Humane CD4 + CD25 + regulatorische T-Zellen: Charakterisierung von Subpopulationen und Identifizierung eines Markers

CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen (CD4+CD25+ Tregs) sind essentiell an der Hom��ostase des Immunsystems beteiligt, indem sie eine antigenspezifische Toleranzinduktion in der Peripherie vermitteln und vor der Entstehung von Autoimmunerkrankungen sch��tzen. Dar��ber hinaus sind diese Zellen wesentlich an der Kontrolle von Allergien, Infektionen und Tumoren beteiligt. Innerhalb dieser Arbeit konnten zwei bisher unbekannte Subpopulationen humaner CD4+CD25+ Tregs, isoliert aus dem peripheren Blut des Menschen, nachgewiesen werden. Diese Subpopulationen unterscheiden sich in ihrer Oberfl��chenexpression und exprimieren die Integrine a4b1 bzw. a4b7. Beide Treg-Subpopulationen supprimieren kokultivierte CD4+ T-Helferzellen Zellkontakt-abh��ngig und konvertieren gleichzeitig einen Teil dieser Zellen in sekund��re Suppressorzellen (iTregs). a4b1+ Tregs induzieren TGF-��-sezernierende iTregs, a4b7+ Tregs f��hren zur Bildung von IL-10-produzierenden iTregs. Differentielle Proteomanalysen humaner CD4+CD25+ Tregs, im Vergleich zu CD4+CD25- T-Helferzellen, f��hrten zur Identifizierung von Galectin-10 als Markerprotein, das fast ausschlie��lich von CD4+CD25+ Tregs und nicht von CD4+ T-Helferzellen exprimiert wird. Galectin-10 ist ein intrazellul��res Protein, das essentiell f��r die funktionellen Eigenschaften humaner CD4+CD25+ Tregs ist. Die Blockade der Galectin-10-Bildung in den CD4+CD25+ Tregs durch RNA-Interferenz f��hrte zu wesentlichen funktionellen Ver��nderungen der CD4+CD25+ Tregs. In Abwesenheit von Galectin-10 verlieren humane CD4+CD25+ Tregs ihre suppressiven Eigenschaften und ihren anergischen Ph��notyp. Somit konnte mit Galectin-10 erstmals ein spezifischer Marker f��r humane CD4+CD25+ Tregs identifiziert werden, der wesentlich f��r den funktionellen Ph��notyp dieser Regulatoren peripherer T-Zelltoleranz ist.

Molekulare Mechanismen der Kontrolle von T-Helferzellen durch nat��rlich vorkommende CD4 +CD25 + regulatorische T-Zellen

CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen (CD4+CD25+ Tregs) sind in der Lage die Proliferation und Cytokin-Produktion konventioneller T-Zellen zu supprimieren. Obwohl ein entscheidender Mechanismus dieses Prozesses die Inhibition der Interleukin-2 Produktion ist, sind die beteiligten Molek��le weitestgehend unbekannt. Interessanterweise entwickeln NFATc2-, NFATc3-doppeldefiziente M��use (DKO M��use) schwerste Autoimmunerkrankungen, so dass im Rahmen dieser Arbeit die Rolle der Transkriptionsfaktoren NFATc2 und NFATc3 bei der Entstehung von CD4+CD25+ Tregs und der CD4+CD25+ Treg-vermittelten Suppression konventioneller T-Zellen untersucht wurde. Es konnte gezeigt werden, dass zwar die Gesamtheit der peripheren CD4+CD25+ T-Zellen keinerlei suppressives Potential besitzt, eine Subpopulation dieser Zellpopulation, die sehr stark CD25 und GITR exprimiert (CD4+CD25++GITR++ T-Zellen), jedoch in der Lage ist kokultivierte konventionelle CD4+ T-Zellen in ihren Effektorfunktionen zu inhibieren. Allerdings lie��en sich die konventionellen CD4+ T-Zellen aus DKO M��usen nicht von CD4+CD25+ Tregs in ihrer Proliferation und Zytokinproduktion inhibieren. Es kann also abschlie��end gesagt werden, dass das Fehlen der Transkriptionsfaktoren NFATc2 und NFATc3 die Entstehung und Funktion von CD4+CD25+ Tregs nicht beeinflusst, jedoch konventionelle CD4+ T-Zellen resistent gegen eine CD4+CD25+ Treg-vermittelte Suppression werden l��sst.

