La Visualisation in vivo des « espèces oxygénées radiculaires» au niveau des cellules ganglionnaires de la rétine.

Titre: La Visualisation in vivo des « espèces oxygénées radiculaires» au niveau des cellules ganglionnaires de la rétine. Le But : Les espèces d'oxygène réactives sont non seulement produites à la suite de la blessure cellulaire, mais servent aussi des molécules faisantes des signes pour une variété de processus critiques, en incluant mitosis et de mort de cellule. Nous avons auparavant dit que la blessure à RGC axons incite un éclatement de superoxyde dans le corps de cellule, probablement de l'origine mitochondrial (Lieven et al, 2006). Nous décrivons maintenant une méthode pour refléter des espèces d'oxygène réactives dans la rétine de l'animal vivant en utilisant un confocal le lisant rapidement du laser ophthalmoscope a appelé la Rétine de Heidelberg Angiograph 2 (HRA2) équipé avec les lasers doubles. La méthodolologie : Après les études préliminaires en utilisant d'autres indicateurs (hydroethidium; HEt) pour les espèces d'oxygène réactives, nous avons essayé de refléter des espèces d'oxygène réactives dans le dans le modèle de vivo l'utilisation 5-(et 6)-chloromethyl-2', 7 '-dichlorodihydrofluorescein diacetate, l'acétyle ester (le CM-H2DCFDA). Un nerf optique de Longs-Evans rats a été écrasé intraorbitalement, en épargnant la circulation retinal. Dans certains rats colliculi supérieur de Longs rats Evans avait été auparavant exposé via craniotomy et surposé avec Gelfoam saturé avec le vert indocyanine (ICG). Aux points de temps variables les animaux ont été injectés intraveineusement ou intravitreally avec HEt ou le CM-H2DCFDA et reflétés avec fluorescein et-ou les filtres d'ICG en utilisant le HRA2. Les résultats: Nous avons démontré le foyer brillant multiple de fluorescence dans la couche de cellule de ganglion quand nous avons rétrogradement étiqueté d'ICG bilatéralement, en indiquant qu'ICG était un colorant rétrogradement transporté qui pourrait être découvert avec le HRA2. Après axotomy et l'injection intravitreal de CM-H2DCFDA, il y avait la fluorescence brillante dans le canal fluorescein dans quelques cellules dans la couche de cellule de ganglion, en accord avec la production d'une ou plusieurs espèces d'oxygène réactives. Les conclusions : RGCs peut être identifié et les niveaux d'espèces d'oxygène réactives mesurés en utilisant une fréquence double confocal Mots-clés : cellules ganglionnaires de la rétine; especes oxygenique radiculaire; la visualisation;

Altérations métaboliques et nature des acides gras : implication dans la différenciation des cellules régénératives du tissu adipeux

Par la sécrétion d’adipokines, le tissu adipeux blanc viscéral présent chez des patients souffrant d’obésité promeut l’installation d’altérations métaboliques telles que l’intolérance au glucose, la résistance à l’insuline et le diabète de type 2. Les complications cardiovasculaires, en particulier l’athérosclérose, sont les principales causes de mortalité chez les patients atteints de diabète de type 2. Il a été démontré que la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux est composée de cellules régénératives dérivées du tissu adipeux (CRTA) et que ces cellules possèdent des caractéristiques des cellules progénitrices stromales (CPS). L’impact de l’intolérance au glucose et du diabète de type 2 sur les adipocytes sont assez bien documentés. Par contre, les conséquences de ces pathologies sur le comportement des CRTA n’ont pas été mesurées d’une façon approfondie. Plus particulièrement, l’impact de ces altérations métaboliques sur le potentiel de différenciation des CRTA en adipocytes et en cellules endothéliales n’a pas été étudié. Ce projet a pour but d’évaluer, dans un modèle murin, l’effet de ces altérations métaboliques sur l’équilibre de la différenciation in vitro des CRTA en adipocytes ou en cellules endothéliales. L’intolérance au glucose et le diabète de type 2 ont été induit chez les souris par la prise de deux diètes riches en acides gras de provenance végétale (DV) ou animale (DA). L’impact de l’origine des acides gras sur la différenciation des CRTA a également été étudié. Pour ce faire, une mise au point de la culture cellulaire des CRTA s’est avérée nécessaire et compte pour une partie de ces travaux de maîtrise. Nos travaux ont démontré en premier lieu, que le DMSO est un agent qui conserve la viabilité et les propriétés progénitrices des CRTA suite à leur congélation. De plus, parmi les matrices testées, le collagène s’est avéré être celle qui conserve le mieux les caractéristiques des progéniteurs et même, qui enrichie la population cellulaire ensemencée en cellules progénitrices. La densité cellulaire des cellules non-adipeuses du tissu adipeux s’avère être significativement plus élevée chez les souris du groupe de la DV comparativement aux souris contrôles. De plus, l’évaluation in vitro de la différenciation adipogénique démontre un potentiel de différenciation plus important pour les CRTA provenant des souris de la DV par rapport au groupe contrôle et à la DA. Cependant, la différenciation en cellules endothéliales est inhibée chez les CRTA de la DV, comparativement à un retard de ce processus pour la DA. Nos travaux suggèrent que le potentiel de différenciation adipogénique et endothéliale des CRTA est affecté par le statut métabolique des souris ainsi que par la nature de la diète. Ces résultats mettent en lumière pour la première fois l’importance d’évaluer le comportement des CRTA en fonction du statut métabolique du donneur, un paramètre pouvant avoir un impact majeur dans l’utilisation des CRTA autologues en thérapie cellulaire pour la réparation de tissus vasculaires chez des patients diabétiques.

