Neue Katalysatoren für die asymmetrische Strecker-Reaktion auf Kohlenhydratbasis

Die asymmetrische Strecker-Reaktion ist von großer Bedeutung zur Darstellung optisch aktiver natürlicher und artifizieller -Aminocarbonsäuren beider Enantiomerenreihen. In der vorliegenden Arbeit wurden Synthesen einer Reihe von metallfreien, löslichen und immobilisierten Organokatalysatoren auf Kohlenhydratbasis für die enantioselektive Hydrocyanierung von Iminen ausgearbeitet. Durch gezielte Variation sowohl der Substituenten als auch des monosaccharidischen chiralen Rückgrates, konnten durch Aktivitäts- und Selektivitätsvergleich mit bereits bekannten Glucokatalysatoren und mit Hilfe einfacher, durch MM2-Kraftfeldmethoden gewonnener, Molekülmodelle Struktur-Wirkungs-Beziehungen aufgestellt und Rückschlüsse auf den mechanistischen Ablauf der enantioselektiven pseudo-Strecker-Reaktion gezogen werden.

Identification of the N-Linked Glycosylation Sites of the Transcription Factor Rest and Effect of Glycosylation on DNA Binding and Transcriptional Activity

REST is a zinc-finger transcription factor implicated in several processes such as maintenance of embryonic stem cell pluripotency and regulation of mitotic fidelity in non-neuronal cells [Chong et al., 1995]. The gene encodes for a 116-kDa protein that acts as a molecular platform for co-repressors recruitment and promotes modifications of DNA and histones [Ballas, 2005]. REST showed different apparent molecular weights, consistent with the possible presence of post-translational modifications [Lee et al., 2000]. Among these the most common is glycosylation, the covalent attachment of carbohydrates during or after protein synthesis [Apweiler et al., 1999] My thesis has ascertained, for the first time, the presence of glycan chians in the transcription factor REST. Through enzymatic deglycosylation and MS, oligosaccharide composition of glycan chains was evaluated: a complex mixture of glycans, composed of N-acetylgalactosamine, galactose and mannose, was observed thus confirming the presence of O- and N-linked glycan chains. Glycosylation site mapping was done using a 18O-labeling method and MS/MS and twelve potential N-glycosylation sites were identified. The most probable glycosylation target residues were mutated through site-directed mutagenesis and REST mutants were expressed in different cell lines. Variations in the protein molecular weight and mutant REST ability to bind the RE-1 sequence were analyzed. Gene reporter assays showed that, altogether, removal of N-linked glycan chains causes loss of transcriptional repressor function, except for mutant N59 which showed a slight residual repressor activity in presence of IGF-I. Taken togheter these results demonstrate the presence of complex glycan chians in the transcription factor REST: I have depicted their composition, started defining their position on the protein backbone and identified their possible role in the transcription factor functioning. Considering the crucial role of glycosylation and transcription factors activity in the aetiology of many diseases, any further knowledge could find important and interesting pharmacological application.

Isolierung und Identifizierung von wachstumsfördernden Substanzen für das weinrelevante Bakterium Oenococcus oeni aus Fruchtsäften und Blattextrakten

