Identifica����o e caracteriza����o de sequ��ncias repetidas de DNA no genoma do cicl��deo Astronotus ocellatus

Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient��fico e Tecnol��gico (CNPq)

Detec����o de DNA de HPV no plasma para potencial identifica����o precoce de recidiva de c��ncer do colo de ��tero

O c��ncer do colo do ��tero constitui a terceira neoplasia maligna mais comum na popula����o feminina, com aproximadamente 520 mil novos casos e 260 mil ��bitos por ano e origina-se a partir da infec����o genital persistente pelo Papiloma V��rus Humano (HPV) oncog��nico. Os principais HPVs considerados de alto risco oncog��nico s��o os tipos HPV-16 e 18, respons��veis por cerca de 70% de todos os casos de c��nceres cervicais (CC) no mundo. Pacientes com CC apresentam taxa de recidiva variando de 8% a 49%. Dentro de dois anos de seguimento, 62% a 89% das recidivas s��o detectadas. Atualmente, os testes usados para detec����o de recidiva s��o a citopatologia da c��pula vaginal e exames de imagem, por��m ainda n��o est��o dispon��veis testes espec��ficos. O DNA livre-circulante (cf-DNA) representa um biomarcador n��o-invasivo facilmente obtido no plasma e soro. V��rios estudos mostram ser poss��vel detectar e quantificar ��cidos nucl��icos no plasma de pacientes com c��ncer e que as altera����es no cfDNA potencialmente refletem mudan��as que ocorrem durante a tumorig��nese. Essa ferramenta diagn��stica n��o-invasiva pode ser ��til no rastreio, progn��stico e monitoramento da resposta ao tratamento do c��ncer. Portanto, o desenvolvimento e a padroniza����o de testes laboratoriais n��o invasivos capazes de identificar marcadores tumorais e diagnosticar precocemente a recidiva da doen��a aumentam a chance de cura atrav��s da utiliza����o dos tratamentos preconizados. Sendo assim, este estudo tem o objetivo de detectar o DNA de HPV no plasma de pacientes com CC para avaliar sua potencial utilidade como marcador precoce de recidiva. Um fragmento de tumor e sangue de pacientes com CC, atendidas no ICESP e HC de Barretos, foram coletados antes do tratamento. Entraram no estudo 137 pacientes nas quais o tumor foi positivo para HPV-16 ou 18, sendo 120 amostras positivas para HPV-16 (87,6%), 12 positivas para HPV-18 (8,8%) e cinco positivas para HPV-16 e 18 (3,6%). A m��dia de idade das pacientes deste estudo foi de 52,5 anos. Plasma de 131 pacientes com CC da data do diagn��stico e de 110 pacientes do seguimento foram submetidas ao PCR em Tempo Real HPV tipo espec��fico. A presen��a do DNA de HPV no plasma pr��-tratamento foi observada em 58,8% (77/131) com carga viral variando de 204 c��pias/mL a 2.500.000 c��pias/mL. A positividade de DNA no plasma pr��-tratamento aumentou com o estadio cl��nico do tumor: I - 45,2%, II - 52,5%, III - 80,0% e IV - 76,9%, (p=0,0189). A presen��a do DNA de HPV no plasma p��s-tratamento foi observada em 27,3% (30/110). A m��dia de tempo das recidivas foi de 3,1 anos (2,7 - 3,5 anos). O DNA de HPV foi positivo at�� 460 dias antes do diagn��stico cl��nico da recidiva. As pacientes com DNA de HPV no plasma apresentaram pior progn��stico, tanto sobrevida como o tempo livre de doen��a, em rela����o ��s que foram negativas. Nas pacientes com CC a presen��a de HPV no plasma de seguimento pode ser um marcador precoce ��til para o monitoramento da resposta terap��utica e detec����o de pacientes com risco aumentado de recidiva e progress��o da doen��a.