Rôle de la synthèse de l'acide rétinoïque dans le contrôle de la prolifération et de la différenciation des cellules épithéliales mammaires

L’acide rétinoïque (AR) est le ligand des récepteurs nucléaires RAR et RXR qui agissent comme facteurs de transcription ligand-inductibles et médient ses effets biologiques. Il est connu que l’AR a des propriétés prodifférenciatrices et antiprolifératives, notamment sur les cellules de l’épithélium mammaire. Une perte de sensibilité de l’AR a toutefois été mise en évidence dans plusieurs lignées cellulaires mammaires cancéreuses, ce qui pourrait faciliter la croissance des tumeurs. Or jusqu’ici cette perte de sensibilité avait été attribuée à des défauts de la voie de signalisation de l’AR, causée par la perte de l’expression des récepteurs à l’AR dans la tumeur, bien que plusieurs lignées de cellules cancéreuses y soient tout de même très sensibles. Peu d’études se sont intéressées au rôle de la voie de synthèse de l’AR dans la transformation des cellules mammaires. En effet, l’AR est synthétisé à partir de la vitamine A, ou rétinol, son précurseur sanguin provenant de la diète. Les cellules de l’épithélium mammaire normales ont la capacité de synthétiser l’AR à partir du rétinol. Nos rapportons pour la première fois que l’épithélium mammaire est probablement le siège de la synthèse et de la signalisation de l’AR. Cela est dû, au moins en partie, à l’expression d’une enzyme de synthèse de l’AR, RALDH3, dans l’épithélium mammaire normal. Dans cette étude, nous démontrons que les cellules cancéreuses de type luminal, qui ont sensibles à l’AR (et qui expriment le récepteur des estrogènes ER, catégorie qui regroupe 75 % des tumeurs diagnostiquées) n’ont au contraire pas la capacité de sythétiser l’AR, probablement en raison d’une faible expression de RALDH3 dans les tumeurs, sous l’effet des estrogènes. Cela pourrait représenter un nouveau mécanisme favorisant la croissance des tumeurs luminales dont les cellules proliférent en présence du rétinol sanguin. RALDH1, une autre enzyme de la voie de synthèse de l’AR, et qui partage 70 % d’identité de séquence avec RALDH3, est un marqueur de tumeurs plus agressives et de la formation de métastase. Nous montrons au contraire, que RALDH3 est un marqueur d’une moindre probabilité de développer des métastases chez les patientes atteintes d’une tumeur luminale. Cela suggère des rôles different pour ces deux enzymes dans la glande mammaire. Nos résultats indiquent que RALDH1 et 3 ont des propriétés enzymatiques très différentes, ce qui est en accord avec cette dernière hypothèse. Nos données suggèrent aussi que RALDH1 et 3 pourraient être des marqueurs de populations distinctes de cellules dans la glande mammaire normale. Nous proposons d’exploiter les diffèrences entre RALDH1 et 3 afin de mettre au point des méthodes de séparation des différentes population de cellules de l’épithélium mammaire ce qui pourrait aider à comprendre le rôle de la synthèse d’AR dans ce tissu.

Rôle de l'autophagie dans la dissémination du VIH-1 par les cellules dendritiques dérivées des monocytes circulants

Les cellules myéloïdes incluant les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques (DCs, dendritic cells) contribuent à la pathogénèse de l’infection à VIH-1 en participant à la dissémination du virus, mais également en représentant des réservoirs viraux potentiels. Leurs fonctions sont exploitées par le VIH-1 afin d’assurer sa propagation à travers l’organisme. Notamment, une infection à VIH-1 est associée à une altération de la présentation antigénique et la perte de lymphocytes T CD4+ spécifiques à des antigènes. L’autophagie est un processus catabolique universel impliqué dans la régulation de la présentation antigénique subséquente à la neutralisation/destruction du pathogène. Des études récentes suggèrent que le VIH-1 altère le mécanisme d’autophagie afin d’assurer sa survie. Le premier volet de ce projet de maîtrise a visé la caractérisation des effets du VIH-1 sur l’autophagie dans les DCs dérivées de monocytes circulants (MDDC, monocyte-derived dendritic cells) et l’identification des stratégies thérapeutiques pour contrecarrer ces effets. Les objectifs spécifiques ont été de : (i) caractériser l’expression de marqueurs de maturation sur des MDDC exposées au VIH-1 in vitro, (ii) quantifier l’expression des protéines liées à la régulation positive (i.e., ATG5, LC3, p62) et négative (i.e., mTOR) de l’autophagie dans les MDDC exposées au VIH, (iii) déterminer le rôle de l’autophagie dans la trans infection du VIH-1 aux lymphocytes T CD4+ et (iv) explorer l’impact de l’autophagie sur la présentation antigénique par les MDDC infectées à VIH-1 in vitro. Nos résultats démontrent qu’une exposition des MDDC au VIH-1 in vitro altère dramatiquement leur maturation et leur habileté à induire la prolifération des cellules T autologues en réponse à Staphylococcus aureus et Cytomegalovirus (CMV) mais pas la réponse induite par Staphylococcal enterotoxin B (SEB). Nous démontrons que l’exposition des MDDC au VIH s’associe à une augmentation de l’expression de la protéine mTOR totale et de sa forme phosphorylée (phospho-mTOR) et de la protéine p62. Le traitement des MDDC à la rapamycine diminue l’expression de mTOR et réduit la capacité de trans infection du VIH-1 par les MDDC, sans toutefois restaurer leur potentiel immunogène. En effet, nous observons que la rapamycine réduit l’expression de CD83 par les MDDC et augmente l’expression de CCR7, indiquant ainsi que l’effet immunosuppresseur documenté de la rapamycine est associé à une défaillance de maturation des MDDC. Le second volet de ce projet de recherche s’est intéressé à la contribution des cellules myéloïdes à la persistance virale chez les sujets infectés par le VIH-1 sous thérapie antirétrovirale. Les objectifs spécifiques ont été : (i) d’évaluer la présence de différentes formes d’ADN viral dans les monocytes circulants de patients infectés par le VIH-1 et (ii) de mesurer l’intégration et la réplication virale dans des macrophages dérivés de monocytes (MDM) de patients infectés sous ART. Nos résultats indiquent que les monocytes portent des formes précoces de transcription virale inverse (ADN du VIH RU5) et que, malgré une charge virale plasmatique indétectable sous ART, les MDM supportent la réplication virale. Ces données très préliminaires apportent des évidences en faveur de la contribution des cellules myéloïdes à la persistance virale sous ART et représentent une ouverture pour un projet de recherche plus complexe dans le futur. En somme, nos résultats démontrent que le VIH-1 altère le potentiel immunogène des MDDC et que la rapamycine peut être employée pour limiter la trans infection des lymphocytes T CD4+ par les MDDC. Néanmoins, l’incapacité de la rapamycine à rétablir le potentiel immunogène des MDDC incite à identifier de nouvelles stratégies manipulant l’autophagie pour une restauration optimale de la compétence immunitaire chez les sujets infectés à VIH-1. Les cellules myéloïdes jouent un rôle primordial dans la dissémination et la persistance virale et doivent donc être ciblées par les stratégies actuelles d’éradication des réservoirs du VIH sous ART.

