Flippase (FLP) recombinase-mediated marker recycling in the dermatophyte Arthroderma vanbreuseghemii.

Biological processes can be elucidated by investigating complex networks of relevant factors and genes. However, this is not possible in species for which dominant selectable markers for genetic studies are unavailable. To overcome the limitation in selectable markers for the dermatophyte Arthroderma vanbreuseghemii (anamorph: Trichophyton mentagrophytes), we adapted the flippase (FLP) recombinase-recombination target (FRT) site-specific recombination system from the yeast Saccharomyces cerevisiae as a selectable marker recycling system for this fungus. Taking into account practical applicability, we designed FLP/FRT modules carrying two FRT sequences as well as the flp gene adapted to the pathogenic yeast Candida albicans (caflp) or a synthetic codon-optimized flp (avflp) gene with neomycin resistance (nptII) cassette for one-step marker excision. Both flp genes were under control of the Trichophyton rubrum copper-repressible promoter (PCTR4). Molecular analyses of resultant transformants showed that only the avflp-harbouring module was functional in A. vanbreuseghemii. Applying this system, we successfully produced the Ku80 recessive mutant strain devoid of any selectable markers. This strain was subsequently used as the recipient for sequential multiple disruptions of secreted metalloprotease (fungalysin) (MEP) or serine protease (SUB) genes, producing mutant strains with double MEP or triple SUB gene deletions. These results confirmed the feasibility of this system for broad-scale genetic manipulation of dermatophytes, advancing our understanding of functions and networks of individual genes in these fungi.

Dihydroisocoumarin from Xyris pterygoblephara active against dermatophyte fungi

The ethanol extract from Xyris pteygoblephara aerial parts was evaluated against five microorganism strains, by the microdilution and agar diffusion methods. Extract fractionation led to the isolation of three compounds, whose structures were assigned by spectrometric data (113 and 2D NMR, IR, MS and UV) as (3R,4R)-(-)-6-methoxy-3,4-dihydro-3-n-pentil-4-acethoxy-1H-2-benzopyran-1-one (1), moronic acid and quercetin. The absolute configuration of I was defined by circular dichroism spectroscopy and comparison with data reported for other dihydroisocoumarins. Assay of 1 (100 mu g/disc) by the agar diffusion method against clinical isolates of the dermatophytes Epidermophyton floccosum (inhibition zone, mm +/- s.d.: 4.5 +/- 0.8), Trichophyton mentagrophytes (4.8 +/- 0.4) and Trichophyton rubrum (10.2 +/- 0.8) revealed similar inhibition zones to the positive control amphotericin B (32 mu g/disc; 5.0 +/- 0.2; 5.0 +/- 0.6 and 8.8 +/- 1.2, respectively). The result corroborates the ethnomedical use of Xyris species to treat dermatitis. (C) 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Dermatophyte-host relationship of a murine model of experimental invasive dermatophytosis

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

The dermatophyte Trichophyton rubrum secretes an EDTA-sensitive alkaline phosphatase on high-phosphate medium

In this communication, we show that the growth of isolate H6 of the dermatophyte Trichophyton rubrum on non-buffered medium and under saturating phosphate conditions is dependent on the initial growth pH, with an apparent optimum at pH 4.0. In addition, irrespective of the initial growth pH, the pH of the medium altered during cultivation reaching values that ranged from 8.3 to 8.9. Furthermore, this isolate synthesized and secreted almost the same levels of an alkaline phosphatase with an apparent optimum pH ranging from 9.0 to 10.0 when grown on both low- and high-phosphate medium. Also, this alkaline phosphatase is activated by Mg2+ and is EDTA-sensitive. On the other hand, the very low levels of the enzyme retained by the mycelium grown on buffered medium at pH 5.0-5.2 suggest that this enzyme is encoded by an alkaline gene, i.e., a gene responsive to ambient pH signaling.

rpb2 is a reliable reference gene for quantitative gene expression analysis in the dermatophyte Trichophyton rubrum

The selection of reference genes used for data normalization to quantify gene expression by real-time PCR amplifications (qRT-PCR) is crucial for the accuracy of this technique. In spite of this, little information regarding such genes for qRT-PCR is available for gene expression analyses in pathogenic fungi. Thus, we investigated the suitability of eight candidate reference genes in isolates of the human dermatophyte Trichophyton rubrum subjected to several environmental challenges, such as drug exposure, interaction with human nail and skin, and heat stress. The stability of these genes was determined by geNorm, NormFinder and Best-Keeper programs. The gene with the most stable expression in the majority of the conditions tested was rpb2 (DNA-dependent RNA polymerase II), which was validated in three T. rubrum strains. Moreover, the combination of rpb2 and chs1 (chitin synthase) genes provided for the most reliable qRT-PCR data normalization in T. rubrum under a broad range of biological conditions. To the best of our knowledge this is the first report on the selection of reference genes for qRT-PCR data normalization in dermatophytes and the results of these studies should permit further analysis of gene expression under several experimental conditions, with improved accuracy and reliability.