An��lise de express��o g��nica de Xylella fastidiosa cultivada em diferentes concentra����es de glicose pela t��cnica de microarrays de DNA

Xylella fastidiosa (Xf) �� o agente etiol��gico causador de doen��as em uma grande variedade de cultivos de grande import��ncia econ��mica, causando a c1orose variegada dos citros, uma das doen��as mais danosas �� ind��stria de citros no Brasil. Os genomas de algumas cepas deste fitopat��geno foram completamente seq��enciados promovendo assim estudos funcionais do genoma em larga escala. Neste trabalho n��s nos propusemos a investigar o perfil de transcri����o de Xf atrav��s da t��cnica microarranjos (no t��tulo da disserta����o microarrays, mas a partir de agora usaremos microaarranjos) de DNA usando todo o genoma do fitopat��geno e cultivando-a sob meio definido variando a concentra����o de glicose. O objetivo inicial deste trabalho era observar se Xf comportava-se da mesma forma que Xac, que tem a express��o de goma aumentada devido ao aumento da concentra����o de glicose do meio. Nossas an��lises revelaram que enquanto os transcritos relacionados �� goma n��o se mostraram afetados com a concentra����o de glicose, genes que codificam para an��logos a Colicina-V e precursores de fimbria foram induzidos em alta concentra����o de glicose. Baseados nestes resultados, n��s propusemos um modelo de mecanismo de produ����o e defesa contra a Colicina em Xf.

Les��es em DNA promovidas por produtos de oxida����o do β-caroteno: poss��veis implica����es biol��gicas

Apesar de diversos estudos in vitro e em popula����es indicarem um efeito protetor do β-caroteno em sistemas biol��gicos, estudos epidemiol��gicos como o \"The Alpha-Tocopherol, Beta-Carotene Cancer Prevention Study\" (ATBC) e o \"The Beta-Carotene and Retinol Efficacy Trial\" (CARET) mostraram um aumento na incid��ncia de c��ncer pulmonar em indiv��duos fumantes suplementados com β-caroteno. Essa a����o contradit��ria tem sido chamada na literatura de \"Paradoxo do β-Caroteno\". Sabe-se que este caroten��ide sob altas press��es de oxig��nio ou na presen��a de per��xidos pode sofrer oxida����o e levar a forma����o de compostos como alde��dos, ep��xidos, etc, que s��o capazes de se adicionarem covalentemente ao DNA. Estudos, in vitro e in vivo t��m demonstrado a possibilidade de os metab��litos do β-caroteno agirem como agentes pr��-carcinog��nicos. Estes agentes quando ativados quimicamente podem levar �� forma����o de adutos de DNA. J�� se sabe que alguns desses adutos encontramse em n��veis aumentados em diversas situa����es de risco de c��ncer. Diversos grupos, incluindo o nosso, t��m demonstrado a forma����o de les��es em DNA a partir de alde��dos e ep��xidos ex��genos ou gerados endogenamente. O presente trabalho mostra que a rea����o do β-caroteno e dois de seus produtos de oxida����o, retinal e β-apo-8\'-carotenal, com 2\'-desoxiguanosina e DNA leva �� forma����o de adutos. Dentre os adutos formados, foi caracterizado o aduto 1,N2eteno-2\'-desoxiguanosina (1 ,N2-εdGuo). Os n��veis de outro aduto de DNA, a 8-oxo-7,8-dihidro-2\'-deoxiguanosina (8-oxodGuo), tamb��m foram monitoradas para estudo comparativo. A forma����o dos adutos tamb��m foi verificada em fibroblastos normais de pulm��o humano (linhagem IMR-90) expostos ao β-caroteno e aos seus produtos de oxida����o. Experimentos com ratos suplementados com β-caroteno e expostos �� fuma��a de cigarro em per��odos de 7, 30 e 180 dias, mostraram n��veis aumentados de 1,N2-εdGuo nos animais suplementados com o caroten��ide comparado ao grupo ve��culo. Aumento no n��vel de 8-oxodGuo tamb��m foi verificado nos tratamentos de 7 e 180 dias. Um aumento significativo no n��vel do eteno aduto tamb��m foi verificado nos animais suplementados com β-caroteno e expostos �� fuma��a de cigarro, comparado ao grupo apenas exposto �� fuma��a ap��s 7 e 180 dias de exposi����o. Nestes mesmos grupos, o aumento do 8-oxodGuo s�� foi observado no tratamento por 180 dias. Sabendo que estas les��es s��o comprovadamente mutag��nicas, nossos estudos podem contribuir para o esclarecimento dos mecanismos envolvidos na forma����o de c��ncer em fumantes suplementados ou n��o com β-caroteno.

