blood meal characteristic. The behavioral parameters seem to have a higher influence in the oviposition when compared to the level of total proteins detected in the host s bloodstream. A higher Lu. longipalpis life cycle viability was observed at 28°C. The increase of temperature dropped the life cycle time, which means that the life cycle is modified by temperature range, source of blood meal and humidity. Lu longipalpis was the most specie found in the inner and peridomiciliar environment. In Nísia Floresta, armadillos were the main source of blood meal for Lutzomyia spp. At São Gonçalo do Amarante, humans were the main source of blood meal due to CDC nets placed inside their houses

Aplicação de microssatélites na crioconservação da diversidade genética do cavalo lusitano

O género Equus teve origem na América do Norte e alguns exemplares migraram para a Eurásia pelo Estreito de Bering, durante a última glaciação. No fim da glaciação, todos os cavalos do continente americano extinguiram-se, mas sobreviveram nas estepes da Eurásia, na Peninsula lbérica e nas florestas da Europa Ocidental e Central. O cavalo Lusitano teve a sua origem em cavalos selvagens e domesticados da Peninsula lbérica, ocorrendo uma mistura com outros animais trazidos por eventos migratórios ocorridos no passado. Os cavalos deste gene pool contribuiram para o desenvolvimento de outras raças modernas na Europa e foram mais tarde introduzidos e dispersos pelo continente Americano, tornando-se fundadores de numerosas raças do novo mundo. A raça Lusitana é uma raça equina autóctone portuguesa, com especial relevancia económica no panorama nacional e internacional. Apesar de não ser uma raça ameaçada, alguns autores defendem que a informação genealógica disponivel (pedigrees) indica que uma utilização excessiva de um reduzido número de reprodutores machos esta a diminuir a diversidade genética da raça, tendo como consequência o aumento da consanguinidade e a diminuição do tamanho efetivo da população para cerca de metade dos valores recomendados pela FAO. No entanto, a anàlise da diversidade genética com base em 16 microssatélites (Marcadores de DNA) a um grupo de 2699 machos da raça Lusitana, nascidos entre 1985 e 2010 e inscritos como reprodutores no Livro Genealógico da raça, revelou um elevado nível de diversidade, idêntico ao encontrado na maioria das raças equinas. Dada a crescente relevância da Crioconservação, omo estratégia complementar para a conservação da diversidade genética in situ, e tendo em conta que não existe criopreservação de oocitos, embriões ou sémen, do cavalo de raça Lusitana em Banco de Genes, selecionaram-se 62 machos reprodutores (garanhões) com interesse genético para a criopreservação de sémen, quer no sentido de preservar a diversidade da raça quer no da salvaguardar em caso de calamidade; ABSTRACT: The genus Equus originated in North America and some exemplary migrated to Eurasia through the Bering Strait during the last glaciation. By the end of the last glaciation, all horses on the American continent became extinct but the genus survived in the steppes of Eurasia, in the Iberian Peninsula and on the Central and West Europe forests. The Lusitano horse breed has its origins in wild and domesticated horses of the Iberian Peninsula, where a mixture with other animals brought by migratory events in the past occurred. The horses of this gene pool contributed to the development of other modern breeds in Europe and were later introduced and spread throughout the American continent, becoming founders of numerous breeds of the New World. The Lusitano horse breed, is a Portuguese native equine breed, with special economic relevance in the national and international scene. Although not being an endangered breed, some authors argue that the available genealogical information (pedigrees) indicates that an excessive use of a limited number of stallions is decreasing the genetic diversity of the breed, resulting in the increase of inbreeding and on the decrease of the effective population size to about half of the values recommended by FAO. However, the analysis of genetic diversity based on 16 microsatellites (DNA markers) in a group of 2699 males of the Lusitano horse breed, born between 1985 and 2010 and registered as Stallions in the Studbook, revealed a high level of diversity similar to that found in the majority of equine breeds. Given the growing relevance of Cryopreservation as a complementary strategy for the conservation of genetic diversity in situ and, taking into consideration the inexistence of criopreservation for oocytes, embryos and semen, in a Gene Bank, for the Lusitano horse breed, 62 breeding males (stallions) with genetic interest for semen cryopreservation were selected in order either to preserve the diversity of the breed or as safeguard in case of calamity.