Estudo do potencial biotecnológico de utilização do gene codificador da Galactinol Sintase (GolS) como marcador do processo de ecodormência de gemas em macieira.

A macieira (Malus domestica Borkh.), uma das frutíferas mais importantes de regiões de clima temperado, é caracterizada pela cessação de crescimento visível durante o inverno, processo chamado de dormência. A dormência de gemas permite que a planta sobreviva a baixas temperaturas e é determinante para a eficiência na produção de maçãs. Entender o processo de dormência, assim como seus mecanismos de controle, tornou-se fundamental para contornar as perdas na produção, seja por meio de técnicas de manejo ou pela geração de variedades comerciais melhores adaptadas às regiões de cultivo.

Extração de DNA de machos e fêmeas adultos de Haemonchus contortus.

2015

Using linear algebra for protein structural comparison and classification.

In this article, we describe a novel methodology to extract semantic characteristics from protein structures using linear algebra in order to compose structural signature vectors which may be used efficiently to compare and classify protein structures into fold families. These signatures are built from the pattern of hydrophobic intrachain interactions using Singular Value Decomposition (SVD) and Latent Semantic Indexing (LSI) techniques. Considering proteins as documents and contacts as terms, we have built a retrieval system which is able to find conserved contacts in samples of myoglobin fold family and to retrieve these proteins among proteins of varied folds with precision of up to 80%. The classifier is a web tool available at our laboratory website. Users can search for similar chains from a specific PDB, view and compare their contact maps and browse their structures using a JMol plug-in.

Filogenia molecular, evolução de características morfológicas, variabilidade populacional, biogeografia e metabolômica comparativa: rumo a uma biologia integrativa para o gênero Mycale Gray, 1867 (Porifera)

O objetivo desta tese foi abordar a diversidade de Mycale Gray, 1867 sob um ponto de vista multidisciplinar. No Capítulo 1 foram realizadas reconstruções filogenéticas supra- e subgenéricas com base em dados moleculares, utilizando os marcadores 16S, 28S e cox1, a fim de estabelecer uma hipótese evolutiva para o grupo. No capítulo 2 são realizadas reconstruções ancestrais das características morfológicas do gênero dada a hipótese filogenética estabelecida no capítulo anterior, além de determinar limites na variação morfológica das anisoquelas tipo I por meio de análises morfométricas e estimar o padrão evolutivo das dimensões dos principais tipos espiculares de Mycale. No Capítulo 3 foi estimada a variabilidade genética do complexo Mycale (Carmia) microsigmatosa Arndt, 1927 por meio de análise de haplótipos do gene 16S do RNA ribossomal mitocondrial, além de correlacionar a sua variabilidade morfológica, estimada por meio de dimensões espiculares, com fatores genéticos e geográficos. No Capítulo 4 foram estabelecidas hipóteses biogeográficas para Mycale por meio de análise de três itens tendo como base as reconstruções filogenéticas moleculares e também foram determinados padrões de distribuição geográfica do gênero a partir da ocorrência de espécies em áreas de endemismo. Por fim, no Capítulo 5, os perfis metabólicos de três espécies do gênero Mycale foram obtidos por espectroscopia de ressonância magnética nuclear dos núcleos de hidrogênio (RMN 1H) e comparados estatisticamente, além de suas similaridades terem sido contrastadas com suas relações filogenéticas e suas diferenças entre grupos de indivíduos metabolicamente relacionados determinadas.

