cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors

cagA, a gene that codes for an immunodominant antigen, is present only in Helicobacter pylori strains that are associated with severe forms of gastroduodenal disease (type I strains). We found that the genetic locus that contains cagA (cag) is part of a 40-kb DNA insertion that likely was acquired horizontally and integrated into the chromosomal glutamate racemase gene. This pathogenicity island is flanked by direct repeats of 31 bp. In some strains, cag is split into a right segment (cagI) and a left segment (cagII) by a novel insertion sequence (IS605). In a minority of H. pylori strains, cagI and cagII are separated by an intervening chromosomal sequence. Nucleotide sequencing of the 23,508 base pairs that form the cagI region and the extreme 3′ end of the cagII region reveals the presence of 19 ORFs that code for proteins predicted to be mostly membrane associated with one gene (cagE), which is similar to the toxin-secretion gene of Bordetella pertussis, ptlC, and the transport systems required for plasmid transfer, including the virB4 gene of Agrobacterium tumefaciens. Transposon inactivation of several of the cagI genes abolishes induction of IL-8 expression in gastric epithelial cell lines. Thus, we believe the cag region may encode a novel H. pylori secretion system for the export of virulence determinants.

Risk factors for coronary heart disease and infection with Helicobacter pylori: meta-analysis of 18 studies

Objective: To find out if chronic infection with Helicobacter pylori is correlated with risk factors for coronary heart disease.

Helicobacter pylori attachment to gastric cells induces cytoskeletal rearrangements and tyrosine phosphorylation of host cell proteins.

The consequences of Helicobacter pylori attachment to human gastric cells were examined by transmission electron microscopy and immunofluorescence microscopy. H. pylori attachment resulted in (i) effacement of microvilli at the site of attachment, (ii) cytoskeletal rearrangement directly beneath the bacterium, and (iii) cup/pedestal formation at the site of attachment. Double-immunofluorescence studies revealed that the cytoskeletal components actin, alpha-actinin, and talin are involved in the process. Immunoblot analysis showed that binding of H. pylori to AGS cells induced tyrosine phosphorylation of two host cell proteins of 145 and 105 kDa. These results indicate that attachment of H. pylori to gastric epithelial cells resembles that of enteropathogenic Escherichia coli. Coccoid H. pylori, which are thought to be terminally differentiated bacterial forms, are capable of binding and inducing cellular changes of the same sort as spiral H. pylori, including tyrosine phosphorylation of host proteins.

Identification and characterization of periplasmic proteins implicated in the adaptation of Helicobacter pylori to the human gastric niche