Transkriptionelle Kontrolle der Entwicklung und Funktion nat��rlich vorkommender CD4 + CD25 + regulatorischer T-Zellen

CD4+CD25+ nat��rlich vorkommende regulatorische T-Zellen (nTregs) repr��sentieren in Menschen und M��usen etwa 5-10% aller peripheren CD4+ T-Zellen und besitzen eine wichtige Aufgabe im Immunsystem. nTregs sind entscheidend an der peripheren Toleranz beteiligt, da sie potenziell autoaggressive T-Zellen in ihrer Cytokinproduktion und Proliferation hemmen. Trotzdem ist der molekulare Mechanismus der nTreg-vermittelten Suppression und der Entwicklung dieser nTregs noch weitestgehend unbekannt. Vor einigen Jahren wurde der Transkriptionsfaktor FoxP3 (Forkhead Box P3) als der ���Hauptregulator��� f��r die Entwicklung und Funktion von nTregs identifiziert. Um die suppressiven F��higkeiten von nTregs optimal f��r therapeutische Zwecke einsetzen zu k��nnen, ist es daher von gro��er Notwendigkeit den zugrundeliegenden molekularen Mechanismus zu verstehen und Molek��le zu identifizieren, die an der Regulation des nTreg-spezifischen Faktors FoxP3 beteiligt sind. Ein Teil dieser Arbeit besch��ftigt sich mit der microRNA155 (miR155) bei der nTreg-vermittelten Suppression. Es konnte gezeigt werden, dass die ektopische Expression der miR155 in konventionellen CD4+ T-Zellen zu einer Erh��hung der IL-2 Produktion f��hrte, so dass die Zellen resistenter gegen��ber der nTreg-vermittelten Suppression wurden. Die transiente Aufhebung der Suppression durch die miR155 bietet somit einen m��glichen therapeutischen Einsatz bei der Behandlung von Tumorerkrankungen. Weiterhin konnte in dieser Arbeit demonstriert werden, dass der Transkriptionsfaktor HELIOS, oder vielmehr seine lange Isoform, HELIOS_long, eine entscheidende Rolle bei der Regulation der FoxP3 Expression einnimmt. Im Vergleich zu konventionellen CD4+ T-Zellen exprimieren nTregs hohe Mengen an HELIOS. In in vitro Studien zeigte sich, dass endogenes HELIOS in nTregs an den FoxP3 Promotor binden und diesen aktivieren kann. Die ektopische Expression von HELIOS_long f��hrte in konventionellen CD4+ T-Zellen (HELIOSlowFoxP3-) nur in Gegenwart der Cytokine IL-2 und TGF-�� zu einer gesteigerten FoxP3 Promotor Aktivit��t. Neben der Aktivierung konnte auch eine gesteigerte FoxP3 Protein Expression detektiert werden. Diese in vitro Daten konnten auch in einem in vivo Mausmodell verifiziert werden. Der adoptive Transfer HELIOS_long transfizierter CD4+ T-Zellen (HELIOSlowFoxP3-) in T-Zell-defiziente M��use f��hrte zu der Induktion FoxP3+ T-Zellen mit suppressiven F��higkeiten sowohl ex vivo als auch in vivo. Zusammengefasst zeigte sich, dass der Transkriptionsfaktor HELIOS einen stark f��rdernden Einfluss auf die Expression von FoxP3 besitzt. Diese Beobachtung bietet eine M��glichkeit f��r die Induktion stabiler regulatorischer T-Zellen als therapeutischen Einsatz f��r die Behandlung von Autoimmunerkrankungen.

Die Rolle CD4 + CD25 + regulatorischer T-Zellen in der Niedrigzonentoleranz gegen��ber Kontaktallergenen

