Étude des événements moléculaires impliqués dans l'activation de la synthéase endothéliale du monoxyde d'azote (eNOS) par le facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF)

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Évolution de la nature et de l'efficacité du facteur hyperpolarisant dérivé de l'endothélium (EDHF) au cours du vieillissement associé ou non à l'hypercholestérolémie dans les artères de résistance du muscle squelettique de la souris

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude des événements moléculaires impliqués dans l'activation de la synthéase endothéliale du monoxyde d'azote (eNOS) par le facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF)

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Évolution de la nature et de l'efficacité du facteur hyperpolarisant dérivé de l'endothélium (EDHF) au cours du vieillissement associé ou non à l'hypercholestérolémie dans les artères de résistance du muscle squelettique de la souris

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Fonctionnalité in vivo d’un endothélium cornéen reconstitué par injection de cellules endothéliales cornéennes dans la chambre antérieure d’un modèle félin

Introduction : Malgré leur état non-prolifératif in vivo, les cellules endothéliales cornéennes (CEC) peuvent être amplifiées in vitro. Leur transplantation subséquente par injection intracamérale pourrait surmonter la pénurie de tissus associée à l’allo-greffe traditionnelle – l’unique traitement définitif disponible pour les endothéliopathies cornéennes. Objectif : Évaluer la fonctionnalité d’un endothélium cornéen reconstitué par injection de CEC dans la chambre antérieure du félin. Méthodes : Les yeux droits de 16 animaux ont été opérés. Huit ont été désendothélialisés centralement avec injection de 2x10e5 (n=4) ou 1x10e6 (n=4) CEC félines supplémentées avec Y-27632 et marquées avec SP-DiOC18(3). Deux ont été désendothélialisés complètement et injectés avec 1x10e6 CEC et Y-27632. Six contrôles ont été désendothélialisés centralement (n=3) ou complètement (n=3) et injectés avec Y-27632 sans CEC. La performance clinique, l’intégrité anatomique, le phénotype fonctionnel et l’expression de SP-DiOC18(3) du nouvel endothélium ont été étudiés. Résultats : Les cornées greffées avec 2x10e5 CEC et les contrôles désendothélialisés centralement ont réussi le mieux cliniquement. Les contrôles désendothélialisés complètement sont restés opaques. L’histopathologie a révélé une monocouche endothéliale fonctionnelle dans les cornées greffées avec 2x10e5 CEC et les contrôles désendothélialisés centralement, une multicouche endothéliale non-fonctionnelle dans les cornées désendothélialisées centralement et greffées avec 1x10e6 CEC, et un endothélium fibrotique non-fonctionnel dans les cornées désendothélialisées complètement. L’expression de SP-DiOC18(3) était rare dans les greffes. Conclusion : La thérapie par injection cellulaire a reconstitué un endothélium partiellement fonctionnel, auquel les CEC injectées n’ont contribué que peu. L’injection de Y-27632 sans CEC a reconstitué l’endothélium le plus sain. Des études additionnelles investiguant l’effet thérapeutique de Y-27632 seul sont justifiées.

Fonctionnalité in vivo d’un endothélium cornéen reconstitué par injection de cellules endothéliales cornéennes dans la chambre antérieure d’un modèle félin

Introduction : Malgré leur état non-prolifératif in vivo, les cellules endothéliales cornéennes (CEC) peuvent être amplifiées in vitro. Leur transplantation subséquente par injection intracamérale pourrait surmonter la pénurie de tissus associée à l’allo-greffe traditionnelle – l’unique traitement définitif disponible pour les endothéliopathies cornéennes. Objectif : Évaluer la fonctionnalité d’un endothélium cornéen reconstitué par injection de CEC dans la chambre antérieure du félin. Méthodes : Les yeux droits de 16 animaux ont été opérés. Huit ont été désendothélialisés centralement avec injection de 2x10e5 (n=4) ou 1x10e6 (n=4) CEC félines supplémentées avec Y-27632 et marquées avec SP-DiOC18(3). Deux ont été désendothélialisés complètement et injectés avec 1x10e6 CEC et Y-27632. Six contrôles ont été désendothélialisés centralement (n=3) ou complètement (n=3) et injectés avec Y-27632 sans CEC. La performance clinique, l’intégrité anatomique, le phénotype fonctionnel et l’expression de SP-DiOC18(3) du nouvel endothélium ont été étudiés. Résultats : Les cornées greffées avec 2x10e5 CEC et les contrôles désendothélialisés centralement ont réussi le mieux cliniquement. Les contrôles désendothélialisés complètement sont restés opaques. L’histopathologie a révélé une monocouche endothéliale fonctionnelle dans les cornées greffées avec 2x10e5 CEC et les contrôles désendothélialisés centralement, une multicouche endothéliale non-fonctionnelle dans les cornées désendothélialisées centralement et greffées avec 1x10e6 CEC, et un endothélium fibrotique non-fonctionnel dans les cornées désendothélialisées complètement. L’expression de SP-DiOC18(3) était rare dans les greffes. Conclusion : La thérapie par injection cellulaire a reconstitué un endothélium partiellement fonctionnel, auquel les CEC injectées n’ont contribué que peu. L’injection de Y-27632 sans CEC a reconstitué l’endothélium le plus sain. Des études additionnelles investiguant l’effet thérapeutique de Y-27632 seul sont justifiées.