Estudo aberto prospectivo de 30 pacientes com onicomicose por Scytalidium spp. tratados com terbinafina oral, ciclopiroxolamina esmalte e onicoabrasão

Onicomicose é um termo geral usado para definir infecção fúngica da unha. Seus agentes podem ser dermatófitos, leveduras ou fungos filamentosos não dermatófitos - FFNDs. Estes são comumente encontrados na natureza como saprófitas do solo e de restos vegetais e patógenos de plantas e têm sido considerados fungos patógenos primários de lesões cutâneas. Não existe até o momento terapêutica padrão para o tratamento de onicomicoses por Scytalidium spp., sendo escassos os dados na literatura pesquisada. Este trabalho tem como objetivo avaliar e comparar a resposta terapêutica a três abordagens diferentes de tratamento combinado para onicomicose por Scytalidium spp., todos associados à onicoabrasão. Foram selecionados 30 pacientes com diagnóstico de onicomicose provocada por Scytalidium spp., divididos em três grupos de dez, recebendo cada um os seguintes tratamentos, além da onicoabrasão: Grupo I: Terbinafina oral e esmalte de ciclopiroxolamina 8%, duas vezes por semana por 12 meses; Grupos II e III: Esmalte de ciclopiroxolamina 8%, duas e 5 vezes por semana, respectivamente, por 12 meses. Os parâmetros de avaliação da eficácia foram clínico e micológico ao término do tratamento e seis meses após. Foram utilizados os critérios de cura total, cura parcial, falha terapêutica aos 12 meses e recidiva/reinfecção no acompanhamento de seis meses. Vinte e cinto pacientes completaram o estudo. Não houve diferença estatística entre os grupos nos diversos parâmetros utilizados para avaliação da resposta terapêutica. A avaliação do resultado terapêutico mostra que ao final de 12 meses de tratamento apenas um paciente preencheu os critérios para cura total, e que 32% dos pacientes de todos os grupos apresentaram cura parcial. Todos os pacientes que completaram o estudo obtiveram melhora clínica, que se manteve no período de acompanhamento. A presença dos fungos na lâmina ungueal foi constante, mesmo com a melhora clínica. Embora não se possa afirmar qual a melhor forma de intervenção entre as três terapêuticas propostas devido ao pequeno número de pacientes do estudo, deduz-se, deste trabalho, que não houve vantagem na administração de terapia sistêmica concomitante. É possível considerar que a terapia tópica exclusiva, seja duas ou cinco vezes por semana, possa constituir opção mais adequada para o tratamento da onicomicose por Scytalidium spp.

Tratamento da Tinea Unguium dos pododáctilos com terbinafina oral administrada de forma intermitente associada à onicoabrasão