Die allergische Kontaktdermatitis ist eine der h��ufigsten Berufserkrankungen, die durch die Exposition mit hohen Mengen eines Kontaktallergens ausgel��st wird. In Mausmodellen sehen wir, dass mittels einer Niedrigzonentoleranz (NZT) die Bildung einer Kontaktsensibilisierung unterdr��ckt werden kann. Bei der NZT f��hrt die epikutane Applikation von subimmunogenen Dosen zu einer systemischen Toleranzentwicklung, die durch CD8+ Suppressor-T-Zellen Hapten-spezifisch vermittelt wird. F��r die Generierung dieser CD8+ Suppressor-T-Zellen sind IL-10-sezernierende CD4+ regulatorischen T-Zellen (Tregs) notwendig. Aufbauend auf diesen Ergebnissen sollte in dieser Arbeit ��berpr��ft werden, ob nat��rlichen Tregs (nTregs) bei der NZT eine Rolle spielen und die Funktion und Aufgaben dieser Zellen w��hrend der NZT untersucht werden. rnWir konnten keine erh��hte Anzahl von nTregs w��hrend der Niedrigzonentoleranz gegen��ber Kontaktallergenen im Vergleich zur CHS charakterisieren. Weiterhin haben wir gezeigt, dass eine Reduktion der nTregs durch Depletion mittels anti-CD25-Anik��rper oder durch Cyclophosphamid-Gabe die Entstehung der CD8+ Suppressor-T-Zellen der NZT unterdr��ckt und damit die Entwicklung der Toleranzreaktion verhindert wird. Ferner wurde beobachtet, dass eine epikutane NZT Hapten-spezifisch durch CD8+ T-Zellen ��bertragen werden kann, w��hrend CD4+CD25+ T-Zellen eine Hapten-unspezifische Wirkung zeigten.rn

Lentivirus-mediated knockdown of Galectin-10 and Foxp3 in human immune cells

Die Suppression von autoreaktiven T-Zellen ist eine Funktion von CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen (CD4+CD25+ Tregs). CD4+CD25+ Tregs unterdr��cken autoaggressive Immunantworten. Galectin-10 und Foxp3 sind wichtige Proteine, die an dem supprimierenden Mechanismus der Tregs beteiligt sind. Galectin-10 ist eines der ��ltesten bekannten humanen Proteine, die nicht in anderen Spezies gefunden worden sind. Foxp3 ist ein Transkriptionsfaktor, der in menschlichen CD4+CD25+ Tregs und in CD4+CD25- T-Effektor-Zellen nach Aktivierung exprimiert wird. Ein siRNA-vermittelter Knockdown dieses intrazellul��ren l��slichen Proteins hebt die supprimierende Funktion der humanen CD4+CD25+ Tregs auf.rnDiese Arbeit beinhaltet in vitro durchgef��hrte Untersuchungen zur Erm��glichung eines Knockdown von Galectin-10 und/oder Foxp3 in humanisierten M��usen. Es war m��glich, ein Verfahren f��r die Produktion von lentiviralen Partikeln zu etablierten, die sich als effizientes Vehikel f��r den Gentransfer in humane Stammzellen und verschiedene Tumor- und Immunzellen erwiesen. Nach der Transduktion von AML14.3D10 Tumorzellen mit GFP-codierenden lentiviralen Partikeln konnte eine langfristige Expression von GFP erreicht werden. Au��erdem war es m��glich lentivirale Partikel zu erzeugen, die mit shRNA gegen Galectin-10 codiert waren. Die erzeugten Partikel erwiesen sich als funktionell, indem sie eine deutliche Herunterregulation von Galectin-10 in konstitutiv Galectin-10 exprimierenden AML14.3D10 Tumorzellen bewirkten. Unsere Studie pr��sentierte au��erdem eine erstmalige Untersuchung zum Nachweis von Galectin-10-Protein in Eosinophilen aus humanen CD34+ h��matopoetischen Stammzellen (HSC). Diese stabile in vitro Galectin-10-Expression bietet ein alternatives Untersuchungsmodell zu CD4+CD25+ Tregs, die nicht aus CD34+ HSC differenziert werden k��nnen. Der zus��tzliche Einbau des GFP-Gens in die mit shRNA gegen Galectin-10 codierende lentivirale Partikel war ein wichtiger Schritt zur Markierung von Zellen, die einen Galectin-10-Knockdown aufwiesen. Die neuen bicistronischen lentiviralen Partikel erwiesen sich sowohl in aus CD34+ HSC differenzierten Eosinophilen als auch in AML14.3D10 Zellen, die einen eosinophilen Ph��notyp aufweisen, als funktionell. Schlie��lich konnte mit den bicistronischen lentiviralen Partikeln, die mit GFP und shRNA gegen Foxp3 codiert waren, eine Herunterregulation von Foxp3 in CD4+CD25- T-Effektor-Zellen erreicht werden, was erneut die erfolgreiche Herstellung von funktionellen lentiviralen Partikeln bewies.rn