HARNESSING iNKT CELLS WITH RECOMBINANT CD1d FUSION PROTEINS TO REDIRECT INNATE AND ADAPTIVE IMMUNITY TO THE TUMOR

Les thérapies du cancer, comme la radiothérapie et la chimiothérapie, sont couramment utilisées mais ont de nombreux effets secondaires. Ces thérapies invasives pour le patient nécessitent d'être améliorées et de nombreuses avancées ont été faites afin d'adapter et de personnaliser le traitement du cancer. L'immunothérapie a pour but de renforcer le système immunitaire du patient et de le rediriger de manière spécifique contre la tumeur. Dans notre projet, nous activons les lymphocytes Invariant Natural Killer T (iNKT) afin de mettre en place une immunothérapie innovatrice contre le cancer. Les cellules iNKT sont une unique sous-population de lymphocytes T qui ont la particularité de réunir les propriétés de l'immunité innée ainsi qu'adaptative. En effet, les cellules iNKT expriment à leur surface des molécules présentes aussi sur les cellules tueuses NK, caractéristique de l'immunité innée, ainsi qu'un récepteur de cellules T (TCR) qui représente l'immunité adaptative. Les cellules iNKT reconnaissent avec leur TCR des antigènes présentés par la molécule CD1d. Les antigènes sont des protéines, des polysaccharides ou des lipides reconnus par les cellules du système immunitaire ou les anticorps pour engendrer une réponse immunitaire. Dans le cas des cellules iNKT, l'alpha-galactosylceramide (αGC) est un antigène lipidique fréquemment utilisé dans les études cliniques comme puissant activateur. Après l'activation des cellules iNKT avec l'αGC, celles-ci produisent abondamment et rapidement des cytokines. Ces cytokines sont des molécules agissant comme des signaux activateurs d'autres cellules du système immunitaire telles que les cellules NK et les lymphocytes T. Cependant, les cellules iNKT deviennent anergiques après un seul traitement avec l'αGC c'est à dire qu'elles ne peuvent plus être réactivées, ce qui limite leur utilisation dans l'immunothérapie du cancer. Dans notre groupe, Stirnemann et al ont publié une molécule recombinante innovante, composée de la molécule CD1d soluble et chargée avec le ligand αGC (αGC/sCD1d). Cette protéine est capable d'activer les cellules iNKT tout en évitant l'anergie. Dans le système immunitaire, les anticorps sont indispensables pour combattre une infection bactérienne ou virale. En effet, les anticorps ont la capacité de reconnaître et lier spécifiquement un antigène et permettent l'élimination de la cellule qui exprime cet antigène. Dans le domaine de l'immunothérapie, les anticorps sont utilisés afin de cibler des antigènes présentés seulement par la tumeur. Ce procédé permet de réduire efficacement les effets secondaires lors du traitement du cancer. Nous avons donc fusionné la protéine recombinante αGC/CD1d à un fragment d'anticorps qui reconnaît un antigène spécifique des cellules tumorales. Dans une étude préclinique, nous avons démontré que la protéine αGC/sCD1d avec un fragment d'anticorps dirigé contre la tumeur engendre une meilleure activation des cellules iNKT et entraîne un effet anti-tumeur prolongé. Cet effet anti-tumeur est augmenté comparé à une protéine αGC/CD1d qui ne cible pas la tumeur. Nous avons aussi montré que l'activation des cellules iNKT avec la protéine αGC/sCD1d-anti-tumeur améliore l'effet anti- tumoral d'un vaccin pour le cancer. Lors d'expériences in vitro, la protéine αGC/sCD1d-anti- tumeur permet aussi d'activer les cellules humaines iNKT et ainsi tuer spécifiquement les cellules tumorales humaines. La protéine αGC/sCD1d-anti-tumeur représente une alternative thérapeutique prometteuse dans l'immunothérapie du cancer. - Les cellules Invariant Natural Killer T (iNKT), dont les effets anti-tumoraux ont été démontrés, sont de puissants activateurs des cellules Natural Killer (NK), des cellules dendritiques (DC) et des lymphocytes T. Cependant, une seule injection du ligand de haute affinité alpha-galactosylceramide (αGC) n'induit une forte activation des cellules iNKT que durant une courte période. Celle-ci est alors suivie d'une longue phase d'anergie, limitant ainsi leur utilisation pour la thérapie. Comme alternative prometteuse, nous avons montré que des injections répétées d'αGC chargé sur une protéine recombinante de CD1d soluble (αGC/sCD1d) chez la souris entraînent une activation prolongée des cellules iNKT, associée à une production continue de cytokine. De plus, le maintien de la réactivité des cellules iNKT permet de prolonger l'activité anti-tumorale lorsque la protéine αGC/sCD1d est fusionnée à un fragment d'anticorps (scFv) dirigé contre la tumeur. L'inhibition de la croissance tumorale n'est optimale que lorsque les souris sont traitées avec la protéine αGC/sCD1d-scFv ciblant la tumeur, la protéine αGC/sCD1d-scFv non-appropriée étant moins efficace. Dans le système humain, les protéines recombinantes αGC/sCD1d-anti-HER2 et anti-CEA sont capables d'activer et de faire proliférer des cellules iNKT à partir de PBMCs issues de donneurs sains. De