Análise do desempenho da técnica de clonagem celular por micromanipulação versus diluição limitante

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Clonagem e expressão de fragmentos funcionais(scFv) de anticorpo contra o Parvovírus canino-2 com a técnica da Phage display

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FMVZ

Biologia do gene pheA de Mycobacterium tuberculosis : clonagem, seqüenciamento e superexpressão do seu produto - a proteína prefenato desidratase

A Tuberculose (TB) é a principal causa de óbitos entre as doenças infecciosas causadas por um único agente. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) o agente etiológico da TB no homem, o complexo Mycobacterium (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) é responsável por cerca de 8 milhões de novas infecções e 3 milhões de mortes a cada ano no mundo. No começo da década de 80, a reemergência da TB em países em desenvolvimento deve-se à crescente incidência do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), à falta de recursos para o tratamento desta doença e à proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas (MDR-TB). Esta situação criou a necessidade da busca por novos agentes antimicobacterianos capazes de reduzir o tempo de tratamento, melhorar a adesão dos pacientes ao mesmo e ser efetiva contra cepas MDR-TB. A via do chiquimato leva à biossíntese do corismato, o precursor de aminoácidos aromáticos, tirosina, triptofano e fenilalanina. A primeira reação na biossíntese de fenilalanina envolve a conversão de corismato a prefenato, catalisada pela corismato mutase. A segunda reação na biossíntese de fenilalanina é a descarboxilação e desidratação de prefenato a fenilpiruvato, catalisada pela prefenato desidratase. Embora ausente em mamíferos, esta via está presente em bactérias, algas, fungos, plantas e parasitos do Phyllum Apicomplexa. Esta rota é essencial em M. tuberculosis e, portanto, suas enzimas representam alvos potenciais para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. O objetivo deste trabalho foi estudar o gene pheA da linhagem de M. tuberculosis H37Rv e seu produto, a enzima prefenato desidratase Para isso, DNA genômico de M. tuberculosis H37RV foi extraído e o gene pheA foi amplificado pela técnica de PCR, clonado no vetor de expressão pET-23a(+), seqüenciado e superexpresso em células de Escherichia coli BL21(DE3). Os resultados obtidos confirmaram a região predita para o gene pheA, que foi amplificado com sucesso, mostrando 963 pb, sendo que a presença de 10% dimetil sulfoxido (DMSO) mostrou ser essencial para permitir a desnaturação do DNA rico em bases G-C. Análise da seqüência nucleotídica pelo método de Sanger confirmou a identidade do gene clonado e demonstrou que nenhuma mutação foi introduzida pelos passos de PCR e clonagem. A enzima prefenato desidratase foi superexpressa em células de E. coli BL21(DE3) eletroporadas com pET-23a(+)::pheA. Análise por SDS-PAGE mostrou expressão significativa de uma proteína com aproximadamente 33kDa, estando de acordo com a massa molecular esperada para a prefenato desidratase. A proteína recombinante foi superexpressa sem a adição de IPTG, e a presença da proteína pôde ser detectada em todos os intervalos de tempo testados (6, 9 e 24 horas depois da OD600nm alcançar o valor de 0,5). Foi realizado ensaio enzimático com a prefenato desidratase de acordo com Gething et al. (1976) utilizando prefenato de bário como substrato e coeficiente de extinção molar de 17.500 a 320 nm para calcular a concentração de fenilpiruvato. Houve um aumento de 1766 vezes na atividade específica da prefenato desidratase no extrato bruto da proteína recombinante em relação ao controle, no qual o vetor pET23a(+) sem o gene pheA foi introduzido em células de E. coli BL21(DE3).