Mechanismen zur Suppression der experimentellen akuten Graft-versus-Host-Disease

Die Transplantation von allogenen h��matopoetischen Stammzellen stellt f��r viele Patienten mit h��matologischen Erkrankungen, wie beispielsweise akuter Leuk��mie, oftmals die einzige kurative Therapieoption dar. Die Erkennung von Empf��ngerantigenen durch immunkompetente Zellen des Spenders bietet dabei die Basis f��r erw��nschte Graft-versus-Tumor-Effekte, verursacht jedoch h��ufig au��erdem die unerw��nschte Graft-versus-Host Disease (GvHD), eine mitunter schwerwiegende Komplikation. In der vorliegenden Arbeit wurden potentielle Mechanismen zur Hemmung alloreaktiver CD4+ und CD8+ T-Zellen (TZ) und folglich zur Hemmung der akuten GvHD in einem experimentellen GvHD-Modell untersucht, welches auf dem Transfer von allogenen Zellen zwischen MHC-inkompatiblen Mausst��mmen basiert. Die vorliegende Arbeit weist zum Einen darauf hin, dass das Fehlen MyD88- und TRIF-vermittelter Toll-like-Rezeptor-Signale zumindest im Rahmen des hier verwendeten Transplantationsmodells nicht zwingend zu einer Hemmung der akuten GvHD f��hrt. Zum Anderen konnte belegt werden, dass CD4+ CD25+ regulatorische T-Zellen (Tregs) kompetente Suppressoren der durch alloreaktive CD4+ und CD8+ TZ ausgel��sten akuten GvHD darstellen. In weiterf��hrenden Experimenten ist gezeigt worden, dass die Tregs sich verschiedener Mechanismen bedienen, um ihre Zielzellen zu inhibieren. Das suppressive Zytokin Interleukin-10 kann als l��slicher Mediator zumindest in vitro offenbar eine Rolle bei der Treg-vermittelten Suppression alloreaktiver TZ spielen. Da jedoch auch Tregs aus Interleukin-10-defizienten Spendern die GvHD-Entstehung in den Empf��ngern abschw��chen konnten, m��ssen noch weitere Mechanismen involviert sein. Es konnte in einer gemischten Leukozyten Reaktion in vitro eine zellkontaktabh��ngige Kommunikation mittels gap junctions haupts��chlich zwischen den Tregs und den allogenen Dendritischen Zellen (DCs) nachgewiesen werden, welche prinzipiell den Transfer von cAMP m��glich macht. Die Kommunikation zwischen Tregs und DCs resultierte in einem supprimierten Ph��notyp der DCs, gekennzeichnet durch eine verminderte Expression kostimulatorischer Molek��le auf ihrer Oberfl��che. Solche supprimierten DCs k��nnen als Folge die alloreaktiven Spender-TZ vermutlich nicht aktivieren. Das cAMP-erh��hende Rolipram konnte in einer gemischten Leukozyten Reaktion in vitro die Proliferation alloreaktiver CD4+ und CD8+ TZ hemmen. Daneben konnte die Treg-vermittelte Suppression alloreaktiver TZ und der GvHD in vivo durch die zus��tzliche Verabreichung von Rolipram noch gesteigert werden. Im letzten Kapitel dieser Arbeit wurde beschrieben, dass die alleinige Aktivierung alloreaktiver CD8+ TZ ausreichend ist, um eine akute GvHD auszul��sen. In diesem Zusammenhang konnte nachgewiesen werden, dass CD4+ CD25+ Tregs die akute GvHD auch in einer scheinbar MHC-II-unabh��ngigen Weise hemmen k��nnen. Zusammenfassend belegt die vorliegende Arbeit, dass Tregs in einem MHC-inkompatiblen Transplantationsmodell alloreaktive CD4+ und CD8+ TZ und folglich die Entstehung einer GvHD effizient hemmen k��nnen. Bei der Hemmung der GvHD kommen wahrscheinlich verschiedene Mechanismen zum Tragen. Zumindest in vivo scheint von Tregs produziertes Interleukin-10 eine untergeordnete Rolle bei der Suppression alloreaktiver TZ und der GvHD zu spielen, hierbei steht vermutlich vielmehr der cAMP-abh��ngige Suppressionsmechanismus im Vordergrund.