plus, la protéine αGC/sCD1d-scFv a la capacité d'activer directement des clones iNKT humains en l'absence de cellules présentatrices d'antigènes (CPA), contrairement au ligand αGC libre. Mais surtout, la lyse des cellules tumorales par les iNKT humaines n'est obtenue que lorsqu'elles sont incubées avec la protéine αGC/sCD1d-scFv anti- tumeur. En outre, la redirection de la cytotoxicité des cellules iNKT vers la tumeur est supérieure à celle obtenue avec une stimulation par des CPA chargées avec l'αGC. Afin d'augmenter les effets anti-tumoraux, nous avons exploité la capacité des cellules iNKT à activer l'immunité adaptive. Pour ce faire, nous avons combiné l'immunothérapie NKT/CD1d avec un vaccin anti-tumoral composé d'un peptide OVA. Des effets synergiques ont été obtenus lorsque les traitements avec la protéine αGC/sCD1d-anti-HER2 étaient associés avec le CpG ODN comme adjuvant pour la vaccination avec le peptide OVA. Ces effets ont été observés à travers l'activation de nombreux lymphocytes T CD8+ spécifique de la tumeur, ainsi que par la forte expansion des cellules NK. Les réponses, innée et adaptive, élevées après le traitement avec la protéine αGC/sCD1d-anti-HER2 combinée au vaccin OVA/CpG ODN étaient associées à un fort ralentissement de la croissance des tumeurs B16- OVA-HER2. Cet effet anti-tumoral corrèle avec l'enrichissement des lymphocytes T CD8+ spécifiques observé à la tumeur. Afin d'étendre l'application des protéines αGC/sCD1d et d'améliorer leur efficacité, nous avons développé des fusions CD1d alternatives. Premièrement, une protéine αGC/sCD1d dimérique, qui permet d'augmenter l'avidité de la molécule CD1d pour les cellules iNKT. Dans un deuxième temps, nous avons fusionné la protéine αGC/sCD1d avec un scFv dirigé contre le récepteur 3 du facteur de croissance pour l'endothélium vasculaire (VEGFR-3), afin de cibler l'environnement de la tumeur. Dans l'ensemble, ces résultats démontrent que la thérapie médiée par la protéine recombinante αGC/sCD1d-scFv est une approche prometteuse pour rediriger l'immunité innée et adaptive vers le site tumoral. - Invariant Natural Killer T cells (iNKT) are potent activators of Natural Killer (NK), dendritic cells (DC) and T lymphocytes, and their anti-tumor activities have been well demonstrated. However, a single injection of the high affinity CD1d ligand alpha-galactosylceramide (αGC) leads to a strong but short-lived iNKT cell activation followed by a phase of long-term anergy, limiting the therapeutic use of this ligand. As a promising alternative, we have demonstrated that when αGC is loaded on recombinant soluble CD1d molecules (αGC/sCD1d), repeated injections in mice led to the sustained iNKT cell activation associated with continued cytokine secretion. Importantly, the retained reactivity of iNKT cell led to prolonged antitumor activity when the αGC/sCD1d was fused to an anti-tumor scFv fragments. Optimal inhibition of tumor growth was obtained only when mice were treated with the tumor-targeted αGC/CD1d-scFv fusion, whereas the irrelevant αGC/CD1d-scFv fusion was less efficient. When tested in a human system, the recombinant αGC/sCD1d-anti-HER2 and -anti-CEA fusion proteins were able to expand iNKT cells from PBMCs of healthy donors. Furthermore, the αGC/sCD1d-scFv fusion had the capacity to directly activate human iNKT cells clones without the presence of antigen-presenting cells (APCs), in contrast to the free αGC ligand. Most importantly, tumor cell killing by human iNKT cells was obtained only when co- incubated with the tumor targeted sCD1d-antitumor scFv, and their direct tumor cytotoxicity was superior to the bystander killing obtained with αGC-loaded APCs stimulation. To further enhance the anti-tumor effects, we exploited the ability of iNKT cells to transactivate the adaptive immunity, by combining the NKT/CD1d immunotherapy with a peptide cancer vaccine. Interestingly, synergistic effects were obtained when the αGC/sCD1d- anti-HER2 fusion treatment was combined with CpG ODN as adjuvant for the OVA peptide vaccine, as seen by higher numbers of activated antigen-specific CD8 T cells and NK cells, as compared to each regimen alone. The increased innate and adaptive immune responses upon combined tumor targeted sCD1d-scFv treatment and OVA/CpG vaccine were associated with a strong delay in B16-OVA-HER2 melanoma tumor growth, which correlated with an enrichment of antigen-specific CD8 cells at the tumor site. In order to extend the application of the CD1d fusion, we designed alternative CD1d fusion proteins. First, a dimeric αGC/sCD1d-Fc fusion, which permits to augment the avidity of the CD1d for iNKT cells and second, an αGC/sCD1d fused to an anti vascular endothelial growth factor receptor-3 (VEGFR-3) scFv, in order to target tumor stroma environment. Altogether, these results demonstrate that the iNKT-mediated immunotherapy via recombinant αGC/sCD1d-scFv fusion is a promising approach to redirect the innate and adaptive antitumor immune response to the tumor site.

