995 resultados para signalisation cellulaire
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La Sclrose Latrale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodgnrative qui affecte les neurones moteurs. 10% des cas sont des cas familiaux et ltude de ces familles a men la dcouverte de plusieurs gnes pouvant causer la SLA, incluant SOD1, TARDBP et FUS. Lexpansion de la rptition GGGGCC dans le gne C9orf72 est, ce jour, la cause la plus connue de SLA. Limpact de cette expansion est encore mconnu et il reste dterminer si la toxicit est cause par un gain de fonction, une perte de fonction ou les deux. Plusieurs gnes impliqus dans la SLA sont conservs entre le nmatode Caenorhabditis elegans et lhumain. C. elegans est un vers transparent frquemment utilis pour des tudes anatomiques, comportementales et gntiques. Il possde une ligne cellulaire invariable qui inclue 302 neurones. Aussi, les mcanismes de rponse au stress ainsi que les mcanismes de vieillissement sont trs bien conservs entre ce nmatode et lhumain. Donc, notre groupe, et plusieurs autres, ont utilis C. elegans pour tudier plusieurs aspects de la SLA. Pour mieux comprendre la toxicit cause par lexpansion GGGGCC de C9orf72, nous avons dvelopp deux modles de vers pour tudier limpact dune perte de fonction ainsi que dun gain de toxicit de lARN. Pour voir les consquences dune perte de fonction, nous avons tudi lorthologue de C9orf72 dans C. elegans, alfa-1 (ALS/FTD associated gene homolog). Les vers mutants alfa-1(ok3062) dveloppent des problmes moteurs causant une paralysie et une dgnrescence spcifique des neurones moteurs GABAergiques. De plus, les mutants sont sensibles au stress osmotique qui provoque une dgnrescence. Dautre part, lexpression de la squence dARN contenant une rptition pathognique GGGGCC cause aussi des problmes moteurs et de la dgnrescence affectant les neurones moteurs. Nos rsultats suggrent donc quun gain de toxicit de lARN ainsi quune perte de fonction de C9orf72 sont donc toxiques pour les neurones. Puisque le mouvement du vers peut tre rapidement valu en cultivant les vers dans un milieu liquide, nous avons dvelopp un criblage de molcules pouvant affecter le mouvement des vers mutants alfa-1 en culture liquide. Plus de 4 000 composs ont t valus et 80 ameliore la mobilit des vers alfa-1. Onze molcules ont aussi t testes dans les vers exprimant lexpansion GGGGCC et huit diminuent aussi le phnotype moteur de ces vers. Finalement, des huit molcules qui diminent la toxicit cause par la perte de fonction de C9orf72 et la toxicit de lARN, deux restaurent aussi lexpression anormale de plusieurs transcrits dARN observe dans des cellules drives de patient C9orf72. Avec ce projet, nous voulons identifier des molcules pouvant affecter tous les modes de toxicit de C9orf72 et possiblement ouvrir de nouvelles avenues thrapeutiques
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Lobsit est un facteur de risque li des problmes physiques, motionnels et comportementaux. Aujourdhui, lalimentation est compose dun rgime typiquement occidental Western diet qui est riche en acides gras saturs (AGS) et pauvre en acides gras polyinsaturs (AGPI) tel que les omga-3 (N-3) et occasionnant un dsquilibre du ratio alimentaire N-6/N-3. Ce dsquilibre est une des causes de la prvalence des maladies mentales y compris celles des troubles de l'humeur et de lanxit. Lacide docosahexanoque (ADH, 22: 6 n-3) est lacide gras (AG) le plus abondant dans le cerveau et son accumulation est particulirement leve pendant la priode prinatale. Il joue un rle important dans le dveloppement neuronal et d'autres fonctions du cerveau tel l'apprentissage et la mmoire. Des perturbations de lenvironnement prinatal peuvent influencer trs long terme lavenir de la descendance en la rendant plus susceptible de dvelopper des problmes dobsit dans un contexte nutritionnel riche. On ignore cependant si le dficit alimentaire chez la mre et particulirement en ADH aura un impact sur la motivation alimentaire de la progniture. Lobjectif principal de cette thse est dtudier le rle potentiel des N-3 sur la balance nergtique, la motivation alimentaire, la dpression et le niveau danxit des descendants de souris mles adultes assujetties une alimentation riche en gras. Nos donnes ont dmontr quun rgime maternel