Equine CD4(+) CD25(high) T cells exhibit regulatory activity by close contact and cytokine-dependent mechanisms in vitro

Horses are particularly prone to allergic and autoimmune diseases, but little information about equine regulatory T cells (Treg) is currently available. The aim of this study therefore was to investigate the existence of CD4(+) Treg cells in horses, determine their suppressive function as well as their mechanism of action. Freshly isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy horses were examined for CD4, CD25 and forkhead box P3 (FoxP3) expression. We show that equine FoxP3 is expressed constitutively by a population of CD4(+) CD25(+) T cells, mainly in the CD4(+) CD25(high) subpopulation. Proliferation of CD4(+) CD25(-) sorted cells stimulated with irradiated allogenic PBMC was significantly suppressed in co-culture with CD4(+) CD25(high) sorted cells in a dose-dependent manner. The mechanism of suppression by the CD4(+) CD25(high) cell population is mediated by close contact as well as interleukin (IL)-10 and transforming growth factor-beta1 (TGF-beta1) and probably other factors. In addition, we studied the in vitro induction of CD4(+) Treg and their characteristics compared to those of freshly isolated CD4(+) Treg cells. Upon stimulation with a combination of concanavalin A, TGF-beta1 and IL-2, CD4(+) CD25(+) T cells which express FoxP3 and have suppressive capability were induced from CD4(+) CD25(-) cells. The induced CD4(+) CD25(high) express higher levels of IL-10 and TGF-beta1 mRNA compared to the freshly isolated ones. Thus, in horses as in man, the circulating CD4(+) CD25(high) subpopulation contains natural Treg cells and functional Treg can be induced in vitro upon appropriate stimulation. Our study provides the first evidence of the regulatory function of CD4(+) CD25(+) cells in horses and offers insights into ex vivo manipulation of Treg cells.

Suppression des allergischen Asthmas durch regulatorische T-Zellen: Mechanismen und potenzielle therapeutische Ans��tze

Das allergische Asthma ist eine weit verbreitete, immunologische Erkrankung, deren Pr��valenz in den vergangenen 20 Jahren vor allem in industrialisierten Regionen drastisch zugenommen hat. Trotz intensiver Forschung und Entwicklung medikament��ser Therapien steigt die Zahl der Patienten stetig an. Charakteristisch f��r diese Erkrankung sind entz��ndliche Ver��nderungen in der Lunge, erh��hte Atemwegs��berempfindlichkeit (AHR), Mukusproduktion und in chronischen F��llen auch Atemwegsobstruktion. Bei der Entstehung des allergischen Asthmas wird ein anf��lliges Individuum durch die Inhalation eines normalerweise unsch��dlichen, in der Umwelt vorkommenden Antigens (Allergen) sensibilisiert, wodurch im K��rper eine eigentlich unangebrachte Immunreaktion in Gang gesetzt wird. CD4+ T-Lymphozyten und ganz besonders die Subpopulationen der T-Helfer 1 (Th1) und Th2 Zellen spielen in dem Prozess eine zentrale Rolle. Obwohl ein Gro��teil der Asthmatiker mit einer Atemwegseosinophilie und erh��hter Expression der Th2-typischen Zytokine IL-4 und IL-13 ein Th2-typisches Krankheitsbild aufweisen, wurden weitere Asthmaph��notypen identifiziert. Vornehmlich in Patienten, die an schwerem Asthma leiden, sind dominierende Neutrophilie und erh��hte Mengen IFN-�� in den Atemwegen nachweisbar, was auf eine Th1-gesteuerte Immunreaktion hindeutet. Eine effektive, heilende Therapie des Asthmas wurde bislang nicht entwickelt. Die Inhibition der T-Zellantwort etwa durch Applikation allergenspezifischer, regulatorischer T-Zellen (Tregs) gilt als ein vielversprechender, aber nicht vollst��ndig erforschter Ansatz zur Kontrolle der Krankheitssymptome. In diesem Zusammenhang wurden in der vorliegenden Arbeit die Mechanismen und Effekte nat��rlich vorkommender CD4+CD25+Foxp3+ regulatorischer T-Zellen (nTregs) auf eine Th1 bzw. Th2-induzierte allergische Atemwegserkrankung untersucht. Anhand eines adoptiven Zelltransfermodells unter Einsatz lymphozytendefizienter Rag2-/- M��use konnte gezeigt werden, dass sowohl Th1 als auch Th2 Zellen, kombiniert mit mehrfacher, inhalativer Allergenprovokation, eine erh��hte AHR induzieren. W��hrend der Transfer allergenspezifischer Th2 Zellen eine Eosinophilie in der bronchoalveol��ren Lavage (BAL) und vermehrte Mukusproduktion in den Atemwegen hervorrief, war in Th1-transferierten Tieren zwar eine massive Infiltration neutrophiler Granulozyten zu beobachten, eine Becherzellmetaplasie mit vermehrten, mukusproduzierenden Atemwegsepithelzellen blieb allerdings aus. In vitro und in vivo waren voraktivierte nTregs (preTregs) nur eingeschr��nkt in der Lage, die Th2-gesteuerte Atemwegserkrankung zu inhibieren. Im Gegensatz dazu konnten die Th1-Effektorfunktionen in vitro und die Th1-induzierte AHR und Atemwegsentz��ndung in vivo durch preTregs effektiv gehemmt werden, was auf eine unterschiedliche Empfindlichkeit der Th-Subpopulationen weist. Innerhalb der nTreg-vermittelten Suppression wird der sekund��re Botenstoff cAMP auf die zu supprimierende Zelle ��bertragen und f��hrt zur Hemmung von Proliferation und Zytokinproduktion. Dass dieser Mechanismus nicht nur in vitro, sondern auch in der Suppression der Th2-gesteuerten allergischen Atemwegserkrankung eine Rolle spielt, konnte durch die St��rung des intrazellul��ren cAMP-Abbaus mittels PDE4-Inhibitoren verdeutlicht werden. Sowohl die prophylaktische, als auch die therapeutische Applikation der PDE4-Inhibitoren verst��rkte den regulativen Effekt der nTregs auf AHR und Entz��ndung, korrelierend mit erh��hten, zytosolischen cAMP-Konzentrationen in den Th2 Zellen der Lunge. Trotz des Fortschritts in der Isolation und In vitro-Expansion humaner nTregs ist die Ausbeute an Zellen ��u��erst limitiert und die ��bertragbarkeit gr����erer Zellmengen nicht zuletzt aufgrund von hohem Kontaminationsrisiko w��hrend mehrt��giger In vitro-Expansion fragw��rdig. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass eine Behandlung mit dem PDE4-Inhibitor die suppressive Kapazit��t der allergenspezifischen nTregs deutlich erh��hte. Den nTreg-vermittelten Suppressionsmechanismus durch den Einsatz von Pharmazeutika zu unterst��tzen bietet einen viel versprechenden und realistischen Ansatz zur Therapie des allergischen Asthmas.