O fator DNA ��� ferramentas a favor da constru����o de marcas diferenciadas

As organiza����es est��o se adaptando a um novo mercado, onde as pessoas t��m um papel mais ativo na forma como devem agir no meio em que est��o inseridas. De entre estas mudan��as, o design surge como uma ferramenta de diferencia����o entre seus concorrentes, tornando-se um dos itens de maior enfoque perante as empresas. Segundo Martins e Merino, o design transcende a cria����o de simples pe��as gr��ficas, pois contribui adicionando valores como uma imagem adequada, com responsabilidades perante a sociedade. Tais valores e outros conceitos, como a vis��o, miss��o e cultura da organiza����o fazem parte da ess��ncia da sua marca, identificados por meio do seu ���DNA���, que �� constru��do, de acordo com Olhats et al., dentro de um processo cocriativo, envolvendo a empresa e seus stakeholders, compartilhando as experi��ncias que ambos possuem a respeito da marca. O surgimento de metodologias para a constru����o de uma marca e seus valores vem fortalecer os estudos da ��rea de branding, como em Govindarajan e Trimble, que defendem a constru����o do ���DNA corporativo��� como uma forma inovadora de aplica����o de conceitos e valores que auxiliam a empresa a ter uma melhor compreens��o do seu funcionamento e de todos os elementos que a cercam, para que possa se diferenciar das outras empresas. Neste contexto, surge o seguinte questionamento de pesquisa: �� poss��vel existir uma ferramenta f��sica ou digital que apoie uma metodologia de gest��o de marca apoiada no design? Para autores como Gob��, programas de identidade empresarial precisam ser vision��rios e integrados, refletindo o compromisso das empresas em compartilhar seus valores com os consumidores. Ainda para o autor, as identidades corporativas devem funcionar e se comunicar com maior afinco com as pessoas, considerando-se os valores gastos no desenvolvimento de um programa de identidade empresarial. Metodologias cocriativas como a do Brand DNA, de acordo com Cardoso, s��o vistas como elementos motivadores que oferecem uma experi��ncia gratificante e marcante aos participantes do processo, refor��ando a identifica����o entre os colaboradores e a marca da organiza����o. A presente pesquisa tem como objetivo desenvolver, para a metodologia do Brand DNA Process, um conjunto de ferramentas (toolkit) que abarque toda a teoria cient��fica e facilite sua aplica����o. Dentre os conceitos a serem abordados, encontram-se os de Gest��o do Design, Branding, DNA da Marca e Toolkits. Para o desenvolvimento e cumprimento dos objetivos, prop��e-se como metodologia a base proposta por Gil (2002), que separa a classifica����o da pesquisa em dois grupos: quanto aos objetivos e quanto os procedimentos t��cnicos utilizados; iniciando-se como uma pesquisa explorat��ria visando maior profundidade no tema desenvolvido, definindo seus objetivos e, em seguida, partindo para uma pesquisa bibliogr��fica, adquirindo material e refer��ncias te��ricas sobre o que est�� sendo feito atualmente dentro da ��rea a ser explorada. Nortear��o esta pesquisa artigos, teses e livros da ��rea de gest��o de design, branding e inova����o.