Filodinâmica do vírus da tristeza dos citrinos: epidemiologia molecular e biologia evolutiva

O Citrus tristeza virus (CTV), responsável por várias doenças em citrinos, é um dos maiores condicionantes da citricultura a nível mundial. Existem diversos isolados de CTV com diferentes características biológicas e moleculares, sendo que os sintomas causados pelo vírus dependem essencialmente do isolado viral e da combinação variedade/porta-enxerto. A implementação de medidas de controlo da doença depende, em grande parte, do tipo de isolados presentes numa dada região. No Capítulo 2, efetuou-se uma análise comparativa entre dois métodos de tipificação de isolados de CTV e verificou-se que a caracterização por PCR assimétrico-ELISA, que considera a existência de sete grupos, é mais adequada à descrição da estrutura genética de CTV. Estes resultados foram complementados com o estudo da dinâmica de colonização de cada grupo filogenético através de um imuno-ensaio in situ (Capítulo 3). Os resultados obtidos sugerem que os isolados de CTV diferem na quantidade de células infetadas e que essa diferença parece estar relacionada com a severidade do isolado. No Capítulo 4, o estudo da variabilidade genómica da região 3’ terminal permitiu verificar que a estrutura de grupos obtida para o gene da proteína da cápside (CP) é extensível a toda a região 3’ terminal que contém os genes mais fortemente implicados na interação com o hospedeiro. A estabilidade da estrutura genética nesta região foi também inferida a partir da pesquisa de eventos de recombinação. Os resultados sugerem uma baixa frequência de recombinação entre isolados de CTV, mesmo em isolados contendo mistura de haplótipos e mantidos há mais de 12 anos no mesmo hospedeiro. Adicionalmente, foi estimada a taxa de evolução de CTV através de um método estatístico Bayesiano (Capítulo 5). Para tal, foram usadas sequências do gene da CP de isolados de diversas regiões do mundo, pertencentes a diferentes grupos filogenéticos e obtidas entre 1990 e 2010. A taxa média de evolução estimada foi de 1,58 X 10-4 substituições nucleotídicas / ano. No geral, os resultados destes dois capítulos mostram que os isolados de CTV mantêm uma elevada estabilidade genética ao longo do tempo. Finalmente, no Capítulo 6, foi estudada a situação epidemiológica de CTV em Portugal continental a partir de isolados de CTV recolhidos no campo, onde se verificou que a maioria das árvores infetadas era composta por isolados de CTV pertencentes ao grupo M, ou seja isolados considerados suaves e que não provocam sintomas severos.

Biology and Molecular Markers of Malignant Gonadal Germ Cell Tumors

Germ cell tumors occur both in the gonads of both sexes and in extra-gonadal sites during adoles-cence and early adulthood. Malignant ovarian germ cell tumors are rare neoplasms accounting for less than 5% of all cases of ovarian malignancy. In contrast, testicular cancer is the most common malignancy among young males. Most of patients survive the disease. Prognostic factors of gonadal germ cell tumors include histology, clinical stage, size of the primary tumor and residua, and levels of tumor markers. Germ cell tumors include heterogeneous histological subgroups. The most common subgroup includes germinomas (ovarian dysgerminoma and testicular seminoma); other subgroups are yolk sac tumors, embryonal carcinomas, immature teratomas and mixed tumors. The origin of germ cell tumors is most likely primordial germ cells. Factors behind germ cell tumor development and differentiation are still poorly known. The purpose of this study was to define novel diagnostic and prognostic factors for malignant gonadal germ cell tumors. In addition, the aim was to shed further light into the molecular mechanisms regulating gonadal germ cell tumorigenesis and differentiation by studying the roles of GATA transcription factors, pluripotent factors Oct-3/4 and AP-2γ, and estrogen receptors. This study revealed the prognostic value of CA-125 in malignant ovarian germ cell tumors. In addition advanced age and residual tumor had more adverse outcome. Several novel markers for histological diagnosis were defined. In the fetal development transcription factor GATA-4 was expressed in early fetal gonocytes and in testicular carcinoma precursor cells. In addition, GATA-4 was expressed in both gonadal germinomas, thus it may play a role in the development and differentiation of the germinoma tumor subtype. Pluripotent factors Oct-3/4 and AP-2γ were expressed in dysgerminomas, thus they could be used in the differential diagnosis of the germ cell tumors. Malignant ovarian germ cell tumors expressed estrogen receptors and their co-regulator SNURF. In addition, estrogen receptor expression was up-regulated by estradiol stimulation. Thus, gonadal steroid hormone burst in puberty may play a role in germ cell tumor development in the ovary. This study shed further light in to the molecular pathology of malignant gonadal germ cell tumors. In addition, some novel diagnostic and prognostic factors were defined. This data may be used in the differential diagnosis of germ cell tumor patients.