Neben Tomatensaft wurde eine Vielzahl von Säften und Blattextrakten als Medienzusätze auf Wachstumsförderung bei 30 verschiedenen Oenococcus oeni-Stämmen getestet. Es zeigte sich eine breite Wachstumsförderung bei allen Zusätzen mit Ausnahme von Zitronensaft, sodass die Wachstumsfaktoren keine tomatenspezifischen Inhaltsstoffe sein können und eher ubiquitär in der Pflanzenwelt vorkommen. Das Ausmaß der Wachstumsförderung war stammabhängig sehr unterschiedlich und Tomatensaft stellte keineswegs für alle Stämme den optimalen Medienzusatz dar. Durch Schälen der Früchte war eine für die Analytik hilfreiche Abtrennung schalenspezifischer Inhaltsstoffe möglich, wobei auch die Schalenextrakte großes Potential für die Suche nach Wachstumsfaktoren offenbarten und die Wichtigkeit einer Auftrennung der Frucht in die verschiedenen Fruchtbereiche betonte. Aus Tomatensaft konnte analytisch der anorganische Wachstumsfaktor Mangan identifiziert werden. Die größten Zelldichten der Oenokokken-Stämme wurden hierbei bei 67 µM und 34 mM Manganzusatz erreicht. Bei 13 von 20 getesteten Oenokokkenstämmen konnte bei Zusatz von 34 mM Mangan der Tomatensaft ersetzt werden, bei 4 Stämmen (z. B. Stamm B2) fehlten jedoch noch weitere Wachstumsfaktoren und bei 3 Stämmen (z. B. Stamm B120) kam es zu einem verfrühten Absterben. Da weitere Mineralstoffe sowie veraschte Säfte und Blattextrakte keinen positiven Einfluß auf die Oenokokken-Zelldichte hatten, wurde mittels semipräparativer HPLC nach zusätzlichen organischen Wachstumsfaktoren für den Stamm B2 gesucht. Hierzu wurde der nachfolgende Wachstums-Assay miniaturisiert und erfolgreich auf Microtiterplatten etabliert. Es gelang die Isolierung und Identifizierung eines wachstumsfördernden Trisaccharides aus Mangoschalen-Extrakt, das aus den Zuckern Glucose, Rhamnose und Arabinose bestand. Von den monomeren Zuckern erhöhte lediglich die Arabinose die Zelldichte, das Optimum lag bei 1,5 g/l. Auch aus Zitronenmesokarp-Extrakt war die Isolierung eines wachstumsfördernden arabinosehaltigen Disaccharides möglich, die Menge reichte jedoch noch nicht für eine genaue Identifizierung aus. Desweiteren erwies sich 1,5 g/l Cystein als wachstumsstimulierend. Ein Zusatz aller gefundenen Wachstumsfaktoren (34 mM Mangan, 1,5 g/l Arabinose und 1,5 g/l Cystein) ersetzte den Tomatensaft bei weiteren Oenokokken-Stämmen (z.B. Stamm B120) komplett, wobei bei allen Stämmen sogar eine schnellere Anzucht erfolgte. Neben dem Tomatensaft war auch der Zusatz von Hefeextrakt zum Grundmedium nicht mehr nötig, sodass ein neues vereinfachtes Medium für die Anzucht von Oenokokken mit komplexen Nährstoffansprüchen vorgeschlagen werden konnte. Lediglich beim Stamm B2 zeigte sich noch ein OD-Unterschied von 0,2 in der stationären Phase, der nach Adsorptionsversuchen an Polyvinylpolypyrrolidon auf noch unidentifizierte Polyphenole im Tomatensaft zurückzuführen ist. Aus grünem Tee erwies sich das Polyphenol Epigallocatechingallat (EGCG) konzentrationsabhängig sowohl als Hemmstoff (>550 mg/l EGCG) als auch Wachstumsfaktor (400-500 mg/l EGCG) für den Oenokokken-Stamm B2. Der hemmende als auch der fördernde Einfluss auf das Wachstum wurde mittels Sytox/DAPI-Färbung bestätigt. Der sogenannte „Tomatensaft-Faktor“ ist also nicht eine spezielle Substanz, sondern das synergistische Zusammenwirken mehrerer einfacher Substanzen wie Mineralstoffe, Aminosäuren, Kohlenhydrate und Polyphenole. Auch sind die Oenokokken-Stämme bezüglich ihres Nährstoffbedarfes sehr unterschiedlich, sodass für jeden Stamm einzeln das optimale Substratspektrum ermittelt werden muss.

Allevamento massale di Aedes albopictus (Skuse) nell’ambito della tecnica SIT (Tecnica dell’Insetto Sterile)

Dal 1999 presso il laboratorio del Centro Agricoltura Ambiente “G. Nicoli” a Crevalcore (BO) è in corso una sperimentazione finalizzata a verificare la possibilità di attuare la tecnica del maschio sterile (SIT) in Italia contro Aedes albopictus. Alcuni aspetti per migliorare l’efficienza di questa struttura pilota, oggetto della presente ricerca, sono stati: 1) studio degli effetti di determinati costituenti della dieta larvale a) sullo sviluppo larvale stesso, per individuare intervalli limite di densità larvale e di concentrazione di cibo in cui è possibile lo sviluppo di tale specie, e b) sulla qualità dei maschi adulti ottenuti; 2) la valutazione di attrezzatura per l’allevamento massale e 3) la possibilità di migliorare la dieta larvale mediante integrazione di carboidrati. Dalle prove di valutazione della dieta larvale si è potuto osservare che, per quanto riguarda i parametri larvali, le due diete denominate “IAEA” (1 e 2) sono risultate più efficaci rispetto alla dieta standard “CAA”. Tali diete sono perciò da preferirsi nel loro possibile impiego in biofabbriche per l’allevamento massale. Le prove condotte sugli adulti allevati con le diverse diete hanno suggerito la necessità di valutare una possibile integrazione di componenti per migliorarne la longevità. Risulta altresì opportuno continuare la ricerca per ottimizzare la dieta larvale così da ottenere maschi di elevata qualità. Grazie ai risultati ottenuti dalle prove per valutare l’impiego di attrezzatura massale (vassoi di grandi dimensioni e carrello) si è potuto definire un modello per l’allevamento di Ae. albopictus con parametri standardizzati di densità larvale, dose di dieta, temperatura dell’acqua di allevamento, percentuale di maschi passati al setacciamento e rendimento di allevamento. Prove future saranno necessarie per testare altri componenti della dieta ricchi in carboidrati, quali saccarosio, da aggiungere alla dieta larvale per migliorare le qualità degli adulti ottenuti senza provocare effetti negativi sui parametri dello sviluppo larvale.

