Recombinant antigen-based avidin-biotin microtiter enzyme-linked immunosorbent assay for serodiagnosis of invasive amebiasis

An immunoscreening approach was used to isolate a strongly positive cDNA clone from an Entamoeba histolytica HK-9 cDNA expression library in the phage vector lambda ZAP-II. The 1.85-kb cDNA insert was found to be truncated and encoded the cysteine-rich, immunodominant domain of the antigenic 170-kDa subunit of the amebal galactose N-acetylgalactosamine binding lectin. This domain was expressed as a glutathione S-transferase fusion protein in Escherichia coli. Inclusion bodies of the recombinant protein were solubilized with Sarkosyl, and the protein was enriched from the crude bacterial extract by thiol-affinity chromatography. The recombinant protein was used to develop a rapid, sensitive, and specific avidin-biotin microtiter enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for invasive amebiasis. Sera from 38 individuals suffering from invasive amebiasis, 12 individuals with noninvasive amebiasis, 44 individuals with other infections, and 27 healthy subjects were screened by the recombinant antigen-based ELISA. The sensitivity and specificity of the assay were 90.4 and 94.3%, respectively, which correlated well with those of an ELISA developed with crude amebal antigen (r = 0.94; P < 0.0001), as well as with those of a commercially available serodiagnostic ELISA (r = 0.92; P < 0.0001). Thus, the bacterially expressed recombinant lectin can replace the crude amebal extract as an antigen in the serodiagnosis of invasive amebiasis by using avidin-biotin microtiter ELISA.

Resistance to amoebic gill disease (AGD) is characterised by the transcriptional dysregulation of immune and cell cycle pathways

Amoebic gill disease (AGD) is a parasite-mediated proliferative gill disease capable of affecting a range of teleost hosts. While a moderate heritability for AGD resistance in Atlantic salmon has been reported previously, the mechanisms by which individuals resist the proliferative effects remain poorly understood. To gain more knowledge of this commercially important trait, we compared gill transcriptomes of two groups of Atlantic salmon, one designated putatively resistant, and one designated putatively susceptible to AGD. Utilising a 17k Atlantic salmon cDNA microarray we identified 196 transcripts that were differentially expressed between the two groups. Expression of 11 transcripts were further examined with real-time quantitative RT-PCR (qPCR) in the AGD-resistant and AGD-susceptible animals, as well as non-infected naïve fish. Gene expression determined by qPCR was in strong agreement with the microarray analysis. A large number of differentially expressed genes were involved in immune and cell cycle responses. Resistant individuals displayed significantly higher expression of genes involved in adaptive immunity and negative regulation of the cell cycle. In contrast, AGD-susceptible individuals showed higher expression of acute phase proteins and positive regulators of the cell cycle. Combined with the gill histopathology, our results suggest AGD resistance is acquired rather than innately present, and that this resistance is for the most part associated with the dysregulation of immune and cell cycle pathways. © 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Efeito dos componentes obtidos de qualea multiflora sobre modelo tumoral mamário murino e sua influência no sistema imunológico

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Diagnóstico de enteroparasitoses numa comunidade rural de Mirante da Serra, Rondônia, Brasil

As enteroparasitoses estão entre as infecções mais comuns no homem, apresentando-se com maior intensidade em países subdesenvolvidos por estarem diretamente relacionadas às condições higiênico-sanitárias. Este estudo tem por objetivo investigar a presença de enteroparasitas causadoras de doenças no homem, em uma comunidade do Movimento dos Trabalhadores Rurais Sem Terra (MST) no estado de Rondônia. No acampamento Pe. Ezequiel, município de Mirante da Serra, RO, foram utilizados os métodos direto e de sedimentação espontânea em água para detecção e identificação das formas parasitárias de protozoários e helmintos em material fecal de residentes do mesmo e o teste de ELISA (Ensaio imunoenzimático) para detecção de coprantígeno específico, anti-GIAP (proteina de aderência inibidora da galactose), de Entamoea histolytica (Tachlab, Blacksburg, VA, USA). Foram examinadas 313 amostras fecais pelos testes coproscópicos e 186 pelo teste de ELISA. A prevalência encontrada foi de 33,5% sendo a E. histolystica, Giárdia Lamblia e os ancilostomídeos os parasitas patogênicos mais frequentes. Não foram encontradas diferenças significativas entre parasitismo e idade, mas entre agente causador da infecção e sexo houve significância entre E. histolytica e sexo feminino. Não foi possível determinar fator (es) de risco relacionado (s) às infecções. Quanto ao resultado do ELISA, foi detectado um número maior de amébiase intestinal por este método do que por coproscopia. Considerando ser o acampamento uma área rural sem infra-estrutura ideal, o baixo parasitismo encontrado foi surpreendente. Todavia, a estrutura alternativa do local somado à organização social do grupo, consciência comunitária e formação básica em saúde, constitui fatores preponderantes para a aprovação e/ou controle das enteroparasitoses.