Molecular determinants of Kv7.2 surface expression

222 p. : il.

Molecular ecology of european mustelids: Unraveling evolutionary and ecological patterns in Martes and Lutra genera

208 p.

Cellular and molecular responses of zebrafish to legacy and emerging pollutants: the specific cases of PAHs and metal oxide nanoparticles

270 p.

Modelagem molecular da proteína small heat shock de Xylella fastidiosa.

Este documento descreve o modelo molecular da proteína XF2234 e a análise preliminar da sua estrutura. O modelo foi construído por modelagem por homologia (ou modelagem comparativa) com a estrutura cristalográfica de uma proteína small heat shock de Triticum aestivum (trigo). A análise da estrutura tridimensional da proteína XF2234 tem o objetivo de contribuir para aumentar o conhecimento sobre o papel biológico das smHSPs, necessário para o combate à CVC.

Morphobiometric and molecular characterization of Bursaphelenchus Fuchs, 1937 (Nematoda: Aphelenchoididae) species associated with Pinus pinaster Ainton in Portugal

Abstract - The genus Bursaphelenchus comprises almost 100 species mainly from the northern hemisphere, with conifers as the most important hosts. Among the various nematode species, the pine wood nematode (PWN), Bursaphelenchus xylophilus, is the casual agent of pine wilt disease (PWD), and the most important forest pest for pines worldwide, classified as an A1 quarantine organism within the European Union. In 1999 this nematode was detected for the first time in Portugal and Europa associated with maritime pine, Pinus pinaster. Following detection, a national program denominated "Programa Nacional de Luta contra o Nemátodo da Madeira do Pinheiro" (PROLUNP) was created to, among other objectives, determine the distribution of the PWN and its associated vector(s) and host(s), and therefore intensive surveys covering the entire country were conducted with thousands of wood samples and suspected insects being analyzed. This thesis presents the listing, distribution, frequency and the insects associated with Bursaphelenchus species found associated with maritime pine in Portugal, identifying and characterizing the various species by morphological, biometrical and molecular biology (ITS-RFLP and rDNA sequencing analysis) techniques. To achieve the objectives, a total of 4813 maritime pine wood samples and 3294 insects from 22 species and six families were individually analyzed. A total of nine Bursaphelenchus species were found, namely: B. antoniae, B. hellenicus, B. leoni, B. mucronatus, B. pinasteri, B. sexdentati, B. teratospicularis, B. tusciae and B. xylophilus, all of them (with the exception of B. xylophilus) being new records for Portugal. Some of the species appear to have a widespread distribution, such as B. leoni, B. teratospicularis and B. tusciae while others were very rarely found and apparently have a localized distribution range within the country, namely B. antoniae and B. mucronatus. The majority of the species is characteristic of the Mediterranean region and can also be found in countries such as Spain, Italy and Greece, reflecting the affinity of our fauna with those locations. The association of B. hellenicus and B. tusciae with maritime pine is here reported for the first time. Six of the Bursaphelenchus species were also found associated with insects, mainly from the family Scolytidae (Coleoptera). Some of these interactions were described for the first time, namely: B. hellenicus with both Ips sexdentatus and Hylurgus ligniperda, B. sexdentati with both H. ligniperda and Orthotomicus erosus and B. tusciae with H. ligniperda. The exclusive association of B. xylophilus with the cerambycid Monochamus galloprovincialis was also confirmed. The nematode's dauer juveniles were usually found in low numbers in the insect vectors (ca 10-100 per insect), although for B. xylophilus a few thousand specimens per insect were sometimes found. The location of the dauer juveniles differed according to the species, although they were more common under the elytra and wings of the adult insects. A species new to science was detected and formally described as B. antoniae, associated with Hylobius sp. (Coleoptera; Curculionidae) beetles. Morphologically, this new species is very similar to B. hylobianum, although it's distinct ITS-RFLP molecular pattern (with only the enzyme Haelll producing comparable restriction bands) and the failure of hybridization supported the two species as distinct entities. Additional phylogenetic analysis of the 18S rDNA sequence further supported the taxonomical proximity of B. antoniae with B. hylobianum. Concerning the PWN, detailed studies on the development and morphology of B. xylophilus were conducted, and comparative measurements of field-collected and laboratory-maintained populations demonstrated that nematodes from the second group displayed larger size in all morphometric parameters, which could derive from more adequate conditions of nourishment and/or temperature. Taxonomical studies on the development