Struktur und Funktion des Lipoproteins von Nereis virens (Annelida)

Ein discoidales Lipoprotein aus dem Polychaeten Nereis virens (Annelida) wurde eingehend charakterisiert. Im Vordergrund standen dabei die transportierten Lipide, sowie die Ultrastruktur des Partikels. Das Nereis-Lipoprotein besitzt eine für Invertebraten atypische Lipidzusammensetzung: Außer den Phospholipiden gibt es keine klar dominierende Lipidklasse. Die Charakterisierung der Apolipoproteine zeigt Gemeinsamkeiten mit den Apolipophorinen der Insekten: Wie diese besitzt das Nereis-Lipoprotein zwei Apolipoproteine, die in einer 1:1-Stöchiometrie angeordnet sind. Das größere Protein (ApoNvLp I) ist dabei stärker zum wässrigen Medium exponiert ist als das kleinere (ApoNvLp II). Beide Proteinuntereinheiten sind N-glycosyliert. ApoNvLp II ist zusätzlich noch O-glycosyliert. Bei den Sekundärstrukturen dominieren β-Strukturen (35%) gegenüber α-Helices (14%); 28% waren ungeordnete Strukturen. Die Masse wurde mit verschiedenen Methoden bestimmt: sie liegt zwischen ~800 kDa (Gelfiltration) und ~860 kDa (Analytische Ultrazentrifugation). Der Sedimentationskoeffizient beträgt 9,7 S. Der zelluläre Lipoproteinrezeptor wurde aus einer großen Anzahl von Zellen und Geweben isoliert. Die biochemische Charakterisierung des Rezeptormoleküls zeigte es als ein monomeres, integrales, N- und O-glycosyliertes Membranprotein mit einer Masse von ~114 kDa. Die Bindungscharakteristika (Abhängigkeit von Ca2+, Disulfidbrücken) weisen es als Mitglied der LDLR-Superfamilie aus. In vitro-Inkubationsversuche mit fluoreszenzmarkierten Lipoproteinen zeigten die Aufnahme sowohl in Oocyten als auch in freie Coelomzellen (Elaeocyten) sowie in Spermatogonien- und Tetradenstadien. Auffällig war, dass die Lipide zusammen mit den Apolipoproteinen in die Dottergranula der Eizellen eingelagert wurden und nicht direkt in die Lipidtropfen. Auch bei den Elaeocyten wurden die Lipide nicht direkt in den Lipidtropfen eingelagert. Intakte Lipoproteine konnten per Dichtegradienten-Ultrazentrifugation nur aus Spermatogonien isoliert werden. Die isolierten Lipoproteine hatten die gleiche ‚Morphologie’ wie die aus der Coelomflüssigkeit isolierten, zeigten jedoch sehr viele Peptidfragmente im SDS-Gel, was auf eine beginnende Degradation hinweist. Es wird ein Modell für den Lipidtransport in Nereis virens vorgeschlagen, bei dem den Elaeocyten eine entscheidende Rolle im Lipidstoffwechsel zufällt.

Imine von Formyl-[2.2]paracyclophanen und ihre Anwendung in der enantioselektiven Katalyse

Kohlenhydrate wurden bislang nur selten zur Darstellung chiraler Liganden verwendet. Sie gelten als zu polyfunktionell und konformativ zu flexibel, um daraus mit vertretbarem Aufwand Liganden zu synthetisieren, die die Anforderungen an ein leistungsfähiges Katalysatorsystem - die spezifische Komplexierung des Metalls in einer konformativ möglichst rigiden Umgebung - erfüllen.rnDas Element der planaren Chiralität erwies sich in vielen asymmetrischen, katalytischen Prozessen als entscheidend für die Erzielung hoher Enantioselektivitäten.rnDie vorliegende Arbeit baut auf den Kohlenhydratliganden-Synthesen mit Glycosylaminen auf, die über geeignete komplexierende Zentren verfügen, um damit andere als die bisher mit Kohlenhydraten bekannten enantioselektiven Katalysen durchführen zu können. Zur Synthese stickstoffhaltiger chiraler Verbindungen haben sich besonders perpivaloylierte Glycosylamine vom Typ des 2,3,4,6-Tetra-O-pivaloyl-β-D-galactopyranosylamins bewährt. Im Rahmen dieser Dissertation wurden Schiff-Basen aus pivaloyliertem Galactosylamin bzw. verschiedenen anderen Galactosylamin-Bausteinen als chiralem Rückgrat, und einem Aldehyd auf der Basis von planar chiralem [2.2]Paracyclophan dargestellt. Die neuen N-Galactosylimine wurden außerdem in asymmetrischen Ugi-Reaktionen und in Tandem Mannich-Michael-Reaktionen zu N-Galactosyl-dehydropiperidinonen untersucht. Bei der Spaltung der dargestellten N-Galactosylimine von Paracyclophan-aldehyden unter mineralsauren Bedingungen sollten die entsprechenden mono- und di-substituierten Formyl- [2.2]paracyclophane in enantiomerenreiner Form erhalten werden. Die erhaltenen Verbindungen wurden als potentielle N,O-Liganden in der asymmetrischen Strecker Reaktion, in die enantioselektiven Epoxidierungen und in der Addition von Diethylzink an aromatische und aliphatische Aldehyde untersucht.rn