dficitaire en ADH durant la priode prinatale incitait la descendance fournir plus deffort afin dobtenir un aliment palatable. Ceci entranerait un drglement de lhomostasie nergtique en augmentant le gain de poids et en diminuant lactivit locomotrice tout en exacerbant le comportement de type anxieux ds que les souris sont exposes un milieu obsogne. Les acides gras libres (AGL) sont des nutriments essentiels fonctionnant comme des molcules de signalisation dans le cerveau en ayant des rcepteurs qui jouent un rle important dans le contrle du mtabolisme nergtique. Parmi eux, on distingue un rcepteur coupl la protine G (GPCR), le GPR120. Ce rcepteur activ par les AGPI -3 intervient dans les mcanismes anti-inflammatoires et insulino-rsistants via les N-3. Une mutation dans le gne GPR120 occasionne par une rduction de lactivit de signalisation du gne est lie lobsit humaine. L'objectif premier de cette deuxime tude tait dvaluer l'impact de la stimulation pharmacologique de GPR120 dans le systme nerveux central (SNC) sur l'alimentation, les dpenses d'nergie, le comportement de type anxieux et la rcompense alimentaire. Nos rsultats dmontrent quune injection centrale aigu d'agoniste GPR120 III rduit la prise alimentaire ad libitum et la motivation alimentaire pour un aliment riche en gras et en sucre; ainsi que les comportements de type anxieux. Linjection centrale chronique (21 jours) de ce mme agoniste GPR120 III transmis par une pompe osmotique a dmontr que les souris places sous dite hypercalorique (HFD nont prsent aucune modification lors de la prise alimentaire ni de gain de poids mais quil y avait comparativement au groupe de vhicule, une rduction du comportement de type anxieux, que ce soit dans le labyrinthe en croix surlev (LCS) ou dans le test champ ouvert (OFT). LADH est reconnu pour ses proprits anorexignes au niveau central. De plus, la stimulation des rcepteurs de GPR120 au niveau du cerveau avec un agoniste synthtique peut produire un effet intense intervenir sur le comportement li l'alimentation des rongeurs. Trouver une approche visant contrler la fois la neuroinflammation, la rcompense alimentaire et les troubles motionnels aiderait assurment au traitement de l'obsit et du diabte de type 2.
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La maladie du greffon contre lhte (GVHD) est la principale cause de mortalit et de morbidit suite aux greffes de cellules souches hmatopotiques. Plusieurs patients demeurent rfractaires aux traitements actuels ce qui rend ncessaire le dveloppement de nouvelles stratgies afin de combattre cette maladie. Dans ltude qui suit, nous avons utilis un nouvel agent thrapeutique, le TH9402, une molcule photosensible et dmontr quelle permet, lorsquexpose la lumire visible (514 nm), dliminer slectivement les cellules T actives in vivo tout en prservant les cellules T au repos et les cellules T rgulatrices (Tregs). Les Tregs ainsi prservs peuvent abroger la rponse alloractive par la scrtion dIL-10 ou par contact cellule-cellule via un mcanisme impliquant le CTLA-4. Nous avons dcouvert que la signalisation du CTLA-4 tait associe une hausse de la population Treg in vitro. Cette hausse est due la conversion de cellules T CD4+CD25- en Tregs et non une prolifration slective des Tregs. Dans la deuxime partie de cette tude, nous avons dmontr que la signalisation de CTLA-4 tait associe une augmentation de lexpression de la protine Indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO). Ces effets ncessitent la dpltion du tryptophane ainsi que de la protine de phase aigue GCN2. Finalement, nous avons observ que linfusion de cellules traites au TH9402 chez des patients souffrant de GVHD chronique est associe une augmentation de la population Treg chez ces patients sans causer de lymphopnie ni de diminution de la rponse immunitaire dirige contre les antignes viraux. Ces rsultats suggrent que le traitement au TH9402 pourrait reprsenter une approche particulirement intressante pour le traitement de la GVHD chronique rfractaire aux traitements actuels. De plus, laugmentation de lexpression dIDO pourrait tre utilise comme valeur prdictive de la rponse du patient au traitement. Ceci pourrait permettre damliorer la qualit de soins ainsi que de la qualit de vie des patients souffrant de GVHD chronique.