Die Rolle regulatorischer T-Zellen im experimentellen allergischen Asthma

Im ersten Teil der Dissertation wurde in einem experimentellen Asthmamodell demonstriert, dass die Signaltransduktion ��ber IL-6 das Gleichgewicht zwischen Effektorzellen und regulatorischen T-Zellen durch verschiedene Rezeptorkomponenten kontrolliert. Hierbei zeigte sich, dass speziell das IL-6 Trans-Signaling ��ber den sIL-6R die TH2 Cytokinproduktion steuert. Dagegen f��hrt die Blockade des mIL-6R zur Expansion regulatorischer T-Zellen mit suppressiven Eigenschaften. Diese CD4+CD25+ Tregs induzieren au��erdem IFN gamma produzierende CD4+ T-Zellen in der Lunge und verbessern daneben die AHR. Im ��berblick konnte in der vorliegenden Dissertation demonstriert werden, dass IL-6 die Balance zwischen der Funktion von Effektorzellen und regulatorischen T-Zellen in der Lunge ��ber unterschiedliche Wege kontrolliert, dem sIL-6R und dem mIL-6R. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die lokale Blockade der IL-2R alpha- und IL-2R beta-Kette untersucht. Hier konnte gezeigt werden, dass die Blockade der IL-2R beta-Kette zur Verbesserung der AHR als auch der Rekrutierung eosinophiler Granulozyten in den Atemwegen f��hrt. Beide Blockaden f��hren zur Reduktion der TH2 Cytokine IL-4 und IL-5, wohingegen IL-13 nur nach Blockade der IL-2R beta-Kette vermindert sezerniert wird. In diesem Zusammenhang wurde auch die Rolle CD4+CD25+ regulatorischer T-Zellen untersucht, wobei eine Induktion dieser Population in den Lymphknoten nach Blockade der IL-2R beta-Kette nachgewiesen werden konnte. Die Blockade der IL-2R beta-Kette wirkt sich positiv auf experimentelle Asthmastudien aus und stellt somit ein m��gliches therapeutisches Potential dar, erfordert aber teilweise noch weitere Untersuchungen.