stages of B. xylophilus confirmed the existence of four propagative juvenile stages (J1,J2,J3 and J4), an adult stage with both sexes and two dispersal stages (jIII e jIV), with the measurements of the gonad length allowing the separation of the propagative stages. It is hoped that the acquired knowledge will be useful on future surveys of nematodes of the Bursaphelenchus genus collected from either wood material or insect vectors, and facilitate the correct distinction and identification of the various species which are now known to occur. ### Resumo - 0 género Bursaphelenchus compreende quase 100 espécies, distribuídas sobretudo nos países do hemisfério norte do globo terrestre. Embora algumas espécies já tenham sido detectadas em plantas herbáceas, os hospedeiros vegetais mais comuns deste género são as coníferas, particularmente pinheiros. 0 nemátode da madeira do pinheiro (NMP), Bursaphelenchus xylophilus, é considerado a espécie mais importante deste género uma vez que é o agente causal da doença da murchidão dos pinheiros ("pine wilt disease"). Originário dos Estados Unidos, onde não causa grande impacte, o NMP foi introduzido em alguns países da Ásia (China, Japão, Coreia e Taiwan) e mais recentemente na Europa (Portugal). Nestas regiões é responsável pela destruição de milhares de hectares de coníferas, assumindo uma elevada importância económica. Em Portugal, depois da sua detecção em 1999, associado a Pinus pinaster, foi implementado um programa nacional "Programa Nacional de Luta contra o Nemátodo da Madeira do Pinheiro" (PROLUNP) que permitiu determinar a área afectada pela praga (a sul do rio Tejo, península de Setúbal) bem como definir e implementar estratégias de controlo e prevenção da disseminação do NMP a outras zonas de Portugal. Recentemente, em Junho de 2008, foi confirmada a presença de B. xylophilus em outras regiões de Portugal levando as autoridades oficiais a definir todo o território continental como zona afectada e de restrição. As prospecções intensivas realizadas nos últimos anos incluíram a recolha e análise de milhares de amostras de madeira de pinheiro bem como de insectos associados ao pinheiro bravo conduzindo à identificação de várias espécies de Bursaphelenchus. Assim, os estudos conduzidos neste trabalho tiveram como objectivos efectuar uma caracterização morfológica, biométrica e molecular das espécies associadas a P. pinaster em Portugal bem como a sua distribuição geográfica e abundância. Os estudos biométricos foram realizados com populações extraídas directamente do meio natural. Foi ainda realizada uma pesquisa que permitiu identificar os insectos a que estão associadas essas espécies, os seus possíveis vectores. Foram analisadas no total 4813 amostras de P. pinaster e 3294 insectos (22 espécies pertencentes a seis famílias diferentes). Foram identificadas um total de nove espécies: B. antoniae n. sp., B. hellenicus, B. leoni, B. mucronatus, B. pinasteri, B. sexdentati, B. teratospicularis, B. tusciae e B. xylophilus. Foram realizados estudos morfológicos e biométricos de todas as espécies com excepção de B. mucronatus; o reduzido número de exemplares encontrados em apenas uma amostra foram utilizados para efectuar o diagnóstico molecular desta espécie (ITS-RFLP). Apesar de ter havido, sempre que possível, a confirmação molecular, na maioria dos casos a caracterização morfológica e biométrica permitiu a correcta identificação das espécies. Contudo, foi imprescindível a análise molecular em algumas amostras, nomeadamente para a identificação de B. xylophilus e B. sexdentati; dada a grande semelhança entre B. xylophilus e B. mucronatus e tendo sido encontradas algumas populações de B. xylophilus que possuíam fêmeas com cauda mucronada, foi necessária a realização da confirmação molecular. Com excepção de B. xylophilus, todas as outras espécies foram reportadas pela primeira vez em Portugal. Juntamente com B. xylophilus, B. pinasteri foi a espécie encontrada nas amostras de madeira de pinheiro com maior frequência. Algumas destas espécies como B. leoni, B. teratospicularis e B. tusciae foram reportadas em diferentes localidades do norte, centro e sul de Portugal, apresentando uma vasta distribuição geográfica; este resultado está em consonância com a forte associação destas espécies a climas mediterrânicos tal como acontece em Espanha, França, Itália e Grécia. Em oposição, espécies como B. antoniae e B. mucronatus foram encontradas apenas numa ocasião na região centro (Leiria) e norte (Figueira da Foz) do país, respectivamente. Bursaphelenchus mucronatus é igualmente pouco frequente em Espanha onde ocorre sobretudo na região norte, na Galiza. Esta espécie preferirá climas mais frios, ocorrendo com uma maior frequência nas regiões de latitude norte; esta análise é corroborada pela presença constante em países como Alemanha, Finlândia, França, Noruega, Rússia e Suécia. A nível mundial são descritas neste trabalho pela primeira vez as associações das espécies B. hellenicus e B. tusciae ao hospedeiro vegetal P. pinaster.