Vieillissement vasculaire chez des patients athérosclérotiques: Sénescence prématurée des cellules endothéliales?

La dysfonction de l’endothélium vasculaire, associée à une diminution de ses propriétés vasorelaxantes et anti-thrombogéniques, survient avec le vieillissement mais également chez de plus jeunes patients athérosclérotiques présentant plusieurs facteurs de risque cardiovasculaire. Au niveau cellulaire, le vieillissement des cellules endothéliales (CE) mène à un état irréversible de non division cellulaire appelé sénescence. Ces cellules sénescentes présentent des changements spécifiques au niveau de leur morphologie et de l’expression génique, menant à leur dysfonction. La sénescence dite réplicative est déclenchée par le raccourcissement des télomères survenant à chaque division cellulaire, mais peut également être induite prématurément par le stress oxydant (SIPS). L’objectif principal de cette étude est de caractériser la sénescence de CE vasculaires isolées à partir de patients athérosclérotiques, et d’observer l’impact des facteurs de risque sur cette sénescence. Afin de confirmer la contribution des deux principales voies de la sénescence, nous avons par la suite étudié conjointement ou séparément, l’impact d’un traitement chronique avec un antioxydant sur la sénescence de CE, et d’une surexpression de la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT), une enzyme responsable de l’allongement des télomères. Nous avons isolé et cultivé des CE provenant d’artères mammaires internes prélevées lors de pontages coronariens. Selon les études, les cellules ont été infectées ou non avec un lentivirus surexprimant la hTERT, et cultivées in vitro jusqu’à sénescence, en présence ou en absence de l’antioxydant N-acétyl-L-cystéine (NAC). Différents marqueurs des deux principales voies de la sénescence (réplicative ou SIPS) ont été quantifiés. La sénescence cellulaire se développe exponentiellement avec le temps et est associée à une réduction de la viabilité et de la prolifération cellulaires. Chez les patients athérosclérotiques, le vieillissement des CE passe par les deux principales voies de la sénescence : des télomères courts initialement en culture et la durée d’exposition in vivo aux facteurs de risque cardiovasculaire prédisent une apparition prématurée de la sénescence. Toutefois, chez les fumeurs, la sénescence est exclusivement du type SIPS. Ces facteurs de risque cardiovasculaire et principalement l’hypertension, semblent accélèrer le vieillissement biologique et favoriser la dysfonction des CE. Lorsque traitées chroniquement avec le NAC, les CE présentant initialement de moindres dommages cellulaires et moléculaires ainsi qu’une meilleure défense antioxydante développent une sénescence retardée. Lorsque le NAC est combiné à une surexpression de la hTERT, les deux voies de la sénescence sont bloquées et une immortalisation cellulaire est observée. À l’inverse, dans les CE les plus endommagées par les ROS in vivo, le NAC n’a aucun effet sur le développement de la sénescence, la hTERT, seule ou en combinaison avec le NAC, retarde légèrement la sénescence mais aucune immortalisation n’est observée lorsque ces traitements sont combinés. En conclusion, nos études démontrent que l’exposition chronique au stress oxydant associé aux facteurs de risque cardiovasculaire accélère le développement de la sénescence de CE vasculaires, contribuant potentiellement à l’athérogénèse. Dans les cellules de patients athérosclérotiques, il semble exister un seuil de dommages cellulaires et moléculaires subis in vivo au-delà duquel, aucun traitement (antioxydant ou hTERT) ne peut être bénéfique.

Étude comparative de l'anatomie des plaies de greffe de cornée par tomographie de cohérence optique (OCT)