Enantioselektive Organokatalyse in Epoxidierungen und Cyanhydrinbildungen

In der vorliegenden Arbeit mit dem Titel „Enantioselektive Organokatalyse in Epoxidierungen und Cyanhydrinbildungen“ wurde die Synthese zweier Cyclophan-carbaldimine durchgeführt. Beide Verbindungen bestehen aus einem Glykosyl-Baustein und einem Paracyclophan-Baustein, die über eine Imin-Bindung verbrückt sind. Die Cyclophan-carbaldimine wurden dann als Katalysatoren in einer Reihe von enantioselektiven Reaktionen verwendet. Enantioselektive Reaktionen bilden von zwei spiegelbildlichen Produkten stets eines im Überschuss. Zu diesen Reaktionen zählen die in dieser Arbeit durchgeführten enantioselektiven Epoxidierungen und enantioselektiven Cyanhydrinsynthesen. Die enantioselektiven Epoxidierungen waren dabei als Teil der Totalsynthesen der Naturstoffe Dasyscyphin D und Caripyrin geplant. Diese beiden Naturstoffe zeigten in biologischen Tests am Institut für Biotechnologie und Wirkstoffforschung (IBWF) in Kaiserslautern Aktivität gegen den Reisbrand-Pilz Magnaporthe grisea, der für Ernteverluste in beträchtlichem Ausmaß verantwortlich ist. Das Caripyrin selbst beinhaltet eine Epoxidstruktur. Mittels der oben angeführten Katalysatoren wurde versucht, diese Epoxidstruktur selektiv einzuführen. Dies gelang nicht, aber der Naturstoff konnte mittels Epoxidierung durch m-Chlorperbenzoesäure erstmals dargestellt werden. In mehreren biologischen Vergleichstests am IBWF Kaiserslautern zeigte auch das synthetische Caripyrin mit dem natürlichen Caripyrin vergleichbare biologische Aktivität.rnDas Dasyscyphin D an sich trägt keine Epoxidfunktion. Dennoch spielt sie auch hier eine wichtige Rolle. Innerhalb der geplanten Totalsynthese von Dasyscyphin D sollte die Farnesylseitenkette eines aromatischen Ringes selektiv epoxidiert werden. Durch einen elektrophilen Angriff an dieses Epoxid sollte im Anschluss eine Cyclisierung zum Dasyscyphin-Grundgerüst eingeleitet werden, aus dem dann Dasyscyphin D dargestellt werden sollte. Im Gegensatz zur Caripyrin-Synthese, bei der die selektive Epoxidierung nicht gelang, scheint sie in der Synthese von Dasyscyphin D sattgefunden zu haben, allerdings ist eine Isolierung des Reaktionsproduktes noch nicht gelungen. Folglich konnte das Dasyscyphin D noch nicht erfolgreich synthetisiert werden.rnDie Versuche zur enantioselektiven Cyanhydrin-Synthese waren nicht Bestandteil einer Totalsynthese. Die Cyanhydrine wurden zuerst als Racemate synthetisiert und gaschromatographisch vermessen, um auf diese Weise die exakten Retentionszeiten der einzelnen Enantiomere zu ermitteln. Anschließend wurden die Cyanhydrine dann enantioselektiv dargestellt und ebenfalls gaschromatographisch vermessen. Durch den Vergleich mit den racemischen Cyanhydrinen konnte dabei direkt aus der Reaktionslösung gemessen werden, was erforderlich war, da eine Isolierung der Cyanhydrine unter den gewählten Reaktionsbedingen nicht gelang. Aus den gaschromatographischen Messungen konnten Enantiomerenüberschüsse von bis zu 95 % ermittelt werden. Weiterhin ergaben die Messungen, dass der Arabinosyl-Katalysator im Vergleich mit dem Galactosyl-Katalysator eine geringere Enantioselektivität induziert, was vermutlich auf leichte räumliche Differenzen der beiden Katalysatoren zurückzuführen ist. Ein weiteres wichtiges Ergebnis war, dass beide Katalysatoren, wie geplant, unterschiedliche Enantiomere im Überschuss bilden. Die Glykosyl- und Paracyclophan-Bausteine der beiden Katalysatoren waren so gewählt worden, dass beide Katalysatoren pseudo-Enantiomere bilden. Auf diese Weise sollte eine Einflussnahme auf das gebildete Enantiomer durch die Wahl des entsprechenden Cyclophan-carbaldimin-Katalysators möglich gemacht werden, was, wie bereits erwähnt, gelang.rn