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La spectromtrie de masse mesure la masse des ions selon leur rapport masse sur charge. Cette technique est employe dans plusieurs domaines et peut analyser des mlanges complexes. Limagerie par spectromtrie de masse (Imaging Mass Spectrometry en anglais, IMS), une branche de la spectromtrie de masse, permet lanalyse des ions sur une surface, tout en conservant lorganisation spatiale des ions dtects. Jusqu prsent, les chantillons les plus tudis en IMS sont des sections tissulaires vgtales ou animales. Parmi les molcules couramment analyses par lIMS, les lipides ont suscit beaucoup d'intrt. Les lipides sont impliqus dans les maladies et le fonctionnement normal des cellules; ils forment la membrane cellulaire et ont plusieurs rles, comme celui de rguler des vnements cellulaires. Considrant limplication des lipides dans la biologie et la capacit du MALDI IMS les analyser, nous avons dvelopp des stratgies analytiques pour la manipulation des chantillons et lanalyse de larges ensembles de donnes lipidiques. La dgradation des lipides est trs importante dans lindustrie alimentaire. De la mme faon, les lipides des sections tissulaires risquent de se dgrader. Leurs produits de dgradation peuvent donc introduire des artefacts dans lanalyse IMS ainsi que la perte despces lipidiques pouvant nuire la prcision des mesures dabondance. Puisque les lipides oxyds sont aussi des mdiateurs importants dans le dveloppement de plusieurs maladies, leur relle prservation devient donc critique. Dans les tudes multi-institutionnelles o les chantillons sont souvent transports dun emplacement lautre, des protocoles adapts et valids, et des mesures de dgradation sont ncessaires. Nos principaux rsultats sont les suivants : un accroissement en fonction du temps des phospholipides oxyds et des lysophospholipides dans des conditions ambiantes, une diminution de la prsence des lipides ayant des acides gras insaturs et un effet inhibitoire sur ses phnomnes de la conservation des sections au froid sous N2. A temprature et atmosphre ambiantes, les phospholipides sont oxyds sur une chelle de temps typique dune prparation IMS normale (~30 minutes). Les phospholipides sont aussi dcomposs en lysophospholipides sur une chelle de temps de plusieurs jours. La validation dune mthode de manipulation dchantillon est dautant plus importante lorsquil sagit danalyser un plus grand nombre dchantillons. Lathrosclrose est une maladie cardiovasculaire induite par laccumulation de matriel cellulaire sur la paroi artrielle. Puisque lathrosclrose est un phnomne en trois dimension (3D), l'IMS 3D en srie devient donc utile, d'une part, car elle a la capacit localiser les molcules sur la longueur totale dune plaque athromateuse et, d'autre part, car elle peut identifier des mcanismes molculaires du dveloppement ou de la rupture des plaques. l'IMS 3D en srie fait face certains dfis spcifiques, dont beaucoup se rapportent simplement la reconstruction en 3D et linterprtation de la reconstruction molculaire en temps rel. En tenant compte de ces objectifs et en utilisant lIMS des lipides pour ltude des plaques dathrosclrose dune carotide humaine et dun modle murin dathrosclrose, nous avons labor des mthodes open-source pour la reconstruction des donnes de lIMS en 3D. Notre mthodologie fournit un moyen dobtenir des visualisations de haute qualit et dmontre une stratgie pour linterprtation rapide des donnes de lIMS 3D par la segmentation multivarie. Lanalyse daortes dun modle murin a t le point de dpart pour le dveloppement des mthodes car ce sont des chantillons mieux contrls. En corrlant les donnes acquises en mode dionisation positive et ngative, lIMS en 3D a permis de dmontrer une accumulation des phospholipides dans les sinus aortiques. De plus, lIMS par AgLDI a mis en vidence une localisation diffrentielle des acides gras libres, du cholestrol, des esters du cholestrol et des