La cornée humaine, un modèle évitant la transformation tumorale induite par les rayons ultraviolets : étude comparant la fréquence d’induction de dommages à l’ADN, leur l’efficacité de réparation ainsi que la sensibilité à la mort cellulaire induite par les rayons ultraviolets entre la cornée et l’épiderme

Bien qu’ils soient exposés tous deux aux rayons ultraviolets (UVR) solaires, cette exposition génotoxique n’entraîne pas les mêmes conséquences dans l’oeil et la peau. Le rôle des rayons UV dans l’induction et la progression des cancers cutanés est bien démontré. Ces rayons génotoxiques sont absorbés par l’ADN. Ils y induisent ainsi des changements conformationnels pouvant mener à la formation de différents dommages. On retrouve de façon prédominante la liaison de pyrimidines adjacentes en dimères cyclobutyliques de pyrimidines (CPD). Ceux-ci causent les mutations signatures responsables des cancers de la peau induits par les UVR. Cependant, aucune évidence ne démontre l’existence de cancer induit par les UVR dans la cornée. Nous avons donc tenté de découvrir les mécanismes permettant à la cornée d’éviter la transformation tumorale induite par les UVR. L’irradiation d’yeux de lapins aux rayons UVB a permis de prouver la capacité de ces rayons à induire la formation de CPD, et ce, de la cornée jusqu’au cristallin. Par la suite, l’irradiation d’yeux humains aux trois types de rayons UV (UVA, B et C) a permis d’y établir leur patron d’induction de CPD. Nous avons ainsi démontré que l’épithélium cornéen est particulièrement sensible à l’induction de CPD, tous types de rayons UV confondus. Enfin, la comparaison de la quantité de dommages présents dans des échantillons de peaux et de cornées irradiées à la même dose d’UVB a permis de démontrer que l’épithélium cornéen est 3.4 fois plus sensible à l’induction de CPD que l’épiderme. Nous avons par la suite étudié les mécanismes de réponse à ce stress. L’analyse de la viabilité cellulaire à la suite d’irradiations à différentes doses d’UVB a révélé que les cellules de la cornée et de la peau ont la même sensibilité à la mort cellulaire induite par les UVR. Nous avons alors analysé la vitesse de réparation des dommages induits par les UVR. Nos résultats démontrent que les CPD sont réparés 4 fois plus rapidement dans les cellules de la cornée que de la peau. L’analyse des protéines de reconnaissance des dommages a révélé que les cellules de la cornée possèdent plus de protéines DDB2 que les cellules de la peau, et ce, surtout liées à la chromatine. Nous avons alors tenté d’identifier la cause de cette accumulation. Nos analyses révèlent que la cornée possède une moins grande quantité d’ARNm DDB2, mais que la demi-vie de la protéine y est plus longue. Enfin, nos résultats suggèrent que l’accumulation de DDB2 dans les cellules de la cornée est entre autres due à une demi-vie plus longue de la protéine. Cette forte présence de DDB2 dans les cellules de la cornée permettrait un meilleur balayage de l’ADN, faciliterait de ce fait la détection de CPD ainsi que leur réparation et contribuerait donc à la capacité de la cornée à éviter la transformation tumorale induite par les UVR.

Optimisation du transfert de gènes dans la rétine par des vecteurs lentiviraux lors de maladies dégénératives de la rétine