Estudo epidemiológico da amebíase no Estado do Pará utilizando diferentes metodologias para diagnóstico

A epidemiologia da amebíase está sendo reavaliada desde que a E. histolytica (patogênica) foi considerada espécie distinta de E. dispar (não patogênica). Neste estudo, investigou-se a freqüência da amebíase em uma amostra de residentes do Pará por diferentes técnicas de diagnóstico e avaliou-se a patogenia do parasito. Os participantes (n = 845) forneceram material fecal e destes, 191 foram entrevistados quanto aos sintomas de diarréia, cólicas intestinais, constipação, náuseas e vômito. Foram também analisados 8 exsudatos de pacientes com suspeita de amebíase hepática. As amostras foram observadas sob microscopia de luz e a confirmação de E. histolytica feita a partir da pesquisa de antígenos. Um total de 98 amostras fecais e todos os exsudatos foram semeados em meio Pavlova para isolamento e posterior caracterização bioquímica e molecular (identificação de espécie e genotipagem). Isolados de outras regiões do Brasil foram também genotipados. A positividade obtida foi de 29,35% (248/845) e não houve correlação com a faixa etária. A microscopia revelou baixa sensibilidade (45,26%; 74/334), porém elevada especificidade (87,03%; 260/334) quando comparada ao ELISA. Houve relação significativa (OR 4,4026) entre a presença de sintomas e a positividade no ELISA, sendo a diarréia (58,82%) e a cólica intestinal (58,82%) os sintomas mais relatados. Nenhum exsudato foi positivo no exame a fresco, porém 7 foram positivos no ELISA. Obteve-se 22 isolados de material fecal e a caracterização da HE foi possível em 13, dos quais 7 E. histolytica e 6 E. dispar. O DNA de 22 isolados e dos exsudatos foram testados para identificação molecular de espécie e genotipagem. Do total, 16 cultivos (9 cepas mistas, 4 E. dispar e 3 E. histolytica) e 5 exsudatos (todos E. histolytica) amplificaram na PCR. A genotipagem identificou adicional positividade para E. histolytica em um exsudato e revelou diferentes polimorfismos de comprimento para o locus 1-2 de E. histolytica e E. dispar do Pará e de outras regiões do Brasil e um caso de co-infecção por diferentes genótipos de E. dispar. Nossos resultados revelam que a amebíase invasiva é um importante problema de saúde pública em nossa população e grande variedade de genótipos de E. histolytica contribuem para a doença no Brasil.

Diagnóstico e epidemiologia da Entamoeba histolytica em residentes do município de Juruti-Pará