Papel da prote��na de reparo XPC na regula����o das prote��nas de reparo APE1, OGG1 e PARP-1 em c��lulas humanas e de camundongos

studies using UV as a source of DNA damage. However, even though unrepaired UV-induced DNA damages are related to mutagenesis, cell death and tumorigenesis, they do not explain phenotypes such as neurodegeneration and internal tumors observed in patients with syndromes like Xeroderma Pigmentosum (XP) and Cockayne Syndrome (CS) that are associated with NER deficiency. Recent evidences point to a role of NER in the repair of 8-oxodG, a typical substrate of Base Excision Repair (BER). Since deficiencies in BER result in genomic instability, neurodegenerative diseases and cancer, it was investigated in this research the impact of XPC deficiency on BER functions in human cells. It was analyzed both the expression and the cellular localization of APE1, OGG1 e PARP-1, the mainly BER enzymes, in different NER-deficient human fibroblasts. The endogenous levels of these enzymes are reduced in XPC deficient cells. Surprisingly, XP-C fibroblasts were more resistant to oxidative agents than the other NER deficient fibroblasts, despite presenting the highest of 8-oxodG. Furthermore, subtle changes in the nuclear and mitochondrial localization of APE1 were detected in XP-C fibroblasts. To confirm the impact of XPC deficiency in the regulation of APE1 and OGG1 expression and activity, we constructed a XPC-complemented cell line. Although the XPC complementation was only partial, we found that XPC-complemented cells presented increased levels of OGG1 than XPC-deficient cells. The extracts from XPC-complemented cells also presented an elevated OGG1 enzimatic activity. However, it was not observed changes in APE1 expression and activity in the XPCcomplemented cells. In addition, we found that full-length APE1 (37 kDa) and OGG1- �� are in the mitochondria of XPC-deficient fibroblasts and XPC-complemented fibroblasts before and after induction of oxidative stress. On the other hand, the expression of APE1 and PARP-1 are not altered in brain and liver of XPC knockout mice. However, XPC deficiency changed the APE1 localization in hypoccampus and hypothalamus. We also observed a physical interaction between XPC and APE1 proteins in human cells. In conclusion, the data suggest that XPC protein has a role in the regulation of OGG1 expression and activity in human cells and is involved mainly in the regulation of APE1 localization in mice. Aditionally, the response of NER deficient cells under oxidative stress may not be only associated to the NER deficiency per se, but it may include the new functions of NER enzymes in regulation of expression and cell localization of BER proteins

An��lise da express��o de APE1 ap��s estresse oxidativo induzido em c��lulas proficientes e deficientes na via de reparo por excis��o de nucleot��deos.

Riboflavin is a vitamin very important in aerobic organisms, as a precursor of many coenzymes involved in the electron transporter chain. However, after photosensitization of riboflavin with UV or visible light, it generates reactive oxygen species (ROS), which can oxidize the DNA. The repair of oxidative lesions on DNA occurs through the base excision repair pathway (BER), where APE1 endonuclease plays a central role. On the other hand, the nucleotide excision repair pathway (NER) repairs helix-distorting lesions. Recently, it was described the participation of NERproteins in the repair of oxidative damage and in stimulation of repair function fromAPE1. The aim of this research was to evaluate the cytotoxic effects of photosensitized riboflavin (RF*) in cells proficient and deficient in NER, correlating with APE1 expression. For this propose, the cells were treated with RF* and it was performed the cell viability assay, extraction of whole proteins, cells fractionation, immunoblotting, indirect immunofluorescence and analysis of polymorphisms of BER gens. The results evidenced that cells deficient in XPA and CSB proteins were more sensitive to RF*. However, XPC-deficient cells presented similar resistance to MRC5- SV cells, which is proficient in NER. These results indicate that XPA and CSB proteins have an important role on repair of oxidative lesions induced by RF*. Additionally, it was evidenced that single nucleotide polymorphisms (SNPs) in BER enzymes may influence in sensitivity of NER-deficient cell lines. Concerning the APE1 expression, the results showed that expression of this protein after treatment with RF* only changed in XPC-deficient cells. Though, it was observed that APE1 is recruited and is bound to chromatin in MRC5-SV and XPA cells after treatment with RF*. The results also showed the induction of DNA damage after treatment with RF*, through the analysis of-H2AX, since the treatment promoted an increase of endogenous levels of this phosphorylated protein, which acts signaling double strand-break on DNA. On the other hand, in XPC-deficient cells, regardless of resistance of RF*, the endogenous levels of APE1 are extremely reduced when compared with other cell lines and APE1 is not bound to chromatin after treatment with RF*. These results conclude that RF* was able to induce cell death in NERdeficient cells, where XPA and CSB cells were more sensitive when compared with MRC5-SV and XPC-deficient cells. This last result is potentially very interesting, since XPC-deficient cell line presents low levels of APE1. Additionally, the results evidenced that APE1 protein can be involved in the repair of oxidative damage induced by RF*, because APE1 is recruited and bound strongly to chromatin after treatment.