Certaines dégénérescences rétiniennes sont engendrées par des mutations¦génétiques et conduisent à la perte des cellules photosensibles, les¦photorécepteurs (cônes et/ou bâtonnets), et donc à la cécité (Roy et al., 2010).¦La prévalence est de 1/3000 chez les Caucasiens. Les Rétinites Pigmentaires¦(RP) en composent la majorité des cas, suivent l'Amaurose congénitale de¦Leber et la maladie de Stargardt. Il n'y a pas une mutation type associés à une¦maladie mais diverses mutations peuvent aboutir à une dégénérescence de la¦rétine. Tout comme le reste du système nerveux central, la rétine lésée n'a pas¦les capacités de se régénérer. Un objectif du traitement est de ralentir la¦dégénérescence de la rétine dans le but de la stabiliser. La thérapie génique¦constitue actuellement la seule approche thérapeutique à même de traiter les¦dégénérescences rétiniennes d'origine génétique. Elle consiste à utiliser un virus¦modifié, qui n'a plus les capacités de se reproduire, appelé vecteur pour cibler¦certaines cellules afin d'ajouter un gène sain ou d'inhiber un gène malade. Les¦virus associés à l'adénovirus (AAV) et les Lentivirus (LV) sont les 2 principaux¦types de virus utilisés en thérapie génique en ophtalmologie. D'autres vecteurs¦existent, comme les adénovirus et le virus de l'anémie infectieuse équine. Des¦études de thérapie génique effectuées chez l'homme avec le vecteur AAV ont¦démontré une sensible amélioration des fonctions visuelles (acuité visuelle,¦champ visuel, pupillométrie et le déplacement dans un environnement avec une¦lumière tamisée) chez des patients atteints d'Amaurose congénitale de Leber¦(Maguire et al., Ali et al., Hauswirth et al., Bennett et al.). Le vecteur utilisé au¦cours de ce travail est un LV, qui a pour avantage de pouvoir transporter de¦grands gènes. Lorsque ce vecteur est pseudotypé avec une enveloppe VSVG, il¦transduit (transférer un gène qui sera fonctionnel dans la cellule cible) bien¦l'épithélium pigmentaire rétinien (nécessaire à la survie et à la fonction des¦photorécepteurs). Afin de changer le tropisme du vecteur, celui testé dans cette¦étude contient une enveloppe de type Mokola qui cible efficacement les cellules¦gliales du cerveau et donc probablement aussi les cellules de Müller de la rétine.¦Le but à court terme est de transformer génétiquement ces cellules pour leur¦faire sécréter des molécules favorisant la survie des photorécepteurs. Pour¦révéler la cellule ciblée par le vecteur, le gène qui sera exprimé dans les cellules¦transduites code pour la protéine fluorescente verte 2 (GFPII) et n'a pas de¦fonction thérapeutique. Après avoir produit le virus, deux types de souris ont été¦injectées : des souris dépourvues du gène de la rhodopsine appelées Rho -/- et¦des souris sauvages appelées C57BL6. Les souris Rho -/- ont été choisies en¦tant que modèle de dégénérescence rétinienne et les souris C57BL6 en tant que¦comparatif. Les souris Rho -/- et C57BL56 ont été injectées entre le 2ème et le¦3ème mois de vie et sacrifiées 7 jours après. Des coupes histologiques de la rétine¦ont permis de mesurer et comparer pour chaque oeil, les distances de¦transduction du RPE et de la neurorétine (= toute la rétine sauf le RPE). La¦distance sur laquelle le RPE est transduit détermine la taille de la bulle¦d'injection alors que la distance sur laquelle la neurorétine est transduite¦détermine la capacité du vecteur à diffuser dans la rétine. Les résultats montrent¦une expression plus importante de la GFPII dans le RPE que dans la neurorétine¦chez les souris Rho -/- et C57BL6. Les principales cellules transduites au¦niveau de la neurorétine sont, comme attendu, les cellules de Müller. Lorsque¦l'on compare les proportions de neurorétine et de RPE transduites, on constate¦qu'il y a globalement eu une meilleure transduction chez les souris Rho -/-¦que chez les souris C57BL6. Cela signifie que le vecteur est plus efficace pour¦transduire une rétine dégénérée qu'une rétine saine. Pour déterminer quels types¦de cellules exprimaient la GFPII, des anticorps spécifiques de certains types de¦cellules ont été utilisés. Ces résultats sont similaires à ceux d'autres études¦effectuées précédemment, dont celle de Calame et al. en 2011, et tendent à¦prouver que le vecteur lentiviral avec l'enveloppe Mokola et le promoteur EFs¦est idéal pour transduire avec un gène thérapeutique des cellules de Müller dans¦des rétines en dégénérescence.

Etude des propriétés dynamiques de la sécrétion régulée des vésicules glutamatergiques des astrocytes

RESUME GRAND PUBLICLe cerveau est composé de différents types cellulaires, dont les neurones et les astrocytes. Faute de moyens pour les observer, les astrocytes sont très longtemps restés dans l'ombre alors que les neurones, bénéficiant des outils ad hoc pour être stimulés et étudiés, ont fait l'objet de toutes les attentions. Le développement de l'imagerie cellulaire et des outils fluorescents ont permis d'observer ces cellules non électriquement excitables et d'obtenir des informations qui laissent penser que ces cellules sont loin d'être passives et participent activement au fonctionnement cérébral. Cette participation au fonctionnement cérébral se fait en partie par le biais de la libération de substances neuro-actives (appellées gliotransmetteurs) que les astrocytes libèrent à proximité des synapses permettant ainsi de moduler le fonctionnement neuronal. Cette libération de gliotransmetteurs est principalement causée par l'activité neuronale que les astrocytes sont capables de sentir. Néanmoins, nous savons encore peu de chose sur les propriétés précises de la libération des gliotransmetteurs. Comprendre les propriétés spatio-temporelles de cette libération est essentiel pour comprendre le mode de communication de ces cellules et leur implication dans la transmission de l'information cérébrale. En utilisant des outils fluorescents récemment développés et en combinant différentes techniques d'imagerie cellulaire, nous avons pu obtenir des informations très précises sur la libération de ces gliotransmetteurs par les astrocytes. Nous avons ainsi confirmé que cette libération était un processus très rapide et qu'elle était contrôlée par des augmentations de calcium locales et rapides. Nous avons également décrit une organisation complexe de la machinerie supportant la libération des gliotransmetteurs. Cette organisation complexe semble être à la base de la libération extrêmement rapide des gliotransmetteurs. Cette rapidité de libération et cette complexité structurelle semblent indiquer que les astrocytes sont des cellules particulièrement adaptées à une communication rapide et qu'elles peuvent, au même titre que les neurones dont elles seraient les partenaires légitimes, participer à la transmission et à l'intégration de l'information cérébrale.RESUMEDe petites vésicules, les « SLMVs » ou « Synaptic Like MicroVesicles », exprimant des transporteurs vésiculaires du glutamate (VGluTs) et libérant du glutamate par exocytose régulée, ont récemment été décrites dans les astrocytes en culture et in situ. Néanmoins, nous savons peu de chose sur les propriétés précises de la sécrétion de ces SLMVs. Contrairement aux neurones, le couplage stimulussécrétion des astrocytes n'est pas basé sur l'ouverture des canaux calciques membranaires mais nécessite l'intervention de seconds messagers et la libération du calcium par le reticulum endoplasmique (RE). Comprendre les propriétés spatio-temporelles de la sécrétion astrocytaire est essentiel pour comprendre le mode de communication de ces cellules et leur implication dans la transmission de l'information cérébrale. Nous avons utilisé des outils fluorescents récemment développés pour étudier le recyclage des vésicules synaptiques glutamatergiques comme les colorants styryles et la pHluorin afin de pouvoir suivre la sécrétion des SLMVs à l'échelle de la cellule mais également à l'échelle des évènements. L'utilisation combinée de l'épifluorescence et de la fluorescence à onde évanescente nous a permis d'obtenir une résolution temporelle et spatiale sans précédent. Ainsi avons-nous confirmé que la sécrétion régulée des astrocytes était un processus très rapide (de l'ordre de quelques centaines de millisecondes). Nous avons découvert que cette sécrétion est contrôlée par des augmentations de calcium locales et rapides. Nous avons également décrit des compartiments cytosoliques délimités par le RE à proximité de la membrane plasmique et contenant les SLMVs. Cette organisation semble être à la base du couplage rapide entre l'activation des GPCRs et la sécrétion. L'existence de compartiments subcellulaires indépendants permettant de contenir les messagers intracellulaires et de limiter leur diffusion semble compenser de manière efficace la nonexcitabilité électrique des astrocytes. Par ailleurs, l'existence des différents pools de vésicules recrutés séquentiellement et fusionnant selon des modalités distinctes ainsi que l'existence de mécanismes permettant le renouvellement de ces pools lors de la stimulation suggèrent que les astrocytes peuvent faire face à une stimulation soutenue de leur sécrétion. Ces données suggèrent que la libération de gliotransmetteurs par exocytose régulée n'est pas seulement une propriété des astrocytes en culture mais bien le résultat d'une forte spécialisation de ces cellules pour la sécrétion. La rapidité de cette sécrétion donne aux astrocytes toutes les compétences pour pouvoir intervenir de manière active dans la transmission et l'intégration de l'information.ABSTRACTRecently, astrocytic synaptic like microvesicles (SLMVs), that express vesicular glutamate transporters (VGluTs) and are able to release glutamate by Ca2+-dependent regulated exocytosis, have been described both in tissue and in cultured astrocytes. Nevertheless, little is known about the specific properties of regulated secretion in astrocytes. Important differences may exist between astrocytic and neuronal exocytosis, starting from the fact that stimulus-secretion coupling in astrocytes is voltage independent, mediated by G-protein-coupled receptors and the release of Ca2+ from internal stores. Elucidating the spatiotemporal properties of astrocytic exo-endocytosis is, therefore, of primary importance for understanding the mode of communication of these cells and their role in brain signaling. We took advantage of fluorescent tools recently developed for studying recycling of glutamatergic vesicles at synapses like styryl dyes and pHluorin in order to follow exocytosis and endocytosis of SLMVs at the level of the entire cell or at the level of single event. We combined epifluorescence and total internal reflection fluorescence imaging to investigate, with unprecedented temporal and spatial resolution, the events underlying the stimulus-secretion in astrocytes. We confirmed that exo-endocytosis process in astrocytes proceeds with a time course on the millisecond time scale. We discovered that SLMVs exocytosis is controlled by local and fast Ca2+ elevations; indeed submicrometer cytosolic compartments delimited by endoplasmic reticulum (ER) tubuli reaching beneath the plasma membrane and containing SLMVs. Such complex organization seems to support the fast stimulus-secretion coupling reported here. Independent subcellular compartments formed by ER, SLMVs and plasma membrane containing intracellular messengers and limiting their diffusion seem to compensate efficiently the non-electrical excitability of astrocytes. Moreover, the existence of two pools of SLMVs which are sequentially recruited suggests a compensatory mechanisms allowing the refill of SLMVs and supporting exocytosis process over a wide range of multiple stimuli. These data suggest that regulated secretion is not only a feature of cultured astrocytes but results from a strong specialization of these cells. The rapidity of secretion demonstrates that astrocytes are able to actively participate in brain information transmission and processing.