Helicobacter pylori è un batterio Gram-negativo in grado di colonizzare la mucosa gastrica umana e persistere per l'intero arco della vita dell'ospite. E' associato a patologie gastrointestinali, quali gastrite cronica, ulcere gastriche e duodenali, adenocarcinomi e linfomi gastrici. Si tratta di uno dei patogeni più diffusi, presente in circa metà della popolazione mondiale, e il solo che si è adattato a vivere nell'ambiente ostile dello stomaco umano. Molteplici sono i fattori di virulenza che permettono al batterio la colonizzazione della nicchia gastrica e contribuiscono, anche attraverso l' induzione di una risposta infiammatoria, a profonde modificazioni dell' omeostasi gastrica. Queste ultime si associano, ad esempio, all'iperproduzione di fattori proinfiammatori, ad alterazioni sia della regolazione della secrezione acida gastrica sia del ciclo cellulare e della morte cellulare programmata (apoptosi) delle cellule epiteliali gastriche, a disordini nel metabolismo del ferro e a carenze di elementi essenziali. Studi sulla diversità genetica di H. pylori osservata in ceppi isolati da varie regioni del mondo, dimostrano che tale batterio ha avuto una coevoluzione col genere umano attraverso la storia, ed è verosimile che H. pylori sia stato un costituente del microbiota gastrico per almeno 50.000 anni. Scopo della tesi è stato quello di identificare e caratterizzare proteine importanti per la colonizzazione e l'adattamento di H. pylori alla nicchia gastrica. In particolare gli sforzi si sono concentrati su due proteine periplasmatiche, la prima coinvolta nella difesa antiossidante (l'enzima catalasi-like, HP0485), e la seconda nel trasporto di nutrienti presenti nell'ambiente dello stomaco all'interno della cellula (la componente solubile di un ABC transporter, HP0298). La strategia utilizzata prevede un'analisi bioinformatica preliminare, l'ottenimento del gene per amplificazione, mediante PCR, dal genoma dell'organismo, la costruzione di un vettore per il clonaggio, l'espressione eterologa in E. coli e la successiva purificazione. La proteina così ottenuta viene caratterizzata mediante diverse tecniche, quali spettroscopia UV, dicroismo circolare, gel filtrazione analitica, spettrometria di massa. Il capitolo 1 contiene un'introduzione generale sul batterio, il capitolo 2 e il capitolo 3 descrivono gli studi relativi alle due proteine e sono entrambi suddivisi in un abstract iniziale, un'introduzione, la presentazione dei risultati, la discussione di questi ultimi, i materiali e i metodi utilizzati. La catalasi-like (HP0485) è una proteina periplasmatica con struttura monomerica, appartenente ad una famiglia di enzimi a funzione per la maggior parte sconosciuta, ma evolutivamente correlati alla ben nota catalasi, attore fondamentale nella difesa di H. pylori, grazie alla sua azione specifica di rimozione dell'acqua ossigenata. HP0485, pur conservando il fold catalasico e il legame al cofattore eme, non può compiere la reazione di dismutazione dell'acqua ossigenata; possiede invece un'attività perossidasica ad ampio spettro, essendo in grado di accoppiare la riduzione del perossido di idrogeno all'ossidazione di diversi substrati. Come la catalasi, lavora ad alte concentrazioni di aqua ossigenata e non arriva a saturazione a concentrazioni molto elevate di questo substrato (200 mM); la velocità di reazione catalizzata rimane lineare anche a questi valori, aspetto che la differenzia dalle perossidasi che vengono in genere inattivate da concentrazioni di perossido di idrogeno superiori a 10-50 mM. Queste caratteristiche di versatilità e robustezza suggeriscono che la catalasi-like abbia un ruolo di scavenger dell'acqua ossigenata e probabilmente anche un'altra funzione connessa al suo secondo substrato, ossia l'ossidazione di composti nello spazio periplasmatico cellulare. Oltre alla caratterizzazione dell'attività è descritta anche la presenza di un ponte disolfuro, conservato nelle catalasi-like periplasmatiche, con un ruolo nell'assemblaggio dell'eme per ottenere un enzima attivo e funzionale. La proteina periplasmatica HP0298, componente di un sistema di trasporto ABC, è classificata come trasportatore di dipeptidi e appartiene a una famiglia di proteine in grado di legare diversi substrati, tra cui di- e oligopeptidi, nichel, eme, glutatione. Benchè tutte associate a trasportatori di membrana batterici, queste proteine presentano un dominio di legame al substrato che risulta essere conservato nei domini extracellulari di recettori specifici di mammifero e uomo. Un esempio sono i recettori ionotropici e metabotropici del sistema nervoso. Per caratterizzare questa proteina è stato messo a punto un protocollo di ligand-fishing accoppiato alla spettrometria di massa. La proteina purificata, avente un tag di istidine, è stata incubata con un estratto cellulare di H. pylori per poter interagire con il suo substrato specifico all'interno dell'ambiente naturale in cui avviene il legame. Il complesso proteina-ligando è stato poi purificato per cromatografia di affinità e analizzato mediante HPLC-MS. L'identificazione dei picchi differenziali tra campioni con la proteina e 5 campioni di controllo ha portato alla caratterizzazione di pentapeptidi particolarmente ricchi in aminoacidi idrofobici e con almeno un residuo carico negativamente. Considerando che H. pylori necessita di alcuni aminoacidi essenziali, per la maggior parte idrofobici, e che lo stomaco umano è particolarmente ricco di peptidi prodotti dalla digestione delle proteine introdotte con il cibo, il ruolo fisiologico di HP0298 potrebbe essere l'internalizzazione di peptidi, con caratteristiche specifiche di lunghezza e composizione, che sono naturalmente presenti nella nicchia gastrica.

Stool antigen testing for the diagnosis and confirmation of eradication of Helicobacter pylori infection

No Abstract

Novel inhibitors of the tRNA-dependent amidotransferase of "Helicobacter pylori": Peptides generated by phage display and dipeptide-like compounds

Cette thèse présente la découverte de nouveaux inhibiteurs de l’amidotransférase ARNt-dépendante (AdT), et résume les connaissances récentes sur la biosynthèse du Gln-ARNtGln et de l’Asn-ARNtAsn par la voie indirecte chez la bactérie Helicobacter pylori. Dans le cytoplasme des eucaryotes, vingt acides aminés sont liés à leur ARNt correspondant par vingt aminoacyl-ARNt synthétases (aaRSs). Ces enzymes sont très spécifiques, et leur fonction est importante pour le décodage correct du code génétique. Cependant, la plupart des bactéries, dont H. pylori, sont dépourvues d’asparaginyl-ARNt synthétase et/ou de glutaminyl-ARNt synthétase. Pour former le Gln-ARNtGln, H. pylori utilise une GluRS noncanonique nommée GluRS2 qui glutamyle spécifiquement l’ARNtGln ; ensuite, une AdT trimérique, la GatCAB corrige le Glu-ARNtGln mésapparié en le transamidant pour former le Gln-ARNtGln, qui lira correctement les codons glutamine pendant la biosynthèse des protéines sur les ribosomes. La formation de l’Asn-ARNtAsn est similaire à celle du Gln-ARNtGln, et utilise la même GatCAB et une AspRS non-discriminatrice. Depuis des années 2000, la GatCAB est considérée comme une cible prometteuse pour le développement de nouveaux antibiotiques, puisqu’elle est absente du cytoplasme de l’être humain, et qu’elle est encodée dans le génome de plusieurs bactéries pathogènes. Dans le chapitre 3, nous présentons la découverte par la technique du « phage display » de peptides cycliques riches en tryptophane et en proline, et qui inhibent l’activité de la GatCAB de H. pylori. Les peptides P10 (CMPVWKPDC) et P9 (CSAHNWPNC) inhibent cette enzyme de façon compétitive par rapport au substrat Glu-ARNtGln. Leur constante d’inhibition (Ki) est 126 μM pour P10, et 392 μM pour P9. Des modèles moléculaires ont montré qu’ils lient le site actif de la réaction de transmidation catalysée par la GatCAB, grâce à la formation d’une interaction π-π entre le résidu Trp de ces peptides et le résidu Tyr81 de la sous-unité GatB, comme fait le A76 3’-terminal de l’ARNt. Dans une autre étude concernant des petits composés contenant un groupe sulfone, et qui mimiquent l’intermédiaire de la réaction de transamidation, nous avons identifié des composés qui inhibent la GatCAB de H. pylori de façon compétitive par rapport au substrat Glu-ARNtGln. Cinq fois plus petits que les peptides cycliques mentionnés plus haut, ces composés inhibent l’activité de la GatCAB avec des Ki de 139 μM pour le composé 7, et de 214 μM pour le composé 4. Ces inhibiteurs de GatCAB pourraient être utiles pour des études mécanistiques, et pourraient être des molécules de base pour le développement de nouvelles classes d’antibiotiques contre des infections causées par H. pylori.

Oral and gastric helicobacter pylori : Effects and associations

This study consisted in the comparison of the prevalence of Helicobacter pylori (H. pylori) present in the stomach and in saliva of a sample of Portuguese adolescents and the assessment of the association between H. pylori infection with socio-demographic variables and prevalence of dental caries.