Molecular study of cell degeneration and evolution induced by mRNA mistranslation

As proteínas existentes nas células são produzidas pelo mecanismo de tradução do mRNA, no qual a informação genética contida nos genes é descodificada em cadeias polipeptídicas. O código genético, que define as regras de descodificação do genoma, minimiza os erros de tradução do mRNA, garantindo a síntese de proteínas com elevada fidelidade. Esta é essencial para a estabilidade do proteoma e para a manutenção e funcionamento dos processos celulares. Em condições fisiológicas normais, os erros da tradução do mRNA ocorrem com frequências que variam de 10-3 a 10-5 erros por codão descodificado. Situações que aumentam este erro basal geralmente estão associadas ao envelhecimento, stresse e a doenças; no entanto, em certos organismos o código genético é traduzido naturalmente com elevado erro, indicando que a síntese de proteínas aberrantes pode de algum modo ser vantajosa. A fim de estudar a resposta celular aos erros de tradução do mRNA, construímos leveduras que incorporam serina no proteoma em resposta a um codão de leucina, usando a expressão constitutiva de um tRNASer mutante. Este fenómeno genético artificial provocou uma forte diminuição da esporulação, da viabilidade e da eficiência de mating, afectando imensamente a reprodução sexual da levedura. Observou-se também uma grande heterogeneidade no tamanho e na forma das células e elevada instabilidade genómica, com o aparecimento de populações poliplóides e aneuplóides. No sentido de clarificar as bases celulares e moleculares daqueles fenótipos e compreender melhor a biologia do erro de tradução do mRNA, construímos também células de levedura que inserem serina em resposta a um codão de leucina de modo indutível e controlado. Utilizaram-se perfis de mRNA total e de mRNA associado a polissomas para elucidar a resposta celular ao erro de tradução do mRNA. Observou-se a indução de genes envolvidos na resposta ao stresse geral, stresse oxidativo e na unfolded protein response (UPR). Um aumento significativo de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e um forte impacto negativo na capacidade das células pós-mitóticas re-iniciarem o crescimento foram também observados. Este fenótipo de perda de viabilidade celular foi resgatado por scavangers de ROS, indicando que o stresse oxidativo é a principal causa de morte celular causada pelos erros de tradução. Este estudo levanta a hipótese de que o stresse oxidativo e a acumulação de ROS, ao invés do colapso súbito do proteoma, são as principais causas da degeneração celular e das doenças humanas associadas aos erros de tradução do genoma. ABSTRACT: Proteins are synthesized through the mechanism of translation, which uses the genetic code to transform the nucleic acids based information of the genome into the amino acids based information of the proteome. The genetic code evolved in such a manner that translational errors are kept to a minimum and even when they occur their impact is minimized by similar chemical properties of the amino acids. Protein synthesis fidelity is essential for proteome stability and for functional maintenance of cellular processes. Indeed, under normal physiological conditions, mistranslation occurs at frequencies that range from 10-3 to 10-5 errors per codon decoded. Situations where this basal error frequency increases are usually associated to aging and disease. However, there are some organisms where genetic code errors occur naturally at high level, suggesting that mRNA mistranslation can somehow be beneficial. In order to study the cellular response to mRNA mistranslation, we have engineered single codon mistranslation in yeast cells, using constitutive expression of mutant tRNASer genes. These mistranslating strains inserted serines at leucine-CUG sites on a proteome wide scale due to competition between the wild type tRNALeu with the mutant tRNASer. Such mistranslation event decreased yeast sporulation, viability and mating efficiencies sharply and affected sexual reproduction strongly. High heterogeneity in cell size and shape and high instability in the genome were also observed, with the appearance of some polyploid or aneuploid cell populations. To further study the cellular and molecular basis of those phenotypes and the biology of mRNA mistranslation, we have also engineered inducible mRNA misreading in yeast and used total mRNA and polysome associated mRNA profiling to determine whether codon misreading affects gene expression. Induced mistranslation up-regulated genes involved in the general stress response, oxidative stress and in the unfolded protein response (UPR). A significant increase in reactive oxygen species (ROS) and a strong negative impact on the capacity of post-mitotic cells to re-initiate growth in fresh media were also observed. This cell viability phenotype was rescued by scavengers of ROS, indicating that oxidative stress is the main cause of cell death caused by mRNA mistranslation. This study provides strong support for the hypothesis that oxidative stress and ROS accumulation, rather than sudden proteome collapse or major proteome disruption, are the main cause of the cellular degeneration observed in human diseases associated mRNA mistranslation.

A revision of the polychaete family Nephtyidae, based on morphological and molecular data