Synthese von polymergebundenen Sialyl-Lewis x-Strukturen und deren Mimetika als Zelladhäsionsinhibitoren für E-, L- und P-Selektin

Kohlenhydrate dienen nicht nur der Ernährung oder der Stabilisierung von Zellwänden, sondern sie sind auch von essentieller Bedeutung für Zell-Zell-Wechselwirkungen im Organismus. Damit sind sie von besonderem Interesse für die Behandlung von Entzündungen sowie tumorösen Erkrankungen, die auf Wechselwirkungen zwischen bestimmten Kohlenhydraten und Rezeptoren, Selektine genannt, basieren. Die vorliegende Dissertation mit dem Titel „Synthese von polymergebundenen Sialyl-Lewis x-Strukturen und deren Mimetika als Zelladhäsionsinhibitoren für E-, L- und P-Selektin“ befasst sich mit der Synthese und der Modifizierung des natürlich vorkommenden Selektin-Liganden Sialyl-Lewisx und seinen potentiell mimetischen Strukturen auf Basis von Gemischen der an der Bindung beteiligten Kohlenhydrate sowie von sulfatierten Einheiten. Um im Organismus eine verstärkte Bindung an die zu adressierenden Rezeptoren und eine erhöhte Zirkulationsdauer zu erreichen, wurden die geeignet funktionalisierten Liganden mittels reaktiver Polymere auf Basis von Pentafluorphenyl-Reaktivestern im Rahmen einer polymeranalogen Umsetzung an ein definiertes Methacrylamid-Polymer gebunden.Um die biologische Wirksamkeit der synthetisierten Polymere zu überprüfen, wurden Oberflächenplasmonenresonanz-Messungen (SPR-Messungen) durchgeführt. Dabei zeigte sich bei den verschiedenen Selektinen eine unterschiedlich hohe Affinität der Sialyl-Lewis x sowie der mimetischen Polymere. Es konnten bei E-Selektin die geringsten, bei L-Selektin mittlere und bei P-Selektin die höchsten Affinitäten im unteren nanomolaren Bereich festgestellt werden.

Synthese mehrfach fluorierter MUC1-Glycopeptide für die Entwicklung tumorselektiver Vakzine und Untersuchung Mikroreaktor-unterstützter Bausteinsynthesen

Zur Entwicklung einer selektiven Tumorimmuntherapie wurden im Rahmen dieser Dissertation potentielle Vakzine dargestellt. Als Leitstruktur für die Impfstoffkandidaten diente das Oberflächenglycoprotein MUC1, das durch fehlregulierte Enzymaktivitäten auf malignen Zellen strukturell verändert überexprimiert wird. Hierbei wurde insbesondere der Einfluss von Fluorsubstituenten in der Glycanseitenkette auf die Immunogenität und die Spezifität der Vakzine untersucht. Dazu wurde ein dreifach fluoriertes Analogon an Tetanus Toxoid (TTox) als Trägerprotein angebunden und in Immunisierungsstudien an transgenen Mäusen konnten hohe Selektivitäten und starke Immunantworten nachgewiesen werden. Die Darstellung des 20 Aminosäuren umfassenden Glycopeptides erfolgte an der festen Phase, wobei unterschiedlich fluorierte Thomsen-Friedenreich-Antigenanaloga anstelle eines Threonins in die Sequenz eingebaut wurden. Diese Bausteine wurden durch Glycosylierungsreaktionen fluorierter Donoren sowie Akzeptoren hergestellt, wobei Letztere durch nachträgliche Fluorierungen der Glycosylaminosäure erhalten wurden. Darüber hinaus wurde die Durchführung der komplexen Glycosylierungsreaktionen in Mikroreaktoren am Beispiel zweier fluorierter Glycosylaminosäuren untersucht. Neben der raschen Optimierung der Reaktionsparameter in Durchflussreaktoren konnte die direkte Umsetzung in einem mikrostrukturierten Reaktor in den präparativen Maßstab demonstriert werden.