Cette thèse porte sur l’étude de l’anatomie de la cornée après 3 techniques de greffe soient, la greffe totale traditionnelle (GTT) et des techniques de greffe lamellaire postérieur (GLP) telles que la greffe lamellaire endothéliale profonde (DLEK) et la greffe endothélium/membrane de Descemet (EDMG) pour le traitement des maladies de l’endothélium, telles que la dystrophie de Fuchs et de la kératopathie de l’aphaque et du pseudophaque. Dans ce contexte, cette thèse contribue également à démontrer l’utilité de la tomographie de cohérence optique (OCT) pour l’étude de l’anatomie des plaies chirurgicales la cornée post transplantation. Au cours de ce travail nous avons étudié l'anatomie de la DLEK, avant et 1, 6, 12 et 24 mois après la chirurgie. Nous avons utilisé le Stratus OCT (Version 3, Carl Zeiss, Meditec Inc.) pour documenter l’anatomie de la plaie. L'acquisition et la manipulation des images du Stratus OCT, instrument qui à été conçu originalement pour l’étude de la rétine et du nerf optique, ont été adaptées pour l'analyse du segment antérieur de l’oeil. Des images cornéennes centrales verticales et horizontales, ainsi que 4 mesures radiaires perpendiculaires à la plaie à 12, 3, 6 et 9 heures ont été obtenues. Les paramètres suivants ont été étudiés: (1) Les espaces (gap) entre les rebords du disque donneur et ceux du receveur, (2) les dénivelés de surface postérieure (step) entre le les rebords du disque donneur et ceux du receveur, (3) la compression tissulaire, (4) le décollement du greffon, 6) les élévations de la surface antérieure de la cornée et 7) la pachymétrie centrale de la cornée. Les mesures d’épaisseur totale de la cornée ont été comparées et corrélées avec celles obtenues avec un pachymètre à ultra-sons. Des mesures d’acuité visuelle, de réfraction manifeste et de topographie ont aussi été acquises afin d’évaluer les résultats fonctionnels. Enfin, nous avons comparé les données de DLEK à celles obtenues de l’EDMG et de la GTT, afin de caractériser les plaies et de cerner les avantages et inconvénients relatifs à chaque technique chirurgicale. Nos résultats anatomiques ont montré des différences importantes entre les trois techniques chirurgicales. Certains des paramètres étudiés, comme le sep et le gap, ont été plus prononcés dans la GTT que dans la DLEK et complètement absents dans l’EDMG. D’autres, comme la compression tissulaire et le décollement du greffon n’ont été observés que dans la DLEK. Ceci laisse entrevoir que la distorsion de la plaie varie proportionnellement à la profondeur de la découpe stromale du receveur, à partir de la face postérieure de la cornée. Moins la découpe s’avance vers la face antérieure (comme dans l’EDMG), moins elle affecte l’intégrité anatomique de la cornée, le pire cas étant la découpe totale comme dans la GTT. Cependant, tous les paramètres d’apposition postérieure sous-optimale et d’élévation de la surface antérieure (ce dernier observé uniquement dans la GTT) finissent par diminuer avec le temps, évoluant à des degrés variables vers un profil topographique plus semblable à celui d’une cornée normale. Ce processus paraît plus long et plus incomplet dans les cas de GTT à cause du type de plaie, de la présence de sutures et de la durée de la cicatrisation. Les valeurs moyennes d’épaisseur centrale se sont normalisées après la chirurgie. De plus, ces valeurs moyennes obtenues par OCT étaient fortement corrélées à celles obtenues par la pachymétrie à ultra-sons et nous n’avons remarqué aucune différence significative entre les valeurs moyennes des deux techniques de mesure. L’OCT s’est avéré un outil utile pour l’étude de l’anatomie microscopique des plaies chirurgicales. Les résultats d’acuité visuelle, de réfraction et de topographie des techniques de GLP ont montré qu’il existe une récupération visuelle rapide et sans changements significatifs de l’astigmatisme, contrairement à la GTT avec et sans suture. La GLP a permis une meilleure conservation de la morphologie de la cornée, et par conséquence des meilleurs résultats fonctionnels que la greffe de pleine épaisseur. Ceci nous permet d’avancer que la GLP pourrait être la technique chirurgicale à adopter comme traitement pour les maladies de l’endothélium cornéen.

Impact du stress oxydant et de l’athérosclérose sur la fonction vasculaire cérébrale au cours du vieillissement