triglycrides. La segmentation multivarie des signaux lipidiques suite lanalyse par IMS dune carotide humaine dmontre une histologie molculaire corrle avec le degr de stnose de lartre. Ces recherches aident mieux comprendre la complexit biologique de lathrosclrose et peuvent possiblement prdire le dveloppement de certains cas cliniques. La mtastase au foie du cancer colorectal (Colorectal cancer liver metastasis en anglais, CRCLM) est la maladie mtastatique du cancer colorectal primaire, un des cancers le plus frquent au monde. Lvaluation et le pronostic des tumeurs CRCLM sont effectus avec lhistopathologie avec une marge derreur. Nous avons utilis lIMS des lipides pour identifier les compartiments histologiques du CRCLM et extraire leurs signatures lipidiques. En exploitant ces signatures molculaires, nous avons pu dterminer un score histopathologique quantitatif et objectif et qui corrle avec le pronostic. De plus, par la dissection des signatures lipidiques, nous avons identifi des espces lipidiques individuelles qui sont discriminants des diffrentes histologies du CRCLM et qui peuvent potentiellement tre utilises comme des biomarqueurs pour la dtermination de la rponse la thrapie. Plus spcifiquement, nous avons trouv une srie de plasmalognes et sphingolipides qui permettent de distinguer deux diffrents types de ncrose (infarct-like necrosis et usual necrosis en anglais, ILN et UN, respectivement). LILN est associ avec la rponse aux traitements chimiothrapiques, alors que lUN est associ au fonctionnement normal de la tumeur.
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L'hypothyrodie congnitale par dysgnsie thyrodienne (HCDT, ectopie dans plus de 80 %) a une prvalence de 1 cas sur 4000 naissances vivantes. LHCDT est la consquence d'une dfaillance de la thyrode embryonnaire se diffrencier, se maintenir ou migrer vers sa localisation anatomique (partie antrieure du cou), qui aboutit une absence totale de la thyrode (athyrose) ou une ectopie thyrodienne (linguale ou sublinguale). Les HCDT sont principalement non-syndromiques (soit 98% des cas sont non-familiale), ont un taux de discordance de 92% chez les jumeaux monozygotes, et ont une prdominance fminine et ethnique (i.e., Caucasienne). La majorit des cas dHCDT na pas de cause connue, mais est associe un dficit svre en hormones thyrodiennes (hypothyrodie). Des mutations germinales dans les facteurs de transcription lis la thyrode (NKX2.1, FOXE1, PAX8, NKX2.5) ont t identifies dans seulement 3% des patients atteints dHCDT sporadiques et lanalyse de liaisons exclue ces gnes dans les rares familles multiplex avec HCDT. Nous supposons que le manque de transmission familiale claire dHCDT peut rsulter de la ncessit dau moins deux hits gntiques diffrents dans des gnes importants pour le dveloppement thyrodien. Pour rpondre au mieux nos questions de recherche, nous avons utilis deux approches diffrentes: 1) une approche gne candidat, FOXE1, seul gne impliqu dans lectopie dans le modle murin et 2) une approche en utilisant les techniques de squenage de nouvelle gnration (NGS) afin de trouver des variants gntiques pouvant expliquer cette pathologie au sein dune cohorte de patients avec HCDT. Pour la premire approche, une tude cas-contrles a t ralise sur le promoteur de FOXE1. Il a rcemment t dcouvert quune rgion du promoteur de FOXE1 est diffrentiellement mthyle au niveau de deux dinuclotides CpG conscutifs, dfinissant une zone cruciale de contrle de lexpression de FOXE1. Lanalyse dassociation base sur les haplotypes a rvl quun haplotype (Hap1: ACCCCCCdel1C) est associ avec le HCDT chez les Caucasiens (p = 5x10-03). Une rduction significative de lactivit lucifrase est observe pour Hap1 (rduction de 68%, p<0.001) compar au promoteur WT de FOXE1. Une rduction de 50% de lexpression de FOXE1 dans une ligne de cellules thyrodienne humaine est suffisante pour rduire significativement la migration cellulaire (rduction de 55%, p<0.05). Un