A família Nephtyidae é uma das mais frequentes em habitats costeiros e marinhos de todo o mundo. São organismos errantes típicos de sedimentos arenosos e lodosos, ocorrendo frequentemente no domínio costeiro até 100 m de profundidade, e mais raramente em profundidades batiais e abissais. As primeiras espécies descritas foram o Nephtys caeca (Fabricius, 1780) e o N. ciliata (O. F. Müller, 1789), ambas atribuídas inicialmente ao género Nereis e posteriormente transferidas para o género Nephtys por Savigny, em 1818. A família Nephtyidae foi criada em 1851 por Grube para o género Nephtys Cuvier, 1817. No âmbito desta tese é feito um estudo taxonómico e filogenético da família Nephtyidae. O estudo filogenético inclui dados morfológicos e moleculares de 24 taxa representantes dos cinco géneros da família, Nephtys Cuvier, 1817, Aglaophamus Kinberg, 1866, Micronephthys (Friedrich, 1939), Inermonephtys Fauchald, 1967 e Dentinephtys Imajima e Takeda, 1987. A análise evidenciou dois grandes grupos correspondentes aos dois principais géneros, Aglaophamus e Nephtys. Duas espécies do género Nephtys (N. pulchra e N. australiensis) são transferidas para o género Aglaophamus, e consequentemente são propostas novas diagnoses para os géneros. O género Dentinephtys é sinonimizado com Nephtys e um novo género, Bipalponephtys, é descrito para acomodar as espécies Nephtys cornuta, N. danida e Micronephthys neotena. As relações filogenéticas entre os géneros são discutidas. Do estudo taxonómico resultou a revisão da família Nephtyidae para o Sul da Europa (entre o Canal da Mancha e o Mediterrâneo), com a descrição de uma nova espécie, Inermonephtys foretmontardoi. A espécie Micronephthys maryae é sinonimizada com M. stammeri. Para cada espécie são incluídas notas sobre a sua ecologia bem como a distribuição geográfica e batimétrica. São propostas novas diagnoses para os géneros do Sul da Europa bem como uma chave de identificação taxonómica para as espécies desta região. Após uma exaustiva revisão bibliográfica da família, e da observação de material museológico relativo a 44 espécies, foi compilada uma lista completa para a família de 128 espécies, distribuídas por cinco géneros (57 Nephtys, 53 Aglaophamus, sete Micronephthys, oito Inermonephtys e três Bipalponephtys), na qual são incluídas sinonímias e considerações taxonómicas para cada espécie. A espécie Nephtys serrata é sinonimizada com N. serratifolia. São apresentados as distribuições geográficas e batimétricas das diferentes espécies e notas sobre o seu habitat. São também incluídas tabelas de identificação com as principais características taxonómicas das espécies. O valor diagnóstico dos caracteres morfológicos é discutido. Vários problemas taxonómicos são realçados, indicando a necessidade de revisões adicionais para 23 espécies. Este trabalho realça a existência de vários problemas taxonómicos e filogenéticos dentro da família Nephtyidae, podendo ser considerado como a base para estudos futuros. Análises filogenéticas adicionais incluindo dados morfológicos e moleculares de um maior número de espécies vão certamente conduzir a uma melhor avaliação do estatuto e relações entre os géneros dentro da família.