Clonagem e expressão heteróloga do gene de uma xilanase de Thermoascus aurantiacus em Pichia pastoris

Pós-graduação em Microbiologia - IBILCE

Clonagem e expressão da proteína do core do vírus da hepatite C para o desenvolvimento de métodos aplicados ao diagnóstico viral

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Clonagem e expressão do gene da nucleoproteína do vírus da bronquite infecciosa em sistemas hospedeiros eucarioto (Pichia pastoris) e procarioto (Escherichia coli)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Clonagem e expressão de fragmentos de anticorpos (scFV) contra o vírus da leucemia felina (FeLV) por phage display

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Amplificação, clonagem e sequenciamento de promotores de café (Coffea arabica cv Mundo Novo) específicos de fruto e ubíquos

The Coffee Genome Project made available to the scientific community relevant information that made practical the identification and cloning of important genes, as well as the identification of the major sequences involved on their regulation. The aim of the present study was to amplify, clone and sequence coffee promoters with specific expression patterns. For that, coffee ESTs which known expression profiles were employed. First, the promoter regions of coffee genes showing, respectively, fruitspecific and ubiquitous expression were amplified using the Genome Walking strategy. Amplified sequences were then inserted in the pGEM-Teasy vector (Promega) and sequenced. Once completed the sequencing, an expression cassette was constructed using the binary vector pCAMBIA-1381z (Cambia). These expression cassettes were cloned into Agrobacterium tumefaciens, and transgenic tobacco plants were generated aiming the functional characterization of these promoters

Clonagem de sequências codificantes de citocinas felinas para construção de curva padrão para PCR em tempo real

A quantificação de citocinas felinas possibilita uma avaliação do sistema imune do animal em diferentes doenças, permite também a identificação de diferentes fatores que alteram sua secreção, e colabora na compreensão da patogênese das enfermidades. Em humanos e camundongos essa mensuração é feita principalmente pelo método de ELISA, mas para os felinos há uma menor disponibilidade de kits específicos para determinadas citocinas, e estes possuem um custo elevado. Assim, uma alternativa é utilizar a reação de PCR em tempo real com transcrição reversa (RT-qPCR) para quantificação absoluta dos RNAs mensageiros das citocinas felinas, uma técnica bastante sensível e específica para analisar a expressão desses genes. Com esse intuito, esse trabalho teve como objetivo clonar as sequências gênicas codificantes de citocinas, para construir uma curva padrão para a qPCR. Assim, foi feita extração de RNA de amostras de sangue total de gatos domésticos, e estes foram tratados com DNAse para evitar contaminação por DNA genômico. O cDNA foi sintetizado, e amplificado com os primers específicos para cada fragmento codificante de citocina e o GAPDH felino. Cada amplicon purificado foi inserido em um plasmídeo comercial, e introduzido em bactérias E. coli cepa DH5. Os clones recombinantes foram sequenciados para confirmar a inserção do fragmento no vetor. As curvas padrão da qPCR foram construídas com cada plasmídeo recombinante numa de 106 a 101 cópias por reação. O sequenciamento mostrou que todos os clones eram semelhantes àqueles encontrados no GenBank. A eficiência das amplificações, baseado no slope das curvas padrão foram: 101,3% para GAPDH, 99,1% para IL-1, 83,2% para IL-6, 94,4% para IL-10, 105,5% para IL-12, 83,4% para IFN- e 83,8% para TNF-. O valor de r2 foi de 0,99 em todas as reações. Dessa forma, com a clonagem dos fragmentos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Produção de 1,3-propanodiol por Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli: otimização de meio e clonagem de genes

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Avaliação visceral da técnica sorológica para Leishmaniose visceral e doença de Chagas em animais silvestres e identificação molecular

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Avaliação visceral da técnica sorológica para Leishmaniose visceral e doença de Chagas em animais silvestres e identificação molecular

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Caracterización técnica de los sistemas de explotación ganadera de los pequeños y medianos productores en los municipios de Tisma, Nandaime y Granada (Malacatoya)