Dans les neurones et les cellules vasculaires cérébrales, les dérivés réactifs de l’oxygène jouent un double rôle puisqu’ils peuvent avoir à la fois des effets bénéfiques, à faibles concentrations, et des effets délétères, à des concentrations élevées. Chez la souris, la circulation cérébrale se distingue des autres lits vasculaires puisque le peroxyde d’hydrogène (H2O2) est le principal médiateur endothélial relaxant endogène. L’objectif de notre première étude a été de caractériser l’implication physiologique du H2O2 dérivé de la eNOS dans la fonction endothéliale cérébrale de la souris. Nous avons voulu identifier les mécanismes impliqués dans la dilatation induite par l’augmentation de débit intra-luminal (flow-mediated dilation, FMD). La FMD est la réponse à un stimulus physiologique endothélial la plus représentative de la situation in vivo. Nous avons démontré que le H2O2, et non le monoxyde d’azote (NO), dérivant de l’activation de la eNOS cérébrale, est le principal médiateur de la FMD. Cependant, nous connaissons très peu de données sur l’évolution de la voie du H2O2 au cours du vieillissement qu’il soit associé ou non aux facteurs de risque pour les maladies cardiovasculaires. Au cours du vieillissement, au niveau périphérique, les facteurs endothéliaux constricteurs ou dilatateurs évoluent en fonction de l’augmentation de stress oxydant. La présence de facteurs de risque pour les maladies cardiovasculaires, telle que l’hypercholestérolémie, pourrait accentuer l’augmentation du stress oxydant et ainsi accélérer la dysfonction endothéliale. Au niveau cérébral, très peu de données sont disponibles. Dans le cadre de notre deuxième étude, nous avons émis l’hypothèse qu’un débalancement des facteurs endothéliaux pourrait être à l’origine (1) de la dysfonction endothéliale cérébrale observée au cours du vieillissement et (2) de la dysfonction endothéliale précoce qui apparaît en présence d’athérosclérose. Nos résultats ont montré que l’augmentation de stress oxydant associée au vieillissement conduit à une libération endogène accrue de TXA2 qui diminue la voie du H2O2 au niveau cérébral et, par conséquent, réduit la dilatation dépendante de l’endothélium. De plus, la présence d’athérosclérose accélère l’apparition de la dysfonction endothéliale cérébrale. Le rôle clé joué par le stress oxydant a été confirmé par un traitement préventif avec l’antioxydant catéchine qui a permis de renverser tous les effets délétères de l’athérosclérose sur les fonctions endothéliales cérébrales. Finalement, la dysfonction endothéliale cérébrale précoce, associée avec l’athérosclérose, pourrait non seulement augmenter l’incidence de développer des accidents vasculaires cérébraux (AVC) mais aussi induire une diminution du débit sanguin cérébral et, ultimement, affecter les fonctions neuronales. Dans le cadre de notre troisième étude, nous avons émis l’hypothèse que l’augmentation de stress oxydant est associée avec une diminution du débit sanguin cérébral et un déclin subséquent des fonctions cognitives. Nous avons utilisé des souris athérosclérotiques âgées de 3 mois que nous avons soumises, ou pas, à un traitement chronique à la catéchine. Nos travaux montrent qu’un traitement préventif avec la catéchine peut prévenir les effets néfastes de l’athérosclérose sur la FMD, le débit sanguin et le déclin des fonctions cognitives qui est normalement associé au vieillissement. Nos résultats ont permis de distinguer l’effet du vieillissement des effets de l’athérosclérose sur les fonctions vasculaires cérébrales. Le traitement préventif avec la catéchine a eu des effets bénéfiques marqués sur la fonction endothéliale cérébrale, le débit sanguin cérébral et les fonctions cognitives, démontrant le rôle clé de l’environnement redox dans la régulation des fonctions cérébrales.

Cardiologie nucléaire du 21ième siècle : nouveautés et réalités

Les maladies cardio-vasculaires demeurent une cause majeure de mortalité et morbidité dans les sociétés développées. La recherche de déterminants prédictifs d’évènements vasculaires représente toujours un enjeu d’actualité face aux coûts croissants des dépenses reliées aux soins médicaux et à l’élargissement des populations concernées, notamment face à l’occidentalisation des pays émergeants comme l’Inde, le Brésil et la Chine. La cardiologie nucléaire occupe depuis trente ans, une place essentielle dans l’arsenal des méthodes diagnostiques et pronostiques des cardiopathies. De plus, de nouvelles percées permettront de dépister d’une façon plus précoce et précise, la maladie athérosclérotique cardiaque et périphérique chez les populations atteintes ainsi qu’en prévention primaire. Nous présenterons dans cette thèse, deux approches nouvelles de la cardiologie nucléaire. La dysfonction endothéliale est considérée comme le signal pathologique le plus précoce de l’athérosclérose. Les facteurs de risques cardiovasculaires traditionnels atteignent la fonction endothéliale et peuvent initier le processus d’athérosclérose même en l’absence de lésion endothéliale physique. La quantification de la fonction endothéliale coronarienne comporte donc un intérêt certain comme biomarqueur précoce de la maladie coronarienne. La pléthysmographie isotopique, méthodologie développée lors de ce cycle d’étude, permet de quantifier la fonction endothéliale périphérique, cette dernière étant corrélée à la fonction endothéliale coronarienne. Cette méthodologie est démontrée dans le premier manuscrit (Harel et. al., Physiol Meas., 2007). L’utilisation d’un radiomarquage des érythrocytes permet la mesure du flot artériel au niveau du membre supérieur pendant la réalisation d’une hyperémie réactive locale. Cette nouvelle procédure a été validée en comparaison à la pléthysmographie par jauge de contrainte sur une cohorte de 26 patients. Elle a démontré une excellente reproductibilité (coefficient de corrélation intra-classe = 0.89). De plus, la mesure du flot artérielle pendant la réaction hyperémique corrélait avec les mesure réalisées par la méthode de référence (r=0.87). Le deuxième manuscrit expose les bases de la spectroscopie infrarouge comme méthodologie de mesure du flot artériel et quantification de la réaction hyperémique (Harel et. al., Physiol Meas., 2008). Cette étude utilisa un protocole de triples mesures simultanées à l’aide de la pléthysmographie par jauge de contrainte, radio-isotopique et par spectroscopie infrarouge. La technique par spectroscopie fut démontrée précise et reproductible quant à la mesure des flots artériels au niveau de l’avant-bras. Cette nouvelle procédure a présenté des avantages indéniables quant à la diminution d’artéfact et à sa facilité d’utilisation. Le second volet de ma thèse porte sur l’analyse du synchronisme de contraction cardiaque. En effet, plus de 30% des patients recevant une thérapie de resynchronisation ne démontre pas d’amélioration clinique. De plus, ce taux de non-réponse est encore plus élevé lors de l’utilisation de critères morphologiques de réponse à la resynchronisation (réduction du volume télésystolique). Il existe donc un besoin urgent de développer une méthodologie de mesure fiable et précise de la dynamique cardiaque. Le troisième manuscrit expose les bases d’une nouvelle technique radio-isotopique permettant la quantification de la fraction d’éjection du ventricule gauche (Harel et. al. J Nucl Cardiol., 2007). L’étude portant sur 202 patients a démontré une excellente corrélation (r=0.84) avec la méthode de référence (ventriculographie planaire). La comparaison avec le logiciel QBS (Cedar-Sinai) démontrait un écart type du biais inférieur (7.44% vs 9.36%). De plus, le biais dans la mesure ne démontrait pas de corrélation avec la magnitude du paramètre pour notre méthodologie, contrairement au logiciel alterne. Le quatrième manuscrit portait sur la quantification de l’asynchronisme intra-ventriculaire gauche (Harel et. al. J Nucl Cardiol, 2008). Un nouveau paramètre tridimensionnel (CHI: contraction homogeneity index) (médiane 73.8% ; IQ 58.7% - 84.9%) permis d’intégrer les composantes d’amplitude et du synchronisme de la contraction ventriculaire. La validation de ce paramètre fut effectuée par comparaison avec la déviation standard de l’histogramme de phase (SDΦ) (médiane 28.2º ; IQ 17.5º - 46.8º) obtenu par la ventriculographie planaire lors d’une étude portant sur 235 patients. Ces quatre manuscrits, déjà publiés dans la littérature scientifique spécialisée, résument une fraction des travaux de recherche que nous avons effectués durant les trois dernières années. Ces travaux s’inscrivent dans deux axes majeurs de développement de la cardiologie du 21ième siècle.