Impact d’une mutation ponctuelle stratégique de la protéine HOXB4 sur son pouvoir de régulation, de prolifération et de différenciation des CSH et des progéniteurs murins

L’expansion des cellules souches hématopoïétiques ex vivo représente une option des plus intéressante afin d’améliorer les greffes de moelle osseuse. Le facteur de transcription HOXB4 semble être le candidat ayant le plus de potentiel jusqu’à présent. Cependant, la très courte demi-vie de la protéine représente un obstacle majeur dans l’élaboration de protocoles cliniques. Par contre, la substitution d’un acide aminé (3 mutations individuelles) dans la partie N-terminale de la protéine augmente de près de 3 fois la stabilité intracellulaire de HOXB4. Nous avons comparé l’activité biologique de ces mutants à celle de HOXB4 natif (« wt ») dans des essais in vitro et in vivo. Nous avons démontré que la surexpression de HOXB4 muté par infection des cellules souches hématopoïétiques n’affectait pas leur pouvoir de reconstitution hématopoïétique à long terme dans des souris transplantées. Par ailleurs, nous avons noté que dans les essais de reconstitution hématopoïétique en compétition et en non compétition, les cellules surexprimant les protéines mutées ont une expansion supérieure in vitro et reconstituent le sang et la rate avec une répartition de cellules lymphoïdes et myéloïdes plus près de souris non-transplantées comparativement aux cellules exprimant HOXB4 « wt ». De plus, les cellules surexprimant la protéine HOXB4 mutée apparaissent beaucoup plus rapidement et en plus grande proportion dans le sang comparativement aux cellules surexprimant la forme native. Une des protéines HOXB4 mutées (1426) ne permet pas l’expansion des progéniteurs myéloïdes immatures (CMP) contrairement à la protéine « wt ». Et finalement, par les études de modulation intracellulaire protéique, nous avons démontré que les comportements des protéines HOXB4 « wt » et mutées envers les cellules souches hématopoïétiques et progéniteurs n’étaient pas complètement dus à un effet de concentration protéique.

Rôle de la protéine ScFRK1 dans le développement du sac embryonnaire et son impact sur le guidage des tubes polliniques

Le gène Solanum chacoense Fertilization-Related Kinase 1 (ScFRK1) code pour une protéine de la famille des MAPKK kinases exprimée spécifiquement dans les ovules. Son transcrit s’accumule principalement dans la zone micropylaire du sac embryonnaire à l’anthèse et diminue rapidement après pollinisation. Ces résultats suggèrent un rôle possible avant ou pendant la fécondation. Bien qu'aucune expression ne soit détectée dans le pollen à maturité, la protéine est cependant présente dans les cellules mères de microspores. Des plantes transgéniques sous-exprimant ScFRK1 ne montrent aucun phénotype au niveau des tissus végétatifs, mais présentent de petits fruits dépourvus de graines. L’étude microscopique du gamétophyte femelle révèle que son développement ne progresse pas au-delà du stade de la mégaspore fonctionnelle et une grande proportion de sacs embryonnaires anormaux est corrélée avec une faible expression de ScFRK1. De plus, la production de pollen viable diminue en fonction de la baisse des niveaux d’expression du gène, ce qui pourrait s’expliquer par un problème au cours de la mitose I. Puisque l’intégrité du sac embryonnaire est essentielle au guidage des tubes polliniques, nous avons conçu un système de guidage semi-in vivo permettant d’évaluer la capacité des ovules du mutant ScFRK1 à les attirer. L’attraction est sévèrement affectée dans de telles conditions, ce qui confirme l'implication des cellules de la zone micropylaire comme source attractive. Notre système nous a également permis de démontrer que le guidage est très spécifique à l’espèce et que cette attraction constitue un mécanisme important favorisant la spéciation et la maintenance des barrières interspécifiques dans la reproduction sexuée des végétaux.