El presente trabajo se llevó a cabo con el objetivo de realizar una caracterización de los sistemas de producción ganadera en los Municipios de Tisma, Nandaime y granada (Malacatoya.). El estudio se llevo acabo en 4 fases: Realización de la entrevista a los productores en la que se determino la disponibilidad y uso actual de los recursos en las fincas. La segunda fase consistió en la codificación de los datos obtenidos de las entrevistas asignándoles un número para su análisis por medio del programa computarizado y se creo una base de datos ordenada por municipio y de manera general. La tercera fase comprendió en el análisis estadistico de la información recopilada en las entrevistas ordenándose en programas computarizados Microsoft Word, Excel y para el análisis de los datos se utilizo un programa estadístico SPSS (paquete estadístico para ciencias sociales). La cuata fase consistió en la obtención y discusión de resultados. En cada unó de los aspectos de la entrevista se determino lo siguiente: Característica de la población animal. El 73.6% de los productores encuestados saben leer, un 70.5 %sabe escribir, en cuanto al tiempo de trabajo en la finca el 82.2% trabaja tiempo completo en la finca, en lo referente a la edad del productor el promedio es de 50 años, y el números de personas promedio que viven en la finca es de 6 personas. Característica de la finca: En cuanto a la distribución de la tierra el área total promedio en manzana es de 33.75 manzanas, y el área ganadera en promedio es de 24.36 manzana, en lo referente a la tenencia de la tierra el 53.5% de los productores encuestados poseen tierras propias, un 24.8% tienen una forma de tenencia de la tierra propia y alquilada y % restante tienen otra modalidad de tenencia. En lo referente a la infraestructura el 96.1% de los productores poseen corrales, un 66.7% tienen salitreros, un 51.9% cuentan con comederos, apenas un 10.1% poseen mangas, un 55.8% tienen pilas para abrevar su ganado y apenas un 33.3% cuentan con bodegas. Características de la población animal: En promedio de vaquillas es de 2.55, el promedio de vacas en producción es de 6.31, el promedio de vacas secas es de 3.67 y el promedio de toros es de 0.65.Esto es con respecto a las categorías tomadas en cuentas en esta variable. Hablando del tamaño general del hato en promedio es de 24.58 U.A. Manejo sanitario: Con respecto a la desparasitación del ganado en el ultimo año un 94.6% de los productores ha desparasitado. Referente a los que han vacunado en el ultimo año un 87.4% manifestó haber realizado dicha actividad. En cuanto a cuantas veces vacuna al año un 55% manifestaron hacerlo 2 veces al año, hablando de las enfermedades contra las que vacunan el 59.6 % expresaron vacunar contra ántrax y pierna negra. Manejo productivo el promedio de vacas en ordeños fue de 6.31 U.A, la producción de leche en invierno es de 4.61 Lt/v/día y la producción en verano es de 3.24 Lt/v/día, con lo que respecta a la venta de la leche un 50.39 % de los productores venden la leche al contado y en cuanto a la venta de carne un 87..6% de los productores venden al contado. Manejo reproductivo la edad en que son incorporadas las vaquillas es a los 28.13 meses, el intervalo parto-parto en promedio es de 14.67 meses y el promedio de partos por vacas es de 5.7 partos, el 94.6% de los productores utiliza semental para cubrir las hembras. Manejo alimentario con respecto al tipo de pasto suministrados al ganado un 41.8 % de los productores de dan pasto mejorados y naturales, únicamente un 10.9% de los productores le da concentrado a su ganado, el 38 % les dan suplemento al ganado y un 68.2 % de los encuestados dan rastrojo en la alimentación del ganado. Conocimiento tecnológico referente al uso de registro apenas un 32.6 % lleva registros productivos y reproductivos, con lo que respecta a la organización un 44.2 % forma parte de una organización, apenas un 15.5 % de los productores encuestados reciben financiamiento de instituciones y apenas el 30.2 % del total de productores ha recibido capacitaciones sobre el manejo del ganado.

Establecimiento de técnica de extracción de semen en gallos criollos e inseminación artificial en gallinas criollas en Nejapa - Managua