Caracterização molecular de cianobactérias de sistemas aquáticos portugueses

As alterações climáticas favorecem a ocorrência global de episódios de precipitação e seca extremas, colocando em risco a qualidade da água em sistemas aquáticos usados consumo humano ou recreação. O fenómeno de seca, em particular, será mais frequente e severo, alterando toda a hidrodinâmica dos sistemas aquáticos e, consequentemente, a ecologia das comunidades aquáticas. A ocorrência de blooms de cianobactérias intensificarse- á sob este novo cenário climático. Em Portugal, estudos parcelares em rios e barragens têm sido realizados com enfoque em cianobactérias tóxicas e outras bactérias patogénicas, mas não há trabalhos publicados acerca da composição da comunidade bacteriana (CCB). O presente trabalho pretende colmatar esta falha, com particular atenção para a ocorrência de blooms cianobacterianos, em vários sistemas aquáticos portugueses lóticos e lênticos. Este objectivo foi alcançado utilizando metodologias moleculares, como a técnica rDNA 16S-DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), independente do cultivo, e a sequenciação. Dados ambientais foram também determinados para correlacionar com as variações sazonais ou espaciais da diversidade da CCB. O impacto da seca na distribuição espacial da CCB foi também investigado. A lagoa da Vela é um caso de estudo especial, devido à vasta documentação sobre a ocorrência de blooms de cianobactérias durante os últimos anos, e várias estirpes isoladas de blooms foram estudadas em mais detalhe. Os resultados mostraram, em geral, perfis de DGGE típicos de verão vs. inverno nos sistemas aquáticos estudados. Nos sistemas lênticos, os filótipos dominantes afiliaram com Cyanobacteria (formas unicelulares, coloniais e filamentosas), eucariotas fototróficos e Actinobacteria, enquanto nos rios, Bacteroidetes e Betaproteobacteria foram dominantes. Nos sistemas lênticos, os factores mais significativos para a sazonalidade da CCB incluíram a temperatura da água, a condutividade e a clorofila a, apesar da variação extrema dos níveis de precipitação, sugerindo que a BCC poderá resistir a mudanças severas causadas pela seca. Nos rios, a sazonalidade da CCB foi principalmente definida pela temperatura e os níveis de amónia. No verão seco de 2005, as barragens do Alentejo (Sul de Portugal) mostraram similaridade na CCB, com filótipos comuns de Cyanobacteria, Actinobacteria e Alphaproteobacteria. No entanto, os perfis de DGGE sugerem filótipos ubíquos em sistemas portugueses geograficamente distantes. Na Lagoa da Vela, a seca conduziu à redução drástica do nível da água e à variação na diversidade espacial da CCB (e cianobactérias dominantes) e potencial tóxico, o que pode ter impacto directo nos utilizadores da lagoa. Os resultados também mostraram a presença de estirpes tóxicas de Microcystis na lagoa e um bloom não clonal de estirpes de Aphanizomenon aphanizomenoides, com diferentes morfótipos, genótipos e ecótipos.