Le diabète maternel influence la morphogenèse rénale et la programmation périnatale

Le diabète maternel est un facteur de risque majeur pour le développement de malformations congénitales. Dans le syndrome de l’embryopathie diabétique, l’exposition prolongée du fœtus à de hautes concentrations ambientes de glucose induit des dommages qui peuvent affecter plusieurs organes, dont les reins. Les malformations rénales sont la cause de près de 40 pourcent des cas d’insuffisance rénale infantile. L’hyperglycémie constitue un environnement utérin adverse qui nuit à la néphrogenèse et peut causer l’agenèse, la dysplasie (aplasie) ou l’hypoplasie rénale. Les mécanismes moléculaires par lesquels les hautes concentrations ambientes de glucose mènent à la dysmorphogenèse et aux malformations demeurent toutefois mal définis. Le diabète maternel prédispose aussi la progéniture au développement d’autres problèmes à l’âge adulte, tels l’hypertension, l’obésité et le diabète de type 2. Ce phénomène appelé ‘programmation périnatale’ a suscité l’intérêt au cours des dernières décennies, mais les mécanismes responsables demeurent mal compris. Mes études doctorales visaient à élucider les mécanismes moléculaires par lesquels le diabète maternel ou un environnement in utero hyperglycémique affecte la néphrogenèse et programme par la suite la progéniture a développer de l’hypertension par des observations in vitro, ex vivo et in vivo. Nous avons utilisé les cellules MK4, des cellules embryonnaires du mésenchyme métanéphrique de souris, pour nos études in vitro et deux lignées de souris transgéniques (Tg) pour nos études ex vivo et in vivo, soient les souris HoxB7-GFP-Tg et Nephrin-CFP-Tg. Les souris HoxB7-GFP-Tg expriment la protéine fluorescente verte (GFP) dans le bourgeon urétérique (UB), sous le contrôle du promoteur HoxB7. Les souris Nephrin-CFP expriment la protéine fluorescente cyan (CFP) dans les glomérules, sous le contrôle du promoteur nephrin spécifique aux podocytes. Nos études in vitro visaient à déterminer si les hautes concentrations de glucose modulent l’expression du gène Pax2 dans les cellules MK4. Les cellules MK4 ont été traitées pendant 24h avec du milieu contenant soit 5mM D-glucose et 20mM D-mannitol ou 25mM D-glucose et avec ou sans antioxydants ou inhibiteurs de p38 MAPK, p44/42 MAPK, PKC et NF-kB. Nos résultats ont démontré que le D-glucose élevé (25mM) augmente la génération des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules MK4 et induit spécifiquement l’expression du gène Pax2. Des analogues du glucose tels le D-mannitol, L-glucose ou le 2-Deoxy-D-glucose n’induisent pas cette augmentation dans les cellules MK4. La stimulation de l’expression du gène Pax2 par le D-glucose dans les cellules MK4 peut être bloquée par des inhibiteurs des ROS et de NF-kB, mais pas par des inhibiteurs de p38 MAPK, p44/42 MAPK ou PKC. Ces résultats indiquent que la stimulation de l’expression du gène Pax2 par les concentrations élevées de glucose est due, au moins en partie, à la génération des ROS et l’activation de la voie de signalisation NF-kB, et non pas via les voies PKC, p38 MAPK et p44/42 MAPK. Nos études ex vivo s’intéressaient aux effets d’un milieu hyperglycémique sur la morphogenèse de la ramification du bourgeon urétérique (UB). Des explants de reins embryonnaires (E12 à E18) ont été prélevés par micro-dissection de femelles HoxB7-GFP gestantes. Les explants ont ensuite été cultivés dans un milieu contenant soit 5mM D-glucose et 20mM D-mannitol ou 25mM D-glucose et avec ou sans antioxydants, catalase ou inhibiteur de PI3K/AKT pour diverses durées. Nos résultats ont démontré que le D-glucose stimule la ramification du UB de manière spécifique, et ce via l’expression du gène Pax2. Cette augmentation de la ramification et de l’expression du gène Pax2 peut être bloquée par des inhibiteurs des ROS et de PI3K/AKT. Ces études ont démontré que les hautes concentrations de glucose altèrent la morphogenèse de la ramification du UB via l’expression de Pax2. L’effet stimulant du glucose semble s’effectuer via la génération des ROS et l’activation de la voie de signalisation Akt. Nos études in vivo visaient à déterminer le rôle fondamental du diabète maternel sur les défauts de morphogenèse rénale chez la progéniture. Dans notre modèle animal, le diabète maternel est induit par le streptozotocin (STZ) chez des femelles HoxB7-GFP gestantes (E13). Les souriceaux ont été étudiés à différents âges (naissants et âgés de une, deux ou trois semaines). Nous avons examiné leurs morphologie rénale, nombre de néphrons, expression génique et les événements apoptotiques lors de cette étude à court terme. La progéniture des mères diabétiques avait un plus faible poids, taille et poids des reins, et possédait des glomérules plus petits et moins de néphrons par rapport à la progéniture des mères contrôles. La dysmorphogenèse rénale observée est peut-être causée par l’augmentation de l’apoptose des cellules dans la région du glomérule. Nos résultats ont montré que les souriceaux nés de mères diabétiques possèdent plus de podocytes apoptotiques et plus de marquage contre la caspase-3 active dans leurs tubules rénaux que la progéniture des mères contrôles. Les souriceaux des mères diabétiques montrent une augmentation de l’expression des composants du système rénine angiotensine (RAS) intrarénal comme l’angiotensinogène et la rénine, ainsi qu’une augmentation des isoformes p50 et p65 de NF-kB. Ces résultats indiquent que le diabète maternel active le RAS intrarénal et induit l’apoptose des glomérules, menant à une altération de la morphogenèse rénale de la progéniture. En conclusion, nos études ont permis de démontrer que le glucose élevé ou l’environnement in utero diabétique altère la morphogenèse du UB, qui résulte en un retard dans la néphrogenèse et produit des reins plus petits. Cet effet est dû, au moins en partie, à la génération des ROS, à l’activation du RAS intrarénal et à la voie NF-kB. Nos études futures se concentreront sur les mécanismes par lesquels le diabète maternel induit la programmation périnatale de l’hypertension chez la progéniture adulte. Cette étude à long terme porte sur trois types de progénitures : adultes nés de mères contrôles, diabétiques ou diabétiques traitées avec insuline pendant la gestation. Nous observerons la pression systolique, la morphologie rénale et l’expression de divers gènes et protéines. Nous voulons de plus déterminer si la présence d’un système antioxydant (catalase) peut protéger la progéniture des effets néfastes des ROS causés par l’environnement in utero hyperglycémique. Les souris Catalase-Tg expriment la catalase spécifiquement dans les tubules proximaux et nous permettrons d’explorer notre hypothèse sur le rôle des ROS dans notre modèle expérimental de diabète maternel.