autre haplotype (Hap2: ACCCCCCC) est observ moins frquemment chez les Afro-Amricain compars aux Caucasiens (p = 1.7x10-03) et Hap2 diminue lactivit lucifrase (rduction de 26%, p<0.001). Deux haplotypes distincts sont trouvs frquemment dans les contrles Africains (Black-African descents). Le premier haplotype (Hap3: GTCCCAAC) est frquent (30.2%) chez les contrles Afro-Amricains compars aux contrles Caucasiens (6.3%; p = 2.59 x 10-9) tandis que le second haplotype (Hap4: GTCCGCAC) est trouv exclusivement chez les contrles Afro-Amricains (9.4%) et est absent chez les contrles Caucasiens (P = 2.59 x 10-6). Pour la deuxime approche, le squenage de lexome de lADN leucocytaire entre les jumeaux MZ discordants na rvl aucune diffrence. D'o l'intrt du projet de squenage de lADN et lARN de thyrodes ectopiques et orthotopiques dans lesquelles de l'expression monoalllique alatoire dans a t observe, ce qui pourrait expliquer comment une mutation monoalllique peut avoir des consquences pathogniques. Finalement, le squenage de lexome dune cohorte de 36 cas atteints dHCDT a permis didentifier de nouveaux variants probablement pathogniques dans les gnes rcurrents RYR3, SSPO, IKBKE et TNXB. Ces quatre gnes sont impliqus dans ladhsion focale (jouant un rle dans la migration cellulaire), suggrant un rle direct dans les dfauts de migration de la thyrode. Les essais de migration montrent une forte diminution (au moins 60% 5h) de la migration des cellules thyrodiennes infectes par shRNA compars au shCtrl dans 2 de ces gnes. Des zebrafish KO (-/- et +/-) pour ces nouveaux gnes seront raliss afin dvaluer leur impact sur lembryologie de la thyrode.
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Lostoporose est une maladie caractrise par une faible masse osseuse et une dtrioration du tissu osseux. Cette condition entrane une plus grande fragilit osseuse et des risques de fractures. Plusieurs tudes ont associ lostoporose la faible densit osseuse des mandibules, la perte dattache parodontale, laugmentation de la hauteur de la crte alvolaire et la chute des dents. Cette tude vise comprendre les mcanismes sous-jacents cette perte osseuse. En effet, au cours du dveloppement des souris, PITX1 joue un rle cl dans l'identit des membres postrieurs et dans le bon dveloppement des mandibules et des dents. Son inactivation complte chez la souris mne un phnotype squelettique svre. Tandis que, son inactivation partielle provoque des symptmes apparents l'arthrose avec une augmentation de la masse osseuse au niveau de los cortical et de los trabculaire. Inversement, une tude antrieure chez des jumelles monozygotiques discordantes pour lostoporose, montrent une augmentation denviron 8.6 fois du niveau dexpression du gne Pitx1 chez la jumelle ostoporotique. Collectivement, ces donnes nous ont pousss investiguer sur le rle du facteur de transcription PITX1 dans le mtabolisme osseux normal et pathologique. Dans ce contexte, des souris transgniques Col11-Pitx1 sur-exprimant Pitx1 spcifiquement dans le tissu osseux sous le promoteur du collagne de type-I (fragment 2.1kpb) ont t gnres et phnotypiquement caractrises. Ces rsultats ont rvel que les souris transgniques Col11-Pitx1 prsentaient un phnotype similaire celui des patients ostoporotiques accompagn d'une perte de dents et des problmes dentaires et parodontaux. De plus, cette tude a rvl que la surexpression de Pitx1 induit une altration de lhomostasie osseuse via linactivation de la voie de signalisation Wnt/-catnine canonique. Cette hypothse a t appuye par le fait que le traitement des souris transgniques Col11-Pitx1 avec du chlorure de lithium, un activateur de la voie Wnt canonique, prvient le phnotype ostoporotique chez ces souris. Finalement, cette tude tablit un rle crucial de PITX1 dans la rgulation de la masse osseuse et une implication possible dans lostoporose et les maladies parodontales via linactivation de la voie de signalisation Wnt/-catnine canonique.