Rôle de la cyclo-oxygénase-2 constitutive dans la synthèse des prostaglandines et caractérisation de ses relations avec les prostaglandines synthases terminales

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Glycation non enzymatique des protéines endothéliales au cours du diabète

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Implication de l'aldostérone dans les changements hémodynamiques de la grossesse

La grossesse s’accompagne d’importantes modifications hormonales et hémodynamiques. Parmi celles-ci, le système rénine-angiotensine-aldostérone (SRAA) est activé très tôt durant la grossesse. De plus, cette augmentation du SRAA est accompagnée d’élévations du débit cardiaque et du volume plasmatique ainsi que des baisses paradoxales de la pression artérielle et de la résistance vasculaire périphérique. Ceci suggère que la grossesse induit un remaniement des réponses physiologiques normales au SRAA. Une résistance vasculaire à l’action des vasopresseurs est également observée durant la gestation. Ce phénomène serait causé par la modification de la fonction des canaux calciques et potassiques. De plus, il serait possiblement dû à la participation de la Na+/K+-ATPase, par son influence sur le potentiel membranaire des cellules des muscles lisses vasculaires (VSMC). La présence des récepteurs minéralocorticoïdes (MR) dans les VSMC laisse croire que l’aldostérone peut influencer le tonus vasculaire par des effets génomiques et non-génomiques. Compte tenu des connaissances actuelles, nous avons émis l’hypothèse que l’augmentation des taux sériques d’aldostérone durant la grossesse est responsable des changements hémodynamiques observés et que ces effets sont causés par l’activation des MR. Des rates gestantes ont été traitées avec du canrénoate de potassium (20 mg/kg•jr), un antagoniste des MR, durant la dernière semaine de gestation (sur 3). Sur des anneaux aortiques dénudés de leur endothélium, nous avons mesuré les réponses contractiles à la phényléphrine (PhE) et au KCl en présence d’un bloqueur des canaux calciques dépendants du voltage (VDCC), la nifédipine, et d’activateurs des canaux potassiques à large conductance (BKCa) et ceux dépendants de l’ATP (KATP), respectivement le NS-1619 et la cromakalim. Les réponses à la PhE et au KCl sont réduites à partir du 17e jour de gestation et le traitement au canrénoate augmente ces réponses dans tous les groupes. Les modulateurs de canaux ioniques atténuent les réponses à la PhE et au KCl. Cependant, le canrénoate modifie aussi les effets des modulateurs sur les aortes. Aucun effet ou une baisse des réponses est observable chez les rates non gestantes, tandis qu’une hausse de leur effet inhibiteur est notée chez les rates gestantes. Ces effets du canrénoate font croire que l’aldostérone participe à l’adaptation de la réactivité vasculaire durant la grossesse. Par ailleurs, le potentiel membranaire des VSMC pourrait être affecté dans la gestation. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons évalué l’activité de la Na+/K+-ATPase, impliquée dans le contrôle du potentiel membranaire. Nos résultats démontrent que l’activité de la pompe est inhibée à partir du 19e jour de gestation. Cet effet est renversé par le canrénoate. Toutefois, comme le renversement de l’inhibition de la pompe est également présent chez les rates gestantes traitées avec du PST 2238, un antagoniste de l’ouabaïne sur la Na+/K+-ATPase, et que le canrénoate agit également comme agoniste partiel de la pompe, nous croyons que la diminution d’activité associée à la gestation est liée à une inhibition de la Na+/K+-ATPase par des stéroïdes cardiotoniques plutôt qu’à un effet des minéralocorticoïdes. L’augmention d’activité de la pompe liée au canrénoate s’accompagne d’une diminution de l’expression de la sous-unité α1, suggérant que la sous-unité α2 est responsable des variations de contractilité de l’aorte, puisque son expression n’est pas modifiée par le canrénoate. Les effets de la diminution de l’expression de la sous-unité α1, influencée par la signalisation du MR, restent à être déterminés. Néanmoins, nos résultats montrent que les modifications d’activité de la Na+/K+-ATPase influencent l’activité des canaux potassiques et que la pompe pourraient être un des éléments primordiaux dans le contrôle de la réactivité vasculaire durant la grossesse. Comme le canrénoate modifie la réactivité vasculaire, nous voulions déterminer ses impacts sur la pression artérielle. Des rates gestantes ont été traitées avec du canrénoate (20 ou 60 mg/kg•jr) et les paramètres hémodynamiques ont été évalués par radiotélémétrie. Aucune modification de la pression artérielle, du rythme cardiaque et de la pression pulsée ne sont mesurées chez les rates recevant le traitement. Toutefois, des augmentations de l’osmolalité, des taux sériques d’aldostérone et de corticostérone ainsi que de l’activité rénine plasmatique sont observées chez les animaux recevant 60 mg/kg•jr. Le canrénoate bloque donc le rétrocontrôle du SRAA. Par contre, les MR ne sont pas les principaux responsables du contrôle de la pression artérielle durant la grossesse. En conclusion, nous avons démontré que le traitement des rates au canrénoate influence la réactivité vasculaire de l’aorte durant la gestation. Cet effet est causé par la modification de l’activité de certains canaux ioniques (VDCC, BKCa et KATP). De plus, le canrénoate renverse l’inhibition de la Na+/K+-ATPase observée durant la gestation. Finalement, les actions locales de cet antagoniste des MR sur les vaisseaux sanguins ne se répercutent pas sur l’effet systémique global et aucune modification de la pression artérielle n’est observée. D’autres études seront toutefois nécessaires pour déterminer les voies de signalisation par lesquelles l’aldostérone module les réponses des canaux ioniques dans les VSMC.