Synthese cyclischer Peptide und von Kohlenhydraten abgeleitete Katalysatoren zur enantioselektiven Darstellung von Cyanhydrinen

Der Suche nach neuen Wirkstoffen für den chemischen Pflanzenschutz kommt insbesondere vor dem Hintergrund der steigenden Weltbevölkerung und weniger zur Verfügung stehenden kulturfähigen Ackerflächen eine stetig wachsende Bedeutung zu. Ziel dieser Arbeit war die Synthese von cyclischen Peptiden und Depsipeptiden, die aufgrund ihrer biologischen Aktivität als potentielle Insektizide für den chemischen Pflanzenschutz in Frage kommen. Darüber hinaus sollten von Kohlenhydraten abgeleitete Katalysatoren zur enantioselektiven Cyanhydrinsynthese entwickelt werden, um einen leichten Zugang zu den Bausteinen der Depsipeptide zu ermöglichen. Als vielversprechender Naturstoff mit insektiziden Eigenschaften gilt das cyclische Pentapeptid Cycloaspeptid E, dessen Totalsynthese in 10 Stufen mit einer Gesamtausbeute von 25% erreicht wurde, sodass die Verbindung für biologische Tests bereitgestellt werden konnte. Zusätzlich gelang die Kristallisation der Verbindung, was eine Röntgenstrukturanalyse ermöglichte. Ein Derivat von Cycloaspeptid E sollte 2-Aminonicotinsäure anstelle von Anthranilsäure enthalten. Die Synthese dieser Verbindung wurde auf drei Wegen versucht. Dabei zeigte sich, dass es bei einer zur Totalsynthese des Naturstoffs analogen Strategie zur quantitativen Bildung eines Diketopiperazins kommt. Auf den anderen Routen ließ sich entweder ein Kupplungsschritt nicht realisieren, oder die Verbindung erwies sich unter den gewählten Bedingungen als instabil. Die Darstellung eines 2-Aminonicotinsäure-Derivats von Cycloaspeptid E bleibt daher weiterhin ein ungelöstes Problem, das weiterer Forschung bedarf. Verticilid A1 ist ein cyclisches Depsipeptid, das aufgrund seiner Bindungsfähigkeit an den Ryanodinrezeptor von Insekten, als Leitstruktur für die Suche nach neuen Insektiziden von Interesse ist. Um zu untersuchen, wie wichtig die Esterbindungen im Molekül für die biologische Aktivität sind, sollte das entsprechende Amid-Derivat und das Cyclodepsipeptid mit nur zwei statt vier Esterbindungen hergestellt werden. Hierbei zeigte sich, dass eine zur Darstellung von Verticilid A1 analoge Syntheseroute zu einer ausgeprägten Epimerisierung führt. Eine lineare Synthese der Derivate endet in der Bildung des Diketopiperazins. Weiterhin wurden zwei neue, zueinander pseudoenantiomere Vanadium(IV)-Katalysatoren auf Basis von D-Glucose einerseits und L-Xylose andererseits dargestellt. Diese lassen sich in fünf bzw. 14 Stufen synthetisieren und liefern in der enantioselektiven Katalyse von Mandelsäurenitril Enantiomerenüberschüsse von 89% bzw. 91% bei hohen Ausbeuten. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass im Rahmen dieser Arbeit die Totalsynthese von Cycloaspeptid E erfolgreich durchgeführt wurde, und die Syntheseversuche von weiteren cyclischen Peptiden wichtige Erkenntnisse für weitere Synthesen lieferten. Mit den beiden hergestellten Vanadium(IV)-Komplexen wurden zwei potente, auf Kohlenhydraten basierende Katalysatoren für die enantioselektive Synthese von Cyanhydrinen entwickelt.

Starch distribution in pear tree organs in relation to training systems, rootstocks and fruit quality

Starch is the main form in which plants store carbohydrates reserves, both in terms of amounts and distribution among different plant species. Carbohydrates are direct products of photosynthetic activity, and it is well know that yield efficiency and production are directly correlated to the amount of carbohydrates synthesized and how these are distributed among vegetative and reproductive organs. Nowadays, in pear trees, due to the modernization of orchards, through the introduction of new rootstocks and the development of new training systems, the understanding and the development of new approaches regarding the distribution and storage of carbohydrates, are required. The objective of this research work was to study the behavior of carbohydrate reserves, mainly starch, in different pear tree organs and tissues: i.e., fruits, leaves, woody organs, roots and flower buds, at different physiological stages during the season. Starch in fruit is accumulated at early stages, and reached a maximum concentration during the middle phase of fruit development; after that, its degradation begins with a rise in soluble carbohydrates. Moreover, relationships between fruit starch degradation and different fruit traits, soluble sugars and organic acids were established. In woody organs and roots, an interconversion between starch and soluble carbohydrates was observed during the dormancy period that confirms its main function in supporting the growth and development of new tissues during the following spring. Factors as training systems, rootstocks, types of bearing wood, and their position on the canopy, influenced the concentrations of starch and soluble carbohydrates at different sampling dates. Also, environmental conditions and cultural practices must be considered to better explain these results. Thus, a deeper understanding of the dynamics of carbohydrates reserves within the plant could provide relevant information to improve several management practices to increase crop yield efficiency.