Molecular diversity and transferability of integrons from wastewaters

Na evolução bacteriana, a capacidade de explorar novos ambientes e de responder a diferentes pressões selectivas deve-se principalmente à aquisição de novos genes por transferência horizontal. Integrões são elementos genéticos bacterianos que constituem sistemas naturais de captura e expressão de cassetes de genes, sendo um dos principais mecanismos bacterianos envolvidos na aquisição de resistências a antibióticos. Estudos recentes suportam a hipótese de que os ambientes naturais constituem importantes reservatórios de integrões e cassetes de genes. Uma vez que as águas residuais são descarregadas em receptores naturais, torna-se fundamental conhecer a presença e dispersão de integrões nestes ambientes, assim como a sua associação a outros elementos genéticos móveis e a genes de resistências a antibióticos. Neste trabalho, pretendeu-se avaliar a prevalência e diversidade de integrões em águas residuais de origem animal e doméstica, bem como a sua associação a plasmídeos conjugativos, usando metodologias dependentes e independentes do cultivo de microrganismos em laboratório. Os resultados obtidos sustentam assim a hipótese de que ambientes particularmente ricos em matéria orgânica, como é o caso das águas residuais, constituem ambientes propícios à presença de integrões e à ocorrência de transferência horizontal de genes de resistência a antibióticos, embora a sua prevalência e diversidade seja influenciada pelo tipo de efluente em questão. A presença de integrões em estações de tratamento de águas residuais, e em especial nos efluentes tratados, constitui assim um factor preocupante, uma vez que tal contribui para a sua disseminação e dispersão por outros ecossistemas aquáticos, nomeadamente rios e mares. Os métodos utilizados permitiram também detectar uma elevada diversidade de cassetes de genes associadas a integrões, sendo possível que algumas dessas sequências codifiquem para proteínas que desempenhem um importante papel na adaptação bacteriana às intensas pressões selectivas características deste tipo de ambientes. Assim, é possível concluir que as comunidades bacterianas presentes em águas residuais reúnem diferentes tipos de elementos geneticamente móveis que desempenham um importante papel não só na adaptação bacteriana, mas também na disseminação de determinantes genéticos de resistência para ambientes naturais. Adicionalmente, a presença de potenciais proteínas com possíveis aplicações biotecnológicas reforça a importância das águas residuais como fontes de diversidade funcional. Este trabalho incluiu também a criação e implementação da base de dados INTEGRALL, desenvolvida com o intuito de congregar informação acerca de integrões e de uniformizar a nomenclatura de cassetes de genes.