A onicomicose é responsável por mais da metade das alterações ungueais, com prevalência em torno de 2-8%. As unhas dos pés são as mais afetadas, devido, principalmente a fungos dermatófitos (tinea unguium). A terbinafina é o único antimicótico fungicida oral e o mais potente agente contra dermatófitos in vitro. Entretanto, existem poucos estudos controlados, randomizados usando a terbinafina não-continua. Nosso objetivo foi comparar a efetividade e a segurança do tratamento da tinea unguium dos pododáctilos utilizando terbinafina oral em dois esquemas posológicos intermitentes diferentes, associado à onicoabrasão. Foram selecionados 41 pacientes com diagnóstico de onicomicose por dermatófitos, divididos em dois grupos (20 e 21 pacientes em cada), recebendo um dos seguintes tratamentos, além da onicoabrasão: Grupo I: Terbinafina oral 250mg/dia, 7 dias a cada mês; Grupo II: Terbinafina oral 500mg/dia, 7 dias a cada dois meses. Ambos os grupos tiveram duração de seis meses. Os parâmetros de avaliação da efetividade foram clínico e micológico ao término do tratamento, após seis meses e após um ano. Foram utilizados os critérios de cura total, cura parcial, melhora clínica, falha terapêutica e recidiva. Trinta e seis pacientes completaram o estudo. Não houve diferença estatística entre os grupos nos diversos parâmetros utilizados para avaliação da resposta terapêutica. A avaliação do resultado terapêutico mostra que ao final de 18 meses de acompanhamento, oito pacientes (44,4%) de cada grupo alcançaram a cura total, e que 5 (27,8%) pacientes do grupo I e 4 (22,2%) do grupo II apresentaram cura parcial. Apenas um paciente de cada grupo permaneceu com a lesão clínica inalterada durante todo o estudo. A presença dos fungos na lâmina ungueal foi sendo reduzida com o passar do estudo, ao final deste, todos os pacientes de ambos os grupos apresentaram a cultura negativa para dermatófitos. Embora o número de pacientes do estudo fosse pequeno, não houve diferença estatisticamente significativa entre os resultados de cada grupo considerando-se os parâmetros clínicos e micológicos analisados. Ambas as posologias foram consideradas seguras, sem efeitos colaterais graves, nem alterações significativas nos exames laboratoriais. Foram alcançadas taxas de cura (total e parcial) significativas nos Grupos I e II (66,6% e 72,2%, respectivamente, aos 18 meses). A cura total (disease free nail) foi obtida em 8 pacientes (44,4%) de cada grupo. O uso intermitente da terbinafina associado à onicoabrasão foi uma alternativa estatisticamente efetiva, segura e de melhor custo-benefício para o tratamento da tinea unguium dos pododáctilos, independente da posologia.

Freqüência e etiologia das dermatomicoses em pacientes atendidos no Hospital Giselda Trigueiro, Natal, RN

Dermatomycoses are fungal infections that attack the skin, hair and nails, in addition to the mucosal and cutaneous-mucosal zones. Objective: Observe the frequency of dermatomycoses, identify etiological agents and establish an association between the results and sex. Age, collection site, time and lesion location. Methods: Between February, 2002 and December, 2004, samples were collected from patients at Giselda Trigueiro Hospital in Natal, Brazil, by lesion scraping and hair removal, following 70% alcohol disinfection, and submitted to direct and culture examination. Results: Of the 817 lesions collected, 325 (39.8%) were fungus positive, with the hair collection site yielding the highest number of positive results (65.8%) and the scalp and hair representing the most frequent lesion sites (65.9%). Negative results occurred mainly in the lower limbs (78.6%). Of the species identified, 55.9% were yeasts, 41.6% dermatophytes and 2.5% Fusarium spp. Non-albicans Candida was the most isolated yeast (43.3%), mainly in females (61.7%) over the age of 40 years (56.4%). T. rubrum was the most isolated dermatophyte (67.9%),notably in males (59.2%) in the 0-20 age group (44.7%). With respect to collection site, 73.9% of the dermatophytes were present in the skin and 61.1% of the yeasts in the nails. When assessing the collection site, the inguinocrural regional was 22.6% positive for dermatophytes, and the nails and hands, 41.8% for yeasts. Conclusions: The results obtained verified that: most of the positive lesions were found in the hair, whereas skin and nail lesions yielded more negative results; T. rubrum was the most isolated dermatophyte and non-albicans candida the most commonly found yeast; positivity was greater in males in the 0-20 year age group at the skin site and in the inguinocrural region, while yeasts were more frequent in females in the over-40 age group at the nail sites

Avaliação in vitro da atividade antifúngica de extratos de plantas e óleo de eucalipto sobre Trichophyton mentagrophytes

O presente estudo teve como objetivo determinar a ação antifúngica de extratos de plantas medicinais e óleo de eucalipto frente ao dermatófito Trichophyton mentagropytes, visando a utilização da fitoterapia no controle. As plantas utilizadas na obtenção dos extratos foram arruda (Ruta graveolens), citronela (Cymbopogon nardus), cravo de defunto (Tagetes minuta), eucalipto (Eucalyptus spp), graviola (Annona muricata), fruta do conde (Annona spp), manga (Mangifera indica), romã (Punica granatum), flores e folhas de primavera (Bougainvillea spectabilis). Verificou-se que uso de 0,5% óleo de eucalipto no combate ao T. mentagropytes foi eficaz, já os extratos de citronela (4%) eucalipto (5%) e romã (8%) atuaram como fungistáticos e os restantes não devem ser usados contra este dermatófito porque não causaram nenhum efeito.

Pothomorphe umbellata: Antifungal activity against strains of Trichophyton rubrum

Trichophyton rubrum is a dermatophyte, which can cause infections in human skin, hair and nail. Pothomorphe umbellata (L.) Miq. (Piperaceae) is a native Brazilian plant, in which phytochemical studies have demonstrated the presence of steroids, 4-nerolidylcatechol, sesquiterpenes and essential oils. The objective of this study was to analyze the in vitro activity of extracts and fractions of P. umbellata on resistant strains of T. rubrum. The microdilution plate method was utilized to test Tr1, H6 and Delta TruMDR2 strains of T rubrum; Delta TruMDR2 strain was obtained from H6 by TruMDR2 gene rupture, which is involved in multiple drugs resistance. The highest antifungal activity to all strains was observed for dichloromethane and hexane fractions of the 70% ethanolic extract which showed minimal inhibitory concentration (MIC) and minimal fungicide concentration (MFC) of 78.13 mu g/mL. This antifungal activity was also obtained by 70% ethanolic extract, which presented MIC and MFC of 78.13 mu g/mL to Delta TruMDR2, whereas the MIC values for Tr1 and H6 were 78.13 and 156.25 mu g/mL, respectively. Our results suggest the potential for future development of new antifungal drugs from P umbellata, especially to strains presenting multiple resistance. (C) 2012 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

Dermatophytosis: association between ABO blood groups and reactivity to the trichophytin

Os autores investigaram a relação entre dermatofitose e grupo sanguíneo ABO através da tipagem sanguínea, identificação do dermatófito isolado e resposta imune celular específica de 40 indivíduos portadores desta micose. Verificaram que o fungo Trichophyton rubrum foi isolado em 54,5% dos pacientes, sendo mais frequente em indivíduos pertencentes ao grupo sanguíneo A. A resposta imune celular, avaliada através do antígeno tricofitina, foi positiva em 25% dos pacientes estudados; a presença de reações imediatas (30 min) foi verificada em 35%. A distribuição dos grupos sanguíneos entre pacientes com dermatofitose e grupo controle foi a seguinte: 47,5% x 36% grupo A, 40% x 50% grupo O, 12,5% x 11% grupo B. Embora os autores tenham encontrado um número maior de pacientes pertencentes ao grupo sanguíneo A e infectados pelo T. rubrum, não obtiveram evidência estatística de que esses indivíduos sejam mais suscetíveis as dermatofitoses.

Tinea capitis: epidemiologia e ecologia dos casos observados entre 1983 e 2003 na Faculdade de Medicina de Botucatu, Estado de São Paulo, Brasil

FUNDAMENTOS: Tinea capitis é importante infecção fúngica de interesse dermatológico e pediátrico. No Brasil sua prevalência é desconhecida, e os agentes causais principais são o Trichophyton tonsurans nas regiões Norte-Nordeste e o Microsporum canis no Sul-Sudeste do país. Conhecimento sobre gênero e espécies mais prevalentes tem importância sanitária e terapêutica. OBJETIVOS: Identificar espécies de dermatófitos, causa de Tinea capitis, em serviço universitário que atende clientela do Sistema Único de Saúde, de procedência urbana e rural, no interior do Estado de São Paulo. MÉTODOS: Amostras de casos clínicos suspeitos de Tinea capitis, procedentes da área de abrangência da Faculdade de Medicina de Botucatu-Unesp, foram investigadas por exame direto e cultivo visando ao diagnóstico e isolamento do agente causal. RESULTADOS: de 1.055 suspeitas, 594 foram confirmadas por exame direto, em 364 (61,1%) isolou-se o agente: M. canis em 88,2%, seguindo-se T. tonsurans (4,7%), T. rubrum (3,3%), M. gypseum (1,9%), T. mentagrophytes (1,6%). O sexo masculino correspondeu a 55,7% dos casos, e a faixa etária entre 0-5 anos predominou com 62,6% (p < 0,05). CONCLUSÕES: A prevalência detectada do M. canis superou o esperado para a Região Sudeste do Brasil. A freqüência de 88,2% pode estar influenciada por pacientes procedentes da zona rural. Esse dado deve ser considerado quando de decisão terapêutica.

The use of high frequency waves to treat onychomycosis-preliminary communication of three cases

The research evaluated the efficacy of high frequency waves in the treatment of onychomycosis in three patients during twelve months through the clinical examination of nails and also through mycological examination. The causative agent of the mycosis, in the three patients, was the dermatophyte Trichophyton rubrum and after application of high frequency, it was possible to notice a great improvement in the appearance of nails and also growth inhibition in culture despite the fact that the mycological examination remained positive. The preliminary study of the three cases demonstrated that the fungistatic activity of high frequency waves is a promising method to be used in combination with conventional drugs.