Funktionelle Charakterisierung der Protein-Kinase CK2 in der Suppression Th2-vermittelter Immunantworten durch regulatorische T-Zellen

Regulatorische T-Zellen (Tregs) leisten durch ihre suppressiven Eigenschaften einen essenziellen Beitrag zur Aufrechterhaltung der immunologischen Toleranz. Sie verhindern sch��dliche Immunreaktionen gegen Autoantigene, kommensale Bakterien, sowie harmlose Nahrungsmittel-bestandteile. Gleichzeitig gew��hrleisten sie die Entwicklung effektiver Immunantworten gegen eindringende Pathogene, wie z.B. Parasiten, Bakterien und Viren. Damit haben Tregs direkten Einfluss auf das Gleichgewicht zwischen Immunit��t und Toleranz. Fehler in der suppressiven Funktionsweise von Tregs beg��nstigen daher auf der einen Seite die Entstehung zahlreicher autoimmuner Erkrankungen und Allergien. Auf der anderen Seite k��nnen Tregs Immunreaktionen bei chronischen Infektionen reduzieren, sowie die Entstehung effektiver Immunantworten gegen Tumore hemmen. Ihre Beteiligung an der ��tiologie all dieser Krankheiten macht Tregs zu einem bedeutenden potenziellen Zielobjekt, um diese Krankheiten effektiv zu therapieren. Die Erweiterung des Grundwissens um die molekularen Mechanismen der Treg-vermittelten Suppression ist daher ein notwendiger Schritt bei der Entwicklung Treg-basierter Theraphieans��tze. 2003 konnte mit Foxp3 ein Transkriptionsfaktor identifiziert werden, der ma��geblich die suppressiven Funktionen von Tregs steuert. Um weiteren Einblick in die der Suppression zugrundeliegenden Signalwege zu erhalten, wurde im Institut f��r Immunologie ein komparativer Kinomarray durchgef��hrt, anhand dessen die Casein Kinase 2 (CK2) als eine der aktivsten Kinasen in Tregs identifiziert wurde (Daten freundlicherweise von Prof. Dr. Tobias Bopp bereitgestellt). rnBasierend auf den Ergebnissen des Kinomarrays wurde in dieser Arbeit die Funktion der CK2 in Tregs untersucht. Dabei konnte in in vitro Experimenten die Treg-vermittelte Suppression durch den pharmakologische CK2 Inhibitor DMAT aufgehoben werden. Weil derartige Inhibitoren jedoch nicht absolut spezifisch die Aktivit��t nur einer Kinase supprimieren, wurden au��erdem M��use mit konditionalem ���knockout��� der CK2�� Untereinheit spezifisch in Tregs gekreuzt (CK2��Treg-/- M��use). Die Analyse dieser Tiere offenbarte eine essenzielle Beteiligung der CK2 an den suppressiven Funktionen von Tregs. So entwickeln CK2��Treg-/- M��use mit zunehmendem Alter Splenomegalien und Lymphadenopathien, von denen in besonderem Ma��e die Mukosa-assoziierten Lymphknoten betroffen sind. Eine Analyse des Aktivierungsstatus der T-Zellen in den Tieren konnte zudem einen erh��hten Anteil sogenannter Effektor-Ged��chtnis T-Zellen aufdecken, die charakteristische Merkmale eines Th2 Ph��notyps zeigten. Erh��hte Titer des Antik��rperisotyps IgE in den Seren von CK2��Treg-/- M��usen suggerieren zus��tzlich eine fehlerhafte Suppression speziell Th2-vermittelter Immunantworten durch CK2��-defiziente Tregs. In Th2-vermittelten Asthma Experimenten in vivo konnte der Verdacht der fehlerhaften Kontrolle von Th2-Antwort best��tigt werden, wobei zus��tzlich aufgedeckt wurde, dass bereits unbehandelte CK2��Treg-/- M��use Zeichen einer Entz��ndungsreaktion in der Lunge aufweisen. Bei der Suche nach den molekularen Ursachen der fehlerhaften Suppression Th2-vermittelter Immunantworten durch CK2��-defiziente Tregs konnten zwei m��gliche Erkl��rungsans��tze gefunden werden. Zum einen zeigen CK2��-defiziente Tregs eine verringerte Expression von Foxp3, was, in Analogie zu Ergebnissen der Gruppe von R. Flavell (Wang Y.Y. Nature. 445, 766-770 (2007)), zu einer Konversion von Tregs zu Th2 Zellen und damit zur Entstehung eines Th2-basierten, autoimmunen Ph��notyps f��hrt. Des Weiteren weisen CK2��-defiziente Tregs eine reduzierte Expression des Transkriptionsfaktors IRF4 auf, der in Tregs entscheidend f��r die Kontrolle Th2-basierter Immunreaktionen ist (Zheng Y. Nature. 19; 351-356 (2009)). Die dargelegten Ergebnisse identifizieren die CK2 damit als Kinase, die entscheidend an der Treg-vermittelten Suppression speziell Th2-basierter Immunantworten beteiligt ist. Demnach k��nnten pharmakologische CK2 Inhibitoren beispielsweise dazu eingesetzt werden, um die Treg-vermittelte Suppression im Rahmen chronischer Parasiten-Infektionen aufzuheben. Die in CK2��Treg-/- M��usen beobachtete Pr��valenz der Funktion der CK2 f��r Mukosa-assoziierte Organe stellt dabei einen zus��tzlichen Vorteil dar, weil systemische Nebenwirkungen, die durch die Blockade der Treg-vermittelte Suppression entstehen, zumindest in nicht-Mukosa-assoziierten Geweben nicht zu erwarten sind.rn