Ceramic membranes for separation of proteins and DNA by in situ growth of alumina nanofibres with a nanomesh of metal oxide nanofibres

Ceramic membranes were fabricated by in situ synthesis of alumina nanofibres in the pores of an alumina support as a separation layer, and exhibited a high permeation selectivity for bovine serum albumin relative to bovine hemoglobin (over 60 times) and can effectively retain DNA molecules at high fluxes.

Synchronous fluorescence and UV���vis spectroscopic studies of interactions between the tetracycline antibiotic, aluminium ions and DNA with the aid of the Methylene Blue dye probe

Synchronous fluorescence spectroscopy (SFS) was applied for the investigation of interactions of the antibiotic, tetracycline (TC), with DNA in the presence of aluminium ions (Al3+). The study was facilitated by the use of the Methylene Blue (MB) dye probe, and the interpretation of the spectral data with the aid of the chemometrics method, parallel factor analysis (PARAFAC). Three-way synchronous fluorescence analysis extracted the important optimum constant wavelength differences, ����, and showed that for the TC���Al3+���DNA, TC���Al3+ and MB dye systems, the associated ���� values were different (���� = 80, 75 and 30 nm, respectively). Subsequent PARAFAC analysis demonstrated the extraction of the equilibrium concentration profiles for the TC���Al3+, TC���Al3+���DNA and MB probe systems. This information is unobtainable by conventional means of data interpretation. The results indicated that the MB dye interacted with the TC���Al3+���DNA surface complex, presumably via a reaction intermediate, TC���Al3+���DNA���MB, leading to the displacement of the TC���Al3+ by the incoming MB dye probe.

Enhancement of DNA repair using topical T4 endonuclease V does not inhibit melanoma formation in Cdk4R24C/R24C/Tyr-NrasQ61K mice following neonatal UVR

To further investigate the use of DNA repair-enhancing agents for skin cancer prevention, we treated Cdk4R24C/R24C/NrasQ61K mice topically with the T4 endonuclease V DNA repair enzyme (known as Dimericine) immediately prior to neonatal ultraviolet radiation (UVR) exposure, which has a powerful effect in exacerbating melanoma development in the mouse model. Dimericine has been shown to reduce the incidence of basal-cell and squamous cell carcinoma. Unexpectedly, we saw no difference in penetrance or age of onset of melanoma after neonatal UVR between Dimericine-treated and control animals, although the drug reduced DNA damage and cellular proliferation in the skin. Interestingly, epidermal melanocytes removed cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) more efficiently than surrounding keratinocytes. Our study indicates that neonatal UVR-initiated melanomas may be driven by mechanisms other than solely that of a large CPD load and/or their inefficient repair. This is further suggestive of different mechanisms by which UVR may enhance the transformation of keratinocytes and melanocytes.