La inseminación artificial es una técnica que fue desarrollada en la década de los años treinta utilizando el método descrito por Buno\VS y Quinn (1937), consistía en practicarle masajes abdominales y en la cloaca tanto al ave macho como a la hembra Este trabajo de investigación que tiene por título: Establecimiento de técnicas de extracción de semen en gallos criollos e inseminación artificial en gallinas criollas, fue investigado con los tines de realizar la técnica inseminación artificial en gallinas criollas que no se utiliza en nuestro país, y también comprobar que esta tiene resultado positivo. En la investigación se trabajo con 10 gallinas y 2 gallos en donde se divide dos tratamientos: 1er tratamiento monta natural que se utilizaron 5 gallinas y un gallo, 2do tratamiento Inseminación artificial que se utilizaron 5 gallinas y un gallo Los cuales fueron seleccionados con Jónne parámetros establecidos En el tratamiento en la monta natural las gallinas estaban en manejo tradicional y la alimenticio ad-libitum y copulacion natural de gallo. Mientras que en 2do tratamiento para el gallo de la inseminación se le realizo un adiestramiento durante 6 meses para lograr la obtención de semen puro posteriormente inseminar a las gallinas destinadas para el 2do tratamiento. En los resultados de la variable de incubación de cada tratamiento se valoró la diferencia de los tratamiento empleados, mostrando que en el tratamiento 1 por la monta natural (T1 M.N) fue de margen inferior de 75%, donde para el tratamiento 2 de inseminación artificial (T2 LA) un margen de superioridad reflejado en 83% Se encontró un Chi­ cuadrado de 1.7562 no significativo al5% con 1 grado de libertad,-- (filas-uno)*(columnas-1) -­ entendiéndose que las diferencias observadas en el porcentaje de huevos nacidos de cada grupo de tratamiento, así como el porcentaje de huevos no nacidos de cada grupo de tratamiento están en el rango posible de diferencias atribuibles a la casualidad propias de unidades experimentales biológicas empleando un nivel de significación del 5 % También se rellejo el porcentaje de huevos incubables fue para(T1 M.N) 35% y ("12 LA) 31%, para mortalidad embrionaria se determino un 32%(T1 M.N)y el 20% para elpara(T2I.A). En elcomportamiento reproductivo se constato que para (T1 M.N) un margen de 28- 15 huevos y para (T2 LA) un margen de 24- 13 huevos. Concluyendo que la técnica de inseminación attiticial se puede realizar, y puede ser beneficiosa, pero a niveles industriales o en aves de razas debido a que los costos son significativamente costosos no siendo viable para los pequeños productores de gallinas de patio

Determinación de la tasa de degradación ruminal del follaje de Marango (Moringa oleifera) usando la técnica in sacco en vacas reyna, Finca Santa Rosa, Managua, Nicaragua

Se realizó un estudio con los objetivos de determinar la tasa de degradación ruminal y calcular ecuaciones de predicción para las fracciones de materia seca, materia orgánica y proteína bruta del follaje de Moringa oleifera. El ensayo se realizó durante el período de septiembre 2009 - diciembre 2010, en la finca Santa Rosa, Universidad Nacional Agraria, Managua, Nicaragua. Se utilizaron dos vacas Reyna, secas y fistuladas en el rumen, los tratamientos fueron 9 tiempos de incubación: 3, 6, 9, 12, 24, 48, 72, 96 y 120 horas con 4 repeticiones por tratamiento y vaca. Las variables evaluadas fueron: degradación de la materia seca (DMS), materia orgánica (DMO) y proteína bruta (DPB). El diseño que se utilizó fue completamente al azar con arreglo unifactorial donde se consideró el tiempo de incubación como efecto fijo. La degradabilidad de los nutrientes se estimó mediante el modelo de Orskov y McDonald (1979); para conocer el efecto del tiempo sobre la tasa de degradabilidad se realizó análisis de varianza y la prueba honesta de Tukey para conocer las diferencias entre los tiempos de incubación. En los resultados se observó diferencias altamente significativas (P< 0.01) para todas las variables del estudio. La DMS tuvo un rango de 37.43 % a las 48 horas hasta un máximo de 64.85 % a las 120 horas, para la DMO a medida que transcurría el tiempo alcanzó un máximo de 86.7 % a las 120 horas y para la DPB incrementó de 28.18 % a las 24 horas hasta 79.92 % a las 120 horas. Se concluye que la degradabilidad del follaje de Marango lo convierte en un material interesante para la alimentación bovina en sistemas tropicales y que las ecuaciones para predicción de tasas de degradación de las fracciones Materia Seca, Materia Orgánica y Proteína Bruta se ajustan a los procesos fisiológicos de las vacas en estudio.