Amebíase é a infecção no homem causada pelo protozoário Entamoeba histolytica, apresentam quadros sem manifestações clínicas até graves de elevada morbimortalidade e sendo responsável por milhões de casos de disenteria e abscessos hepáticos a cada ano. Os dados epidemiológicos da amebíase no Brasil estão sendo reavaliados desde que a Entamoeba histolytica (patogênica) foi considerada espécie distinta da Entamoeba dispar (não patogênica). Neste estudo, realizou- se o diagnóstico da amebíase por meio de métodos parasitológicos, pesquisa de antígenos e método molecular em amostras fecais de pacientes residentes no município de Juruti, Pará, Brasil. Foram analisadas 188 amostras, com positividade em 28 (14,89 %) no método imunológico, que foi considerado como padrão ouro. A infecção por E. histolytica foi maior no grupo etário acima de 14 anos (8,51%) que no grupo de 0-14 anos (6,38%), porém sem significância estatística (p > 0,05). Houve discordância nos resultados dos métodos ELISA e coproscópico em 41 amostras (21,81%), com maior número de positivos no teste imunoenzimático. O diagnóstico pelo método de PCR apresentou positividade de 5,88% (3/51), resultado inferior ao observado na microscopia (7,84% - 4/51) e teste de ELISA (11,76% - 6/51). Assim, nossos resultados sugerem que a amebíase intestinal é um problema de saúde pública no município de Juruti.

Investigação da prevalência da amebíase em escolares do município de Imperatriz-MA

A amebíase é uma infecção causada pela Entamoeba histolytica e considerada uma importante causa de morbi-mortalidade no mundo. Estudos relatam uma prevalência elevada da amebíase em regiões tropicais, principalmente em comunidades que vivem em precárias condições sanitárias. O estudo epidemiológico da amebíase tem sido reavaliado desde que a E. histolytica, forma patogênica, foi distinta da E. dispar, forma não patogênica. O objetivo desta pesquisa foi estimar a prevalência de E. histolytica na população de escolares da rede municipal da cidade de Imperatriz (MA). Realizou-se um estudo de corte transversal que envolveu 405 escolares. As amostras foram analisadas através de exame parasitológico, pelo método de sedimentação espontânea, para triagem das amostras positivas para o complexo E. histolytica/E .dispar. Os exames positivos para o complexo E. histolytica/E. dispar foram posteriormente submetidos à reação em cadeia da polimerase (PCR) para diferenciação das espécies. Na PCR foi utilizado para amplificação inicial de um fragmento de 1076 pb, um conjunto de primers externo E1 e E2, seguida por uma PCR Multiplex usando os primers Eh-L/Eh-R e Ed-L/Ed-R para amplificação da E. histolytica e E. dispar, respectivamente. Não foi diagnosticado pela PCR amostras positivas para E.histolytica. A prevalência da E. dispar na população de escolares foi de 2,7% (11/405). A PCR se mostrou importante ferramenta para o diagnóstico diferencial das Entamoebas. Porém, estudos de prevalência da amebíase devem ser impulsionados em população com características diferenciadas, a fim de contribuir de forma efetiva para definir a situação epidemiológica desta infecção na cidade de Imperatriz.

Efeitos anti-inflamatório e antitumoral dos constituintes de Qualea grandiflora no tumor de Ehrlich

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Regulation of Adherence and Virulence by the Entamoeba histolytica Lectin Cytoplasmic Domain, Which Contains a β2 Integrin Motif

Killing of human cells by the parasite Entamoeba histolytica requires adherence via an amebic cell surface lectin. Lectin activity in the parasite is regulated by inside-out signaling. The lectin cytoplasmic domain has sequence identity with a region of the β2 integrin cytoplasmic tail implicated in regulation of integrin-mediated adhesion. Intracellular expression of a fusion protein containing the cytoplasmic domain of the lectin has a dominant negative effect on extracellular lectin-mediated cell adherence. Mutation of the integrin-like sequence abrogates the dominant negative effect. Amebae expressing the dominant negative mutant are less virulent in an animal model of amebiasis. These results suggest that inside-out signaling via the lectin cytoplasmic domain may control the extracellular adhesive activity of the amebic lectin and provide in vivo demonstration of the lectin’s role in virulence.

Identification of the galactose-adherence lectin epitopes of Entamoeba histolytica that stimulate tumor necrosis factor-alpha production by macrophages.