CD4+ CD25+ regulatory T cells control T helper cell type 1 responses to foreign antigens induced by mature dendritic cells in vivo.

Recent evidence suggests that in addition to their well known stimulatory properties, dendritic cells (DCs) may play a major role in peripheral tolerance. It is still unclear whether a distinct subtype or activation status of DC exists that promotes the differentiation of suppressor rather than effector T cells from naive precursors. In this work, we tested whether the naturally occurring CD4+ CD25+ regulatory T cells (Treg) may control immune responses induced by DCs in vivo. We characterized the immune response induced by adoptive transfer of antigen-pulsed mature DCs into mice depleted or not of CD25+ cells. We found that the development of major histocompatibility complex class I and II-restricted interferon gamma-producing cells was consistently enhanced in the absence of Treg. By contrast, T helper cell (Th)2 priming was down-regulated in the same conditions. This regulation was independent of interleukin 10 production by DCs. Of note, splenic DCs incubated in vitro with Toll-like receptor ligands (lipopolysaccharide or CpG) activated immune responses that remained sensitive to Treg function. Our data further show that mature DCs induced higher cytotoxic activity in CD25-depleted recipients as compared with untreated hosts. We conclude that Treg naturally exert a negative feedback mechanism on Th1-type responses induced by mature DCs in vivo.

HBHA-specific CD4+, CD8+ and CD4+CD25+FOXP3+ T cells as biomarkers for protection and disease in human tuberculosis

info:eu-repo/semantics/nonPublished

CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T-cells and the development of active tuberculosis in humans

info:eu-repo/semantics/published

Implication de lymphocytes T r��gulateurs CD4+CD25+FOXP3+ dans la tuberculose active chez l���homme

info:eu-repo/semantics/nonPublished

IL-12R���2 promotes the development of CD4+CD25+ regulatory T cells

We have previously shown that mice lacking the IL-12-specific receptor subunit ��2 (IL-12R��2) develop more severe experimental autoimmune encephalomyelitis than wild-type (WT) mice. The mechanism underlying this phenomenon is not known; nor is it known whether deficiency of IL-12R��2 impacts other autoimmune disorders similarly. In the present study we demonstrate that IL-12R��2-/- mice develop earlier onset and more severe disease in the streptozotocin-induced model of diabetes, indicating predisposition of IL-12R��2-deficient mice to autoimmune diseases. T cells from IL-12R��2-/- mice exhibited significantly higher proliferative responses upon TCR stimulation. The numbers of naturally occurring CD25+CD4+ regulatory T cells (Tregs) in the thymus and spleen of IL-12R��2-/- mice were comparable to those of WT mice. However, IL-12R��2-/- mice exhibited a significantly reduced capacity to develop Tregs upon stimulation with TGF-��, as shown by significantly lower numbers of CD25+CD4+ T cells that expressed Foxp3. Functionally, CD25+CD4+ Tregs derived from IL-12R��2-/- mice were less efficient than those from WT mice in suppressing effector T cells. The role of IL-12R��2 in the induction of Tregs was confirmed using small interfering RNA. These findings suggest that signaling via IL-12R��2 regulates both the number and functional maturity of Treg cells, which indicates a novel mechanism underlying the regulation of autoimmune diseases by the IL-12 pathway. Copyright �� 2008 by The American Association of Immunologists, Inc.