Étude du rôle de Pax6 dans la gliogenèse

Les astrocytes sont des cellules gliales présentes dans le système nerveux central, qui exercent de nombreuses fonctions physiologiques essentielles et sont impliquées dans la réponse aux lésions et dans plusieurs pathologies du cerveau. Les astrocytes sont générés par les cellules de la glie radiale, les précurseurs communs de la plupart des cellules neuronales et gliales du cerveau, après le début de la production des neurones. Le passage de la neurogenèse à la gliogenèse est le résultat de mécanismes moléculaires complexes induits par des signaux intrinsèques et extrinsèques responsables du changement de propriété des précurseurs et de leur spécification. Le gène Pax6 code pour un facteur de transcription hautement conservé, impliqué dans plusieurs aspects du développement du système nerveux central, tels que la régionalisation et la neurogenèse. Il est exprimé à partir des stades les plus précoces dans les cellules neuroépithéliales (les cellules souches neurales) et dans la glie radiale, dérivant de la différenciation de ces cellules. L’objectif de cette étude est d’analyser le rôle de Pax6 dans la différenciation et dans le développement des astrocytes. À travers l’utilisation d’un modèle murin mutant nul pour Pax6, nous avons obtenu des résultats suggérant que la suppression de ce gène cause l'augmentation de la prolifération et de la capacité d'auto-renouvellement des cellules souches neurales embryonnaires. In vitro, les cellules mutantes prolifèrent de façon aberrante et sous-expriment les gènes p57Kip2, p16Ink4a, p19Arf et p21Cip1, qui inhibent la progression du le cycle cellulaire. De plus, Pax6 promeut la différenciation astrocytaire des cellules souches neurales embryonnaires et est requis pour la différenciation des astrocytes dans la moëlle épinière. Les mutants nuls pour Pax6 meurent après la naissance à cause de graves défauts développementaux dus aux fonctions essentielles de ce gène dans le développement embryonnaire de plusieurs organes. En utilisant un modèle murin conditionnel basé sur le système CRE/ loxP (hGFAP-CRE/ Pax6flox/flox) qui présente l’inactivation de Pax6 dans les cellules de la glie radiale, viable après la naissance, nous avons montré que Pax6 est impliqué dans la maturation et dans le développement post-natal des astrocytes. Le cortex cérébral des souris mutantes conditionnelles ne présente pas d’astrocytes matures à l’âge de 16 jours et une très faible quantité d’astrocytes immatures à l’âge de trois mois, suggérant que Pax6 promeut la différenciation et la maturation des astrocytes. De plus, Pax6 semble jouer un rôle même dans le processus de différenciation et de maturation de cellules gliales rétiniennes. L’étude des gènes et des mécanismes moléculaires impliqués dans la génération des astrocytes est crucial pour mieux comprendre le rôle physiologique et les altérations pathologiques des ces cellules.

Rôles et régulation du PI(4,5)P2 dans le remodelage cortical et la morphogénèse cellulaire en mitose

Doctorat réalisé en cotutelle avec le laboratoire de François Payre au Centre de Biologie du Développement à Toulouse, France (Université de Toulouse III - Paul Sabatier)

Étude des mécanismes associés aux effets bénéfiques de la restriction calorique sur la fonction somatotrope du rat vieillissant.