The 170-kDa subunit of the galactose-adherence lectin (Gal-lectin) of Entamoeba histolytica mediates adherence to human colonic mucins and intestinal epithelium as a prerequisite to amebic invasion. The Gal-lectin is an immunodominant molecule and a protective antigen in the gerbil model of amebiasis. Tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) produced by activated macrophages enhances nitric oxide-dependent cytotoxicity in host defense against E. histolytica. The purpose of this study was to identify the Gal-lectin epitopes which stimulate TNF-alpha production by macrophages. Murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) exposed to Gal-lectin (100-500 ng/ml) stimulated stable expression of TNF-alpha mRNA (8-fold increase) and TNF-alpha production similar to that of lipopolysaccharide-stimulated cells (100 ng/ml). Polyclonal anti-lectin serum specifically inhibited TNF-alpha mRNA induction in response to the Gal-lectin but not to lipopolysaccharide. Anti-lectin monoclonal antibodies 8C12, H85 and 1G7, which recognize nonoverlapping epitopes of the cysteine-rich region of the 170-kDa heavy subunit, inhibited both amebic adherence to mammalian cells and Gal-lectin-stimulated TNF-alpha mRNA expression by BMMs,but monoclonal antibody 7F4 did neither. As these inhibitory antibodies map to amino acids 596-1082 of the 170-kDa Gal-lectin, our results have identified the functional region that mediates amebic adherence and TNF-alpha mRNA induction in BMMMs; thus, this region of the Gal-lectin is a subunit vaccine candidate.

Travellers returning ill from the tropics – a descriptive retrospective study

nternational travel continues to increase in frequency. Health care providers need a wide understanding of the spectrum of travel related diseases and their management. This retrospective study analyses the demographic and clinical data of 360 travellers returning from the tropics presenting to an outpatient clinic at a tertiary hospital between 2003 - 2007. The aim of this study was to analyse the frequency of presenting symptoms and diseases in ill returning travellers and to correlate them to the areas visited and the duration and purpose of travel. The main symptoms during travel were diarrhoea (n = 200, 56 %) and fever (n = 124, 34 %). Travellers not visiting friends and relatives but with close contact to the local population were at more than two-fold increased risk of diarrhoea (Odds Ratio [OR] 2.5; 95 % confidence interval [CI] 1.1-6.0, p = 0.03) and fever (OR 2.4; 95 % CI 1.1-5.3; p = 0.02) compared to tourist travellers. Travellers visiting friends and relatives (VFR) were not at increased risk for diarrhoea (OR 0.6; 95 % CI 0.3-1.3; p = 0.17), or fever (OR 1.5; 95 % CI 0.7-3.4; p = 0.28). Thirty-two percent of all travellers (n = 115) were diagnosed with a specific pathogen. Malaria (6 %), giardiasis (6 %) and amebiasis (4 %) were the most frequently detected pathogens. The odds of malaria as a cause of the presenting illness was lower among travellers reporting pre-travel advice. Specific antimicrobial treatment was required in around one third of the patients.

Clinical amoebiasis

Bibliography: p. [137]-160.

Amoebiasis vaccine development: a snapshot on E. histolytica with emphasis on perspectives of Gal/GalNAc lectin

Amoebiasis/amebiasis is a gastrointestinal infection caused by an enteric dwelling protozoan, Entamoeba histolytica. The disease is endemic in the developing world and is transmitted mainly via the faecal-oral route (e.g., in water or food) and may or may not be symptomatic. This disease of socio-economic importance worldwide involves parasite adherence and cytolysis of human cells followed by invasion that is mediated by galactose-binding (Gal/GalNAc) surface lectin. Disruption of the mucus layer leads to invasive intestinal and extraintestinal infection. Gal-lectin based vaccinations have conferred protection in various animal models against E. histolytica infections. Keeping in view the pivotal role of Gal/GalNAc lectin in amoebiasis vaccine development, its regulation, genomic view of the parasite involving gene conversion in lectin gene families, current knowledge about involvement of Gal/GalNAc lectin in adherence, pathogenicity, signalling, encystment, generating host immune response, and in turn protozoa escape strategies, and finally its role as effective vaccine candidate has been described. This review will help researchers to explore pathogenesis mechanism along with genomic studies and will also provide a framework for future amoebiasis vaccine development studies.