Conditionnement de l’endothélium de l’artère pulmonaire par thérapie d’inhalation avant la circulation extracorporelle

La circulation extracorporelle (CEC) déclenche une réaction inflammatoire systémique, un dommage d’ischémie-reperfusion (I-R) et une dysfonction de l’endothélium dans la circulation pulmonaire. L’hypertension pulmonaire (HTP) est la conséquence de cette cascade de réactions. Cette HTP augmente le travail du ventricule droit et peut causer sa dysfonction, un sevrage difficile de la CEC et une augmentation des besoins de vasopresseurs après la chirurgie cardiaque. L’administration de milrinone et d’époprosténol inhalés a démontré une réduction de la dysfonction endothéliale dans l’artère pulmonaire. Le but de ce travail est d’évaluer différents types de nébulisateur pour l’administration de la milrinone et d’évaluer l’effet du traitement préventif de la combinaison de milrinone et époprosténol inhalés sur les résultats postopératoires en chirurgie cardiaque. Deux études ont été conduites. Dans la première, trois groupes de porcelets ont été comparés : (1) groupe milrinone avec nébulisateur ultrasonique ; CEC et reperfusion précédées par 2,5 mg de milrinone inhalée, (2) goupe milrinone avec nébulisateur à simple jet ; CEC et reperfusion précédées par 2,5 mg de milrinone inhalée et (3) groupe contrôle ; CEC et reperfusion sans traitement. Durant la procédure, les paramètres hémodynamiques, biochimiques et hématologiques ont été mesurés. Après sacrifice, la relaxation endothélium dépendante de l’artère pulmonaire à l’acétylcholine et à la bradykinine a été étudiée en chambres d’organe. Nous avons noté une amélioration de la relaxation de l’endothélium à la bradykinine et à l’acétylcholine dans le groupe avec inhalation de milrinone avec le nébulisateur ultrasonique. Dans la deuxième étude, une analyse rétrospective de 60 patients à haut risque chirurgical atteints d’HTP et opérés à l’Institut de Cardiologie de Montréal à été effectuée. Deux groupes ont été comparés : (1) 40 patients ayant reçu la combinaison de milrinone et d’époprosténol inhalés avant la CEC (groupe traitement) et (2) 20 patients avec des caractéristiques préopératoires n’ayant reçu aucun traitement inhalé avant la CEC (groupe contrôle). Nous avons observé que les besoins en support pharmacologique vasoactif était réduit à 12 heures et à 24 heures postopératoires dans le groupe traitement. L’utilisation de la nébulisation ultrasonique a un impact favorable sur l’endothélium de l’artère pulmonaire après la CEC lorsque comparée à la nébulisation standard à simple jet. Le traitement préventif des patients atteints d’HTP avec la combinaison de milrinone et d’époprosténol inhalés avant la CEC est associé avec une diminution importante des besoins de support vasoactif aux soins intensifs dans les 24 premières heures après la chirurgie.