1st and 2nd Generation Ethanol from Biomass Crops

In chapter 1 and 2 calcium hydroxide as impregnation agent before steam explosion of sugarcane bagasse and switchgrass, respectively, was compared with auto-hydrolysis, assessing the effects on enzymatic hydrolysis and simultaneous saccharification and fermentation (SSF) at high solid concentration of pretreated solid fraction. In addition, anaerobic digestion of pretreated liquid fraction was carried out, in order to appraise the effectiveness of calcium hydroxide before steam explosion in a more comprehensive way. In As water is an expensive input in both cultivation of biomass crops and subsequent pretreatment, Chapter 3 addressed the effects of variable soil moisture on biomass growth and composition of biomass sorghum. Moreover, the effect of water stress was related to the characteristics of stem juice for 1st generation ethanol and structural carbohydrates for 2nd generation ethanol. In the frame of chapter 1, calcium hydroxide was proven to be a suitable catalyst for sugarcane bagasse before steam explosion, in order to enhance fibre deconstruction. In chapter 2, effect of calcium hydroxide on switchgrass showed a great potential when ethanol was focused, whereas acid addition produced higher methane yield. Regarding chapter 3, during crop cycle the amount of cellulose, hemicellulose and AIL changed causing a decrease of 2G ethanol amount. Biomass physical and chemical properties involved a lower glucose yield and concentration at the end of enzymatic hydrolysis and, consequently, a lower 2G ethanol concentration at the end of simultaneous saccharification and fermentation, proving that there is strong relationship between structure, chemical composition, and fermentable sugar yield. The significantly higher concentration of ethanol at the early crop stage could be an important incentive to consider biomass sorghum as second crop in the season, to be introduced into some agricultural systems, potentially benefiting farmers and, above all, avoiding the exacerbation of the debate about fuel vs food crops.

Isolierung von Essigsäure-, Propionsäure- und Buttersäure-bildenden Bakterien aus Biogasanlagen

In der vorliegenden Arbeit wurden Essigsäure-, Propionsäure und Buttersäure-bildende Bakterien aus einer thermophilen und drei mesophilen Biogasanlagen sowie aus zwei Hochdruck-Biogas-Laborfermentern isoliert. Die Fermenter waren mit dem nachwachsenden Rohstoff Maissilage, teilweise mit Rinder- oder Schweinegülle und weiteren festen Inputstoffen gefüttert. Für die Isolierung von Säure-bildenden Bakterien wurde ein Mineralsalzmedium verwendet, welchem als Kohlenstoffquelle Na-DL-Laktat, Succinat, Ethanol, Glycerin, Glucose oder eine Aminosäuremischung (Alanin, Serin, Threonin, Glutaminsäure, Methionin und Cystein) hinzugefügt wurde. Hierbei handelt es sich um Substrate, welche beim anaeroben Abbau während der Hydrolyse oder der primären Gärung entstehen können. Die erhaltenen Isolate waren in der Lage, aus diesen Substraten Essigsäure, Propionsäure oder Buttersäure zu bilden. Insgesamt wurden aus den beprobten Anlagen 49 Isolate gewonnen, welche zu den Phyla Firmicutes, Tenericutes oder Thermotogae gehörten. Mit Hilfe von 16S rDNA-Sequenzen konnten die meisten Isolate als Clostridium sporosphaeroides, Defluviitoga tunisiensis und Dendrosporobacter sp. identifiziert werden. Die Bildung von Essigsäure, Propionsäure oder Buttersäure wurde in Kulturen von Isolaten festgestellt, welche als folgende Arten identifiziert wurden: Bacillus thermoamylovorans, Clostridium aminovalericum, Clostridium cochlearium/Clostridium tetani, Clostridium sporosphaeroides, Dendrosporobacter sp., Proteiniborus sp., Selenomonas bovis und Tepidanaerobacter sp. Zwei Isolate, verwandt mit Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, konnten Buttersäure und Milchsäure bilden. In Kulturen von Defluviitoga tunisiensis wurde Essigsäurebildung festgestellt. Ein Vergleich der 16S rDNA-Sequenzen mit Datenbanken und die Ergebnisse der PCR-Amplifikationen mit Isolat-spezifischen Primerpaaren ergaben zusätzlich Hinweise, dass es sich bei einigen Isolaten um neue Arten handeln könnte (z. B. Stamm Tepidanaerobacter sp. AS34, Stamm Proteiniborus sp. ASG1.4, Stamm Dendrosporobacter sp. LG2.4, Stamm Desulfotomaculum sp. EG2.4, Stamm Gallicola sp. SG1.4B und Stamm Acholeplasma sp. ASSH51). Durch die Entwicklung Isolat-spezifischer Primerpaare, abgeleitet von 16S rDNA-Sequenzen der Isolate oder Referenzstämmen, konnten die Isolate in Biogasanlagen detektiert und mittels qPCR quantifiziert werden (hauptsächlich im Bereich zwischen 1000 bis 100000000 Kopien der 16S rDNA/g BGA-Probe). Weiterhin konnten die Isolate mit Hilfe physiologischer Versuche charakterisiert und deren Rolle in der anaeroben Abbaukette diskutiert werden. Die Art Defluviitoga tunisiensis scheint eine große Bedeutung in Biogasanlagen zu spielen. Defluviitoga tunisiensis wurde am häufigsten in Untersuchungen im Rahmen der vorliegenden Arbeit isoliert und konnte auch mit Hilfe des entwickelten Primerpaares in hohen Abundanzen in den beprobten Biogasanlagen detektiert werden (10000 - 100000000 Kopien der 16S rDNA/g BGA-Probe). Die manuelle Annotation des Gesamtgenoms sowie die Substratverwertungsversuche haben gezeigt, dass Defluviitoga tunisiensis ein sehr breites Substratspektrum in der Verwertung von Kohlenhydraten besitzt und dadurch möglicherweise eine wichtige Rolle bei der Verwertung von Biomasse in Biogasanlagen einnimmt. Mit Hilfe der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnten somit neue Einblicke in die zweite Stufe des anaeroben Abbaus, die Acidogenese, in Biogasanlagen gegeben werden. rn