Dans les cellules somatotropes, la liaison du facteur de libération de l’hormone de croissance (GHRH) à son récepteur (GHRH-R) stimule la synthèse et la sécrétion de l’hormone de croissance (GH) ainsi que la prolifération cellulaire. Chez les mammifères, le vieillissement est caractérisé par une diminution de la sécrétion de GH, liée à une perte de sensibilité des somatotropes au GHRH. Chez le rat âgé, des modifications de niveaux d'ARNm du GHRH-R et une diminution d'affinité et de capacité de liaison du GHRH sont rapportés. Au cours du vieillissement, une augmentation des niveaux de glucose et d’acides gras libres sérique suggère qu’une gluco- ou lipotoxicité puisse contribuer au dysfonctionnement de la fonction somatotrope. À ce jour, la restriction calorique modérée de longue durée (RCMLD) constitue l’intervention la plus efficace pour prévenir ou retarder les détériorations liées à l’âge. Des études ont montré des effets bénéfiques de la RCMLD sur l’axe somatotrope au cours du vieillissement via un maintien des paramètres de liaison du GHRH-R. Compte tenu de l’importance de cet axe, la compréhension des mécanismes menant à la somatopause ainsi que ceux associés aux effets bénéfiques de la RCMLD s’avère importante. Les objectifs principaux de la présente thèse étaient : 1) de déterminer les effets de la RCMLD chez le rat, sur le GHRH-R hypophysaire et la sensibilité des somatotropes au GHRH, 2) d’identifier les mécanismes associés à la somatopause et aux effets bénéfiques de la RCMLD, et 3) de préciser les effets d’une gluco-ou lipotoxicité sur l’axe somatotrope de rats et leur implication dans la somatopause. Des rats de 8 mois ont été soumis à une restriction calorique de 40% jusqu’à l’âge de 18-20 mois et ont été comparés à des rats jeunes et âgés nourris ad libitum. Cette étude a permis de mettre en évidence des effets bénéfiques de la RCMLD sur la régulation et la fonctionnalité du GHRH-R et de proposer que le glucose et les acides gras libres (AGL) circulants soient impliqués dans le vieillissement de la somatotrope. Une étude de micro-puce à ADN à permis d’identifier des gènes associés à des mécanismes de protection et de réparation des dommages cellulaires mis en place dans l’hypophyse antérieure au cours du vieillissement et par la RCMLD. Finalement, les effets d’un stress gluco- ou lipotoxique sur la fonction somatotrope ont été étudiés chez des rats de 2 et 6 mois, infusés 72 h avec une solution de glucose ou d’Intralipides, mimant les niveaux circulants de glucose et d’AGL retrouvés chez le rat âgé. Les résultats obtenus montrent que la glucotoxicité affecte la régulation de certains gènes de la somatotrope, dont le GHRH-R, et suggèrent que la capacité de réponse à ce type de stress est altérée. Les mécanismes par lesquels la glucotoxicité exerce ces effets pourraient inclure la génération de stress oxydant. L’ensemble de ces résultats proposent de nouvelles pistes mécanistiques qui pourraient contribuer au retardement de la somatopause et, ultimement, à l’élaboration de nouvelles stratégies d’intervention nutritionnelles ou pharmacologiques ciblant les mêmes voies que la RCMLD, avec une efficacité similaire ou supérieure.

Étude du mécanisme de régulation de la sénescence et de p53 par la protéine SOCS1

Les mécanismes cellulaires anti-prolifératifs, lesquels comprennent l’apoptose, aussi appelée la mort cellulaire programmée, l’arrêt transitoire du cycle cellulaire et la sénescence, permettent à la cellule de prévenir, en réponse à différents stress, l’accumulation de mutations pouvant conduire à une prolifération incontrôlée et, éventuellement, au développement d’une tumeur. La régulation de ces différents mécanismes requiert l’activation de protéines appelées des suppresseurs de tumeur, dont le principal est p53. p53 est un facteur de transcription dont la stabilisation et l’activation conduit à une hausse de l’expression de gènes directement impliqués dans l’arrêt de la prolifération. Au cours des dernières années, l’ensemble des travaux sur p53 ont permis de mettre en évidence la complexité de sa fonction, de même que la multitude de voies de signalisation et de protéines avec lesquelles il coopère pour maintenir l’intégrité du génome. De ce fait, l’étude des mécanismes d’activation de p53 est de mise pour la compréhension de sa régulation et, éventuellement, pour la prévention et l’élaboration de nouvelles stratégies de traitement contre le cancer. L’objet de cette thèse est la mise en évidence d’un mécanisme d’activation de p53 et de la sénescence par la protéine SOCS1, un suppresseur de la signalisation par les cytokines. Ce mécanisme implique une interaction directe entre les deux protéines, plus précisément entre le domaine SH2 de SOCS1 et le domaine de transactivation de p53. SOCS1 interagit également, au niveau de son SOCS Box, avec les kinases ATM et ATR de la voie du dommage à l’ADN de façon à faciliter la phosphorylation de p53 en sérine 15. Ainsi, en interagissant à la fois avec p53 et ATM/ATR, SOCS1 contribue à la stabilisation et à l’activation de p53. En accord avec ce modèle, l’inhibition de SOCS1 dans des fibroblastes humains normaux tend à diminuer le nombre de cellules sénescentes suite à l’expression de l’oncogène ca-STAT5A et à réduire l’accumulation nucléaire de p53 dans ces cellules. De la même façon, les lymphocytes T provenant de souris Socs1-/-Ifnγ-/- sont moins susceptibles d’entrer en apoptose que les lymphocytes provenant de souris Socs1+/+Ifnγ+/+, suite à une exposition à des radiations. Dans les deux contextes, on observe une baisse de l’expression des gènes cibles de p53, ce qui démontre que SOCS1 est impliquée dans l’activation de p53 in vivo. Cette thèse a également pour but de mettre en évidence l’implication de SOCS1 dans l’activation d’autres facteurs de transcription et, par le fait même, de démontrer qu’elle peut agir comme un régulateur plus général de la transcription. Une étude approfondie de l’interaction entre SOCS1 et p53 a permis de démontrer que le domaine de transactivation II de p53 (acides aminés 36-67) est suffisant pour l’interaction. Plus précisément, il semble que le tryptophane 53 (W53) et la phénylalanine 54 (F54) sont les principaux résidus impliqués. Une analyse structurale de ce domaine de p53 a conduit à l’identification d’un motif conservé dans plusieurs autres facteurs de transcription pourvus d’un domaine de transactivation acide, dont p63, p73 et E2F1. En accord avec ces résultats, SOCS1 est en mesure d’interagir avec chacune des deux protéines. Ainsi, la capacité de SOCS1 d’interagir et de réguler l’activité de p53 peut s’étendre à d’autres facteurs de transcription. En terminant, le mécanisme présenté dans cette thèse contribue à la compréhension de la régulation de p53, le principal suppresseur de tumeur de la cellule. De plus, il met en évidence une nouvelle fonction de SOCS1, laquelle était jusqu’alors essentiellement connue pour inhiber la voie de signalisation JAK/STAT. Ce nouveau rôle pour SOCS1 permet d’expliquer de quelle manière une activation aberrante de la signalisation par les cytokines peut déclencher la sénescence ou l’apoptose. Enfin, le fait que SOCS1 puisse réguler différents facteurs de transcription permet de la qualifier de régulateur général des facteurs de transcription composés d’un domaine de transactivation acide.

The role of transforming growth factor-beta 1 in steroidogenesis, cell proliferation, and apoptosis in cultured bovine granulosa cells

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal