Aislamiento y caracterización de una sustancia producida por macrófagos con actividad quimiotáctica para linfocitos [por] Ricardo Alberto Gómez Flores

Tesis (Maestria en Ciencias con especialidad en Inmunobio logía). U.A.N.L.

Modulación de la respuesta inmune a través de la expresión de citocinas inducidas por LPS con el extracto dializable de leucocitos de origen humano y bovino [por] Juana María Reyna Reyes

Tesis (Maestría en Ciencias con Especialidad en Inmunología) U.A.N.L.

Aglutinación de microvesículas eritrocitarias por autoanticuerpos de pacientes con anemia hemolítica autoinmune como un evento independiente del citoesqueleto

Tesis (Doctorado en Medicina) UANL

Systemic Lupus Erythematosus 2014

Systemic lupus erythematosus (SLE, lupus) is the prototype of systemic autoimmune disease (AD). Immune system activation in SLE is characterized by exaggerated B-cell and T-cell responses and loss of immune tolerance against selfantigens. Production and defective elimination of antibodies, circulation and tissue deposition of immune complexes, and complement and cytokine activation contribute to clinical manifestations that range from fatigue and joint pain to severe, life-threatening organ damage

The Autoimmune Tautology: From Polyautoimmunity and Familial Autoimmunity to the Autoimmune Genes

Autoimmune diseases (ADs) are chronic conditions initiated by the loss of immunological tolerance to self-antigens and represent a heterogeneous group of disorders that afflict specific target organs ormultiple organ systems [1]. The chronic nature of these diseases places a significant burden on the utilization of medical care, direct and indirect economic costs, and quality of life. The fact that ADs share several clinical signs and symptoms (i.e., subphenotypes), physiopathological mechanisms, and genetic factors has been called autoimmune tautology and indicates that they have common mechanisms

Characterizing PvARP, a novel Plasmodium vivax antigen

Background Plasmodium vivax continues to be the most widely distributed malarial parasite species in tropical and sub-tropical areas, causing high morbidity indices around the world. Better understanding of the proteins used by the parasite during the invasion of red blood cells is required to obtain an effective vaccine against this disease. This study describes characterizing the P. vivax asparagine-rich protein (PvARP) and examines its antigenicity in natural infection. Methods The target gene in the study was selected according to a previous in silico analysis using profile hidden Markov models which identified P. vivax proteins that play a possible role in invasion. Transcription of the arp gene in the P. vivax VCG-1 strain was here evaluated by RT-PCR. Specific human antibodies against PvARP were used to confirm protein expression by Western blot as well as its subcellular localization by immunofluorescence. Recognition of recombinant PvARP by sera from P. vivax-infected individuals was evaluated by ELISA. Results VCG-1 strain PvARP is a 281-residue-long molecule, which is encoded by a single exon and has an N-terminal secretion signal, as well as a tandem repeat region. This protein is expressed in mature schizonts and is located on the surface of merozoites, having an apparent accumulation towards their apical pole. Sera from P. vivax-infected patients recognized the recombinant, thereby suggesting that this protein is targeted by the immune response during infection.

A sequence in subdomain 2 of DBL1 alpha of plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 induces strain transcending antibodies

Immunity to severe malaria is the first level of immunity acquired to Plasmodium falciparum. Antibodies to the variant antigen PfEMP1 (P. falciparum erythrocyte membrane protein 1) present at the surface of the parasitized red blood cell (pRBC) confer protection by blocking microvascular sequestration. Here we have generated antibodies to peptide sequences of subdomain 2 of PfEMP1-DBL1 alpha previously identified to be associated with severe or mild malaria. A set of sera generated to the amino acid sequence KLQTLTLHQVREYWWALNRKEVWKA, containing the motif ALNRKE, stained the live pRBC. 50% of parasites tested (7/14) were positive both in flow cytometry and immunofluorescence assays with live pRBCs including both laboratory strains and in vitro adapted clinical isolates. Antibodies that reacted selectively with the sequence REYWWALNRKEVWKA in a 15-mer peptide array of DBL1 alpha-domains were also found to react with the pRBC surface. By utilizing a peptide array to map the binding properties of the elicited anti-DBL1 alpha antibodies, the amino acids WxxNRx were found essential for antibody binding. Complementary experiments using 135 degenerate RDSM peptide sequences obtained from 93 Ugandan patient-isolates showed that antibody binding occurred when the amino acids WxLNRKE/D were present in the peptide. The data suggests that the ALNRKE sequence motif, associated with severe malaria, induces strain-transcending antibodies that react with the pRBC surface.

Determinación de interleucina-10 (IL-10) en pacientes con cáncer en estadios III y IV tratados con dexametasona

La utilización de la dexametasona está asociada con la supresión de la respuesta inmune en pacientes con cáncer en estadíos III y IV, debido posiblemente a una acción inhibidora sobre las células dendríticas presentadoras de antígenos. Bajo la acción de la dexametasona, las células dendríticas secretan niveles muy bajos de IL-10, lo que a su vez disminuye, tanto la respuesta mediada por los linfocitos Th2 como la inducida por las células NK. La IL-10 tiene pues un efecto dual, si se tiene en cuenta que, en la mayoría de los modelos experimentales, aumenta en pacientes tratados con glucocorticoides tipo dexametasona e inhibe la respuesta mediada por los linfocitos Th1, con una consecuente exacerbación del proceso. Metodología: Se utilizó la prueba de ELISA para determinar IL-10 en pacientes con diferentes tipos de tumor en estadíos III y IV, sometidos a quimioterapia y tratados con dexametasona-metoclopramida como antiemético y en un grupo control de personas sanas. Resultados: En este modelo experimental, todos los pacientes con cáncer en estadíos III y IV presentaron niveles séricos de IL-10 muy bajos, comparados con los del grupo control. Además, IL-10 no aumentó su concentración en los pacientes tratados con dexametasona. Conclusión: IL-10 no provoca anergia de las células dendríticas ni disminución de la respuesta citotóxica mediada por Th1. Por tanto, se sospecha que es la dexametasona y no la IL-10 la responsable de la supresión en la respuesta inmune en pacientes con cáncer en estadíos III y IV, lo que podrá ser demostrado en posteriores estudios que complementen los resultados obtenidos.

Evaluación del programa de vigilancia centinela de influenza y otros virus respiratorios 1997- 2007 Colombia

La influenza es una entidad clínica, que es causada por los virus de la influenza A, B y C del género Influenza. El virus de la influenza A se clasifica en subtipos, con base en 2 antígenos de superficie: la hemaglutinina y la neuraminidasa. La respuesta inmune frente a estos antígenos (especialmente frente a la hemaglutinina), disminuye la probabilidad de infección, así como la severidad del cuadro clínico. La intención de este trabajo es describir el funcionamiento del programa de vigilancia centinela de influenza y otros virus respiratorios en Colombia, que permite identificar en que medida se alcanza la finalidad de esta actividad y que dificultades en general afectan su funcionamiento.

Análise da variabilidade imunológica e da expressão dos genes FREPs entre as espécies Biomphalaria glabrata e B. straminea com diferentes perfis de suscetibilidade ao parasito Schistosoma mansoni

Algumas espécies do gênero Biomphalaria se apresentam como potenciais hospedeiras ao parasito Schistosoma mansoni, estando a suscetibilidade a este parasito, neste gênero, ligada ao sistema interno de defesa de cada espécie de Biomphalaria. Um dos componentes importantes no sistema imune de invertebrados é a enzima fenoloxidase, que ainda apresenta muitos aspectos desconhecidos no sistema de defesa do gênero Biomphalaria. Foi relatado também que os genes de proteínas relacionadas ao fibrinogênio (FREPs) possuem importância na resposta imune de Biomphalaria glabrata, entre esses, as subfamílias dos FREPs 3 e 4 são diferencialmente expressas em linhagens susceptíveis e resistentes frente a infecção com trematódeos. No entanto os trabalhos existentes em sua maioria estudam a espécie Biomphalaria glabrata, excluindo a espécie Biomphalaria straminea, amplamente distribuída no Brasil e principal responsável pela disseminação da esquistossomose. Tendo em vista a falta de conhecimento sobre a resposta imune destes moluscos hospedeiros, principalmente em relação à expressão de genes imune relevantes e ao tipo de resposta, o presente trabalho se propôs a estudar a variação do número de hemócitos, da produção de fenoloxidase e da expressão dos genes dos FREP 3 e FREP 4 envolvidos com a ligação a antígenos de trematódeos, nas espécies Biomphalaria glabrata, Biomphalaria straminea pós-infecção com S. mansoni, bem como em caramujos pré-expostos a antígenos de S. mansoni. Para isso, os caramujos de cada espécie foram divididos em 2 grupos: pré-expostos e não expostos a antígenos de S. mansoni. Esses grupos foram divididos em sadios e infectados com a cepa LE de S. mansoni. Em B. glabrata não houve alteração no número de hemócitos, porém B. straminea mostrou uma queda após duas horas de infecção. A atividade da fenoloxidase variou após a sensibilização na espécie menos susceptível (B. straminea) e não variou em B. glabrata, também foi identificado que os hemócitos produtores da fenoloxidase são os granulócitos e hialinócitos. Quanto à expressão dos genes, o FREP 3 e 4 apresentaram níveis basais de expressão aumentados após a sensibilização, com perfil de expressão diferente entre as espécies estudadas. Esses resultados confirmam que a resposta imune varia em diversos aspectos entre as espécies do gênero Biomphalaria, e que nas espécies estudadas a enzima fenoloxidase não parece ter o mesmo papel que no sistema de defesa de insetos, diferindo apenas após a sensibilização, que tem influência na expressão dos genes imuno relevantes do FREPs

Dengue: desenvolvimento de ferramentas moleculares e caracterização de cepas virais quanto a inibição da sinalização do Interferon do tipo I (IFN-I)

A infecção pelo vírus da dengue é um problema de saúde pública global que põe em risco cerca de 2,5 bilhões de pessoas no mundo, com uma incidência de 50-100 milhões de casos resultando em cerca de 24.000 mortes por ano. Os mecanismos envolvidos na resposta imune inata atuam imediatamente após o contato do hospedeiro com os antígenos virais, levando à secreção de interferon do tipo I (IFN-I), a principal citocina envolvida na resposta antiviral. Entender como o sistema IFN-I é inibido em células infectadas pelo vírus dengue pode fornecer valiosas informações sobre a patogênese da doença. Propomos neste estudo analisar a inibição da via de sinalização do IFN-I por diferentes cepas isoladas no estado de Pernambuco, assim como o desenvolvimento de um vírus recombinante da dengue expressando a proteína Gaussia luciferase, para estudos futuros de replicação e imunopatogênese. A fim de estudar a via de sinalização do IFN-I, foram selecionadas cepas dos quatro sorotipos de dengue para crescimento, concentração e titulação viral. Foi utilizada a linhagem celular BHK-21-ISRE-Luc-Hygro que expressa o gene firefly luciferase fusionado a um promotor induzido pelo IFN-I (ISRE - Interferon Stimulated Response Element). Observamos que todos os sorotipos em estudo foram capazes de inibir, em diferentes proporções, a resposta ou sinalização do IFN-I. Com o intuito de auxiliar as pesquisas em dengue, desenvolvemos um vírus repórter de dengue expressando o gene repórter da Gaussia luciferase. Células transfectadas com o transcrito in vitro de um dos clones resultou em imunofluorescência positiva, porém não houve recuperação de partículas infectivas. Outros clones deverão ser testados para recuperação de vírus recombinante repórter. Juntos, os dados da caracterização das cepas em estudo e a recuperação de partículas infectivas da construção realizada neste trabalho deverão contribuir para as pesquisas em imunopatogênese, replicação viral e desenvolvimento de antivirais contra o dengue

Avaliação da expressão das isoformas da molécula HLA-G e do perfil da resposta imune em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico juvenil (LESJ)

O lúpus eritematoso sistêmico juvenil (LESJ) é uma doença inflamatória crônica causada pela produção de autoanticorpos, que reconhecem como estranhos antígenos próprios do organismo, e possuem alta morbidade e mortalidade em relação à doença no adulto. Em sua patogênese estão envolvidos fatores ambientais, hormonais, imunológicos e genéticos. Estudos de associação genética demonstraram que a susceptibilidade ao lúpus é poligênica, e entre os genes envolvidos está o HLA-G que é responsável pela regulação da resposta imune. No estudo, foi analisada a expressão de isoforma da molécula HLA-G e observamos o perfil de resposta imune em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico juvenil. Os pacientes que participaram do estudo foram selecionados no serviço de Reumatologia do Hospital das Clínicas e foi coletado sangue periférico de 10 pacientes no momento ativo e inativo do LESJ. O estudo comparou a expressão do mRNA do HLA-G5, IL-10 e TNF, os níveis plasmáticos de sHLA-G e citocinas Th1, Th2 e Th17 entre os grupos com a doença ativa, inativa e o grupo de crianças saudáveis aplicando os testes de Mann-Whitney U e Kruskal-Wallis. Os resultados mostraram que pacientes com LESJ ativo apresentaram níveis elevados das citocinas IL-10 (p=0,004) e IL-6 (p=0,011), além de apresentarem expressão de mRNA do TNF mais elevada em relação ao grupo inativo (p0,05). Mesmo com número reduzido, foi possível caracterizar que houve mudança do perfil de citocinas durante a ativação do LESJ, e a relação dessa ativação com a expressão de HLA-G solúvel, além de servir como base para proposta de um modelo de regulação imunológica, que poderá ser validado em futuros experimentos

Testemunha da tuberculose : antígeno liparabinomannan

O estudo pretendeu abordar a imunidade humoral na Tuberculose. Foi um estudo de teste diagnóstico que avaliou um antígeno específico, constituinte da parede celular da micobactéria, denominado LIPOARABINOMANNAN (LAM), proveniente de Cambridge, MA, USA da Companhia Dyna-Gen. O objetivo principal do estudo foi a detecção de anticorpos IgG anti-LAM em casos de tuberculose pulmonar, extrapulmonar e formas combinadas da doença. A casuística total compreendeu 173 pacientes portadores de tuberculose, sendo a mesma confirmada por métodos bacteriológicos e/ou anatomopatológicos de biópsias de diversos órgãos em 114 casos (65,8%). Em 46 casos (26,5%) a doença se confirmou por rigorosos critérios clínicos, radiológicos e de seguimento após tratamento adequado. Cento e quinze pacientes eram do sexo masculino (66,5%) e 58 do sexo feminino (33,5%). Cento e trinta e um eram brancos (75,7%), 24 negros (13,9%) e 18 mistos (10,4%). O total de formas pulmonares foi de 88 casos (51%), sendo 81 (46,8%) formas bacilíferas e 7 casos (4,0%) não-bacilíferas. Dos casos com baciloscopia direta negativa, 3 apresentaram culturas positivas, 2 culturas negativas e em 2 casos a mesma não foi realizada. Formas extrapulmonares compreenderam 71 casos (41%) com predomínio de forma miliar, ganglionar, pleural e do SNC. A combinação de ambas as formas ocorreu em 14 casos (8,1%). Radiologicamente, houve predomínio de lesões escavadas (30,1%), consolidação (13,9%), padrão miliar (11%) e exame radiológico normal (11%), além de outros achados. Da série, 118 pacientes eram HIV negativos (68,2%) e 55 eram HIV positivos (31,8%). As principais comorbidades associadas foram Diabetes Melittus (DM), Alcoolismo, Cardiopatia e Neoplasia, entre outras. Exames culturais foram realizados em 145 pacientes, sendo que em 72 casos a cultura foi positiva (41,6%) e foi negativa em 10 casos (5,8%). Dos 72 exames culturais positivos, o teste do MycoDot foi positivo em 47 casos (65,2%) e negativo em 25 (34,7%). Em 10 exames culturais negativos, o mesmo foi positivo em 6 casos (60%) e negativo em 4 casos (40%). Em 63 exames culturais não realizados, o teste do MycoDot foi positivo em 46 casos e negativos em 17. Os resultados do teste MycoDot na série total foram: positivos em 120 pacientes (69,4%) e negativos em 53 pacientes (30,6%). As formas pulmonares bacilíferas, não bacilíferas, extrapulmonares e combinadas apresentaram sensibilidade de 74,1%, 85,7%, 63,4% e 64,3% respectivamente. O grupo controle foi de 77 indivíduos assim distribuídos: 41 sadios, 16 portadores de lesões residuais de tuberculose, 6 sadios com BCG prévia, 6 sadios sem BCG prévia e 8 com outras comorbidades. O resultado do teste MycoDot foi negativo em 73 casos (94,8%) e positivo em 4 casos (5,2%). A sensibilidade da casuística total foi de 69,4%, a especificidade foi de 94,8%, o valor preditivo positivo (VPP) foi de 96,8% e o valor preditivo negativo (VPN) foi de 57,9%. Dos pacientes HIV positivos a sensibilidade foi de 61,8% e a especificidade foi de 100%. Nos pacientes HIV negativos a sensibilidade foi de 72,9% e a especificidade foi de 94,7%. Concluiu-se que o Teste MycoDot é de fácil realização, baixo custo, podendo ser útil como uma ferramenta adicional para o diagnóstico da tuberculose.

Clonagem, caracterização e expressão de cDNAs similares a calreticulina e paramiosina isolados de glândula salivar do carrapato Boophilus microplus (Canestrini, 1887)

O carrapato Boophilus microplus é um dos mais importantes ectoparasitas dos rebanhos bovinos, estando em todas as áreas tropicais e subtropicais entre o paralelo 32 °N e 32 °S, abrangendo regiões que se dedicam à pecuária na América, África, Ásia e Oceania. O controle do carrapato B. microplus é realizado principalmente com o uso de acaricidas, entretanto devido a crescente preocupação com os problemas criados pela poluição química do ambiente, ao alto custo e toxicidade das drogas e ao aparecimento de carrapatos resistentes aos acaricidas, alternativas para o controle do B. microplus devem ser encontradas. A sobrevivência dos carrapatos depende grandemente da sua capacidade de evadir o sistema imunológico dos hospedeiros, portanto antígenos da glândula salivar poderiam ser alvos para intervenção imunoprofilática. Neste trabalho foram isolados cDNAs não previamente descritos correspondentes a antígenos presentes na glândula salivar. cDNAs que codificam para proteínas similares a paramiosina e calreticulina foram seqüenciados, expressos em Escherichia coli e as proteínas recombinantes purificadas, tendo sido produzidos soros policlonais contra as proteínas recombinantes em coelhos. As seqüências foram caracterizadas e alinhamentos múltiplos com outras seqüências foram determinados. O gene da calreticulina mostrou ser expresso em todos os estágios e tecidos testados, tanto em experimentos de RT-PCR quanto de Western blot, tendo sido demonstrado também a sua secreção pela saliva. Análise filogenética indica o agrupamento do gene de B. microplus com seqüências de outros artrópodos. Soros de bovinos infestados não reconhecem a calreticulina recombinante, apesar dela ser reconhecida pelo soro de cães infestados pelo carrapato Rhippicephalus sanguineus. A paramiosina mostrou-se, em ensaios de Western blot, também estar presente em todos os estágios testados, porém não na saliva. A paramiosina recombinante foi capaz de ligar colágeno e IgGs. Ambas as proteínas correspondem a proteínas multi-funcionais possivelmente envolvidas na imunomodulação do hospedeiro, tendo sido sugeridas como imunógenos protetores contra outros parasitas.

Pythium insidiosum: avaliação de imunoterápicos para eqüinos, utilizando-se coelhos como modelo experimental.

A pitiose é uma doença granulomatosa, tendo como agente etiológico Pythium insidiosum De Cock, 1987, que atinge eqüinos, provocando quadro infeccioso na pele e tecido subcutâneo , caninos com apresentação gastrintestinal e cutânea , bovinos com doença cutânea , felinos e humanos, com quadro clinico de arterite, queratite e celulite periorbital. Esta enfermidade é mais prevalente em áreas tropicais, subtropicais ou temperadas. Também animais silvestres podem se infectar pela doença. O gênero Pythium pertence ao Reino Stramenopila, Filo Oomycota, cujos membros caracterizam-se por produção de zoósporos biflagelados durante a reprodução assexuada. O desenvolvimento de pitiose experimental nas espécies naturalmente infectadas não foi ainda relatado, mas os coelhos são sensíveis à inoculação de zoósporos e podem ser usados como modelo experimental para estudo da pitiose. Este trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência de 3 processos de produção de imunoterápicos contra pitiose, produzidos a partir do cultivo e posterior maceração ou sonicação, em coelhos infectados experimentalmente com 17.500 zoósporos do oomiceto Pythium insidiosum (cepa CBS 101555). Todos os coelhos foram inoculados com zoósporos 1 mês antes da aplicação dos imunoterápicos. Para avaliação dos imunoterápicos, os coelhos que desenvolveram lesões foram divididos em 4 grupos de 5 animais: Grupo 1 – Tratado com placebo; grupo 2 – tratado com o imunoterápico sonicado; grupo 3 – tratado com o imunoterápico misto e o grupo 4 - Imunoterápico macerado mecanicamente. Todos os animais receberam 8 doses do imonoterápico ou placebo com intervalos de 14 dias. Um mês após a inoculação dos zoósporos móveis, foram iniciadas as medições das áreas inoculadas. Os resultados indicaram que o imunoterápico macerado, utilizado no grupo 4, foi estatisticamente (P<0.001) mais eficiente que os demais, diminuindo em até 71,8% a área dos nódulos provocados pelo Pythium insidiosum, após 26 semanas de avaliação. Neste período 2 coelhos deste grupo foram curados. Os animais do Grupo 2 que receberam o imunoterápico sonicado, não mostraram nenhuma reação, detectando-se aumento de até 221% no tamanho das lesões. Nos coelhos do grupo 3, imunoterápico misto, houve aumento das lesões em 50%. A provável causa deste insucesso com o grupo 2, está na desnaturação dos antígenos protetores através dos processos de sonicação. Os dados gerados nesta tese podem inferir que, futuramente, novas perspectivas se abrem para o estudo da pitiose e seu controle.