Effects of a short-term overfeeding with fructose or glucose in healthy young males

Consumption of simple carbohydrates has markedly increased over the past decades, and may be involved in the increased prevalence in metabolic diseases. Whether an increased intake of fructose is specifically related to a dysregulation of glucose and lipid metabolism remains controversial. We therefore compared the effects of hypercaloric diets enriched with fructose (HFrD) or glucose (HGlcD) in healthy men. Eleven subjects were studied in a randomised order after 7 d of the following diets: (1) weight maintenance, control diet; (2) HFrD (3.5 g fructose/kg fat-free mass (ffm) per d, +35 % energy intake); (3) HGlcD (3.5 g glucose/kg ffm per d, +35 % energy intake). Fasting hepatic glucose output (HGO) was measured with 6,6-2H2-glucose. Intrahepatocellular lipids (IHCL) and intramyocellular lipids (IMCL) were measured by 1H magnetic resonance spectroscopy. Both fructose and glucose increased fasting VLDL-TAG (HFrD: +59 %, P < 0.05; HGlcD: +31 %, P = 0.11) and IHCL (HFrD: +52 %, P < 0.05; HGlcD: +58 %, P = 0.06). HGO increased after both diets (HFrD: +5 %, P < 0.05; HGlcD: +5 %, P = 0.05). No change was observed in fasting glycaemia, insulin and alanine aminotransferase concentrations. IMCL increased significantly only after the HGlcD (HFrD: +24 %, NS; HGlcD: +59 %, P < 0.05). IHCL and VLDL-TAG were not different between hypercaloric HFrD and HGlcD, but were increased compared to values observed with a weight maintenance diet. However, glucose led to a higher increase in IMCL than fructose.

Glycomic analysis of human mast cells, eosinophils and basophils

In allergic diseases such as asthma, eosinophils, basophils and mast cells, through release of preformed and newly generated mediators, granule proteins and cytokines, are recognized as key effector cells. While their surface protein phenotypes, mediator release profiles, ontogeny, cell trafficking and genomes have been generally explored and compared, there has yet to be any thorough analysis and comparison of their glycomes. Such studies are critical to understand the contribution of carbohydrates to the induction and regulation of allergic inflammatory responses and are now possible using improved technologies for detecting and characterizing cell-derived glycans. We thus report here the application of high-sensitivity mass spectrometric-based glycomics methodologies to the analysis of N-linked glycans derived from isolated populations of human mast cells, eosinophils and basophils. The samples were subjected to matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) time-of-flight (TOF) screening analyses and MALDI-TOF/TOF sequencing studies. Results reveal substantive quantities of terminal N-acetylglucosamine containing structures in both the eosinophil and the basophil samples, whereas mast cells display greater relative quantities of sialylated terminal epitopes. For the first time, we characterize the cell surface glycan structures of principal allergic effector cells, which by interaction with glycan-binding proteins (e.g. lectins) have the possibility to dictate cellular functions, and might thus have important implications for the pathogenesis of inflammatory and allergic diseases.