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La possibilit de programmer une cellule dans le but de produire une protine dintrt est apparue au dbut des annes 1970 avec lessor du gnie gntique. Environ dix annes plus tard, linsuline issue de la plateforme de production microbienne Escherichia coli, fut la premire protine recombinante (r-protine) humaine commercialise. Les dfis associs la production de r-protines plus complexes et glycosyles ont amen lindustrie biopharmaceutique dvelopper des systmes dexpression en cellules de mammifres. Ces derniers permettent dobtenir des protines humaines correctement replies et de ce fait, biologiquement actives. Afin de transfrer le gne dintrt dans les cellules de mammifres, le polythylnimine (PEI) est certainement un des vecteurs synthtiques le plus utilis en raison de son efficacit, mais aussi sa simplicit dlaboration, son faible cot et sa stabilit en solution qui facilite son utilisation. Il est donc largement employ dans le contexte de la production de r-protines grande chelle et fait lobjet dintenses recherches dans le domaine de la thrapie gnique non virale. Le PEI est capable de condenser efficacement lADN plasmidique (vecteur dexpression contenant le gne dintrt) pour former des complexes de petites tailles appels polyplexes. Ces derniers doivent contourner plusieurs tapes limitantes afin de dlivrer le gne dintrt au noyau de la cellule hte. Dans les conditions optimales du transfert de gne par le PEI, les polyplexes arborent une charge positive nette interagissant de manire lectrostatique avec les protoglycanes hparane sulfate (HSPG) qui dcorent la surface cellulaire. On observe deux familles dHSPG exprims en abondance la surface des cellules de mammifres : les syndcanes (4 membres, SDC1-4) et les glypicanes (6 membres, GPC1-6). Si limplication des HSPG dans lattachement cellulaire des polyplexes est aujourdhui largement accepte, leur rle individuel vis--vis de cet attachement et des tapes subsquentes du transfert de gne reste confirmer. Aprs avoir optimises les conditions de transfection des cellules de mammifres CHO et HEK293 dans le but de produire des r-protines secrtes, nous avons entrepris des cintiques de capture, dinternalisation des polyplexes et aussi dexpression du transgne afin de mieux comprendre le processus de transfert de gne. Nous avons pu observer des diffrences au niveau de ces paramtres de transfection dpendamment du systme dexpression et des caractristiques structurelles du PEI utilis. Ces rsultats prsents sous forme darticles scientifiques constituent une base solide de lenchanement dans le temps des vnements essentiels une transfection efficace des cellules CHO et HEK293 par le PEI. Chaque type cellulaire possde un profil dexpression des HSPG qui lui est propre, ces derniers tant plus ou moins permissifs au transfert de gne. En effet, une tude mene dans notre laboratoire montre que les SDC1 et SDC2 ont des rles opposs vis--vis du transfert de gne. Alors que tous deux sont capables de lier les polyplexes, lexpression de SDC1 permet leur internalisation contrairement lexpression de SDC2 qui linhibe. De plus, lorsque le SDC1 est exprim la surface des cellules HEK293, lefficacit de transfection est augmente de douze pourcents. En utilisant la capacit de SDC1 induire linternalisation des polyplexes, nous avons tudi le trafic intracellulaire des complexes SDC1 / polyplexes dans les cellules HEK293. De plus, nos observations suggrent une nouvelle voie par laquelle les polyplexes pourraient atteindre efficacement le noyau cellulaire. Dans le contexte du transfert de gne, les HSPG sont essentiellement tudis dans leur globalit. Sil est vrai que le rle des syndcanes dans ce contexte est le sujet de quelques tudes, celui des glypicanes est inexplor. Grce une srie de traitements chimiques et enzymatiques visant une approche perte de fonction , limportance de la sulfatation comme modification post-traductionnelle, leffet des chanes dhparanes sulfates mais aussi des glypicanes sur lattachement, linternalisation des polyplexes, et lexpression du transgne ont t tudis dans les cellules CHO et HEK293. Lensemble de nos observations indique clairement que le rle des HSPG dans le transfert de gne devrait tre investigu individuellement plutt que collectivement. En effet, le rle spcifique de chaque membre des HSPG sur la capture des polyplexes et leur permissivit lexpression gnique demeure encore inconnu. En exprimant de manire transitoire chaque membre des syndcanes et glypicanes la surface des cellules CHO, nous avons dtermin leur effet inhibiteur ou activateur sur la capture des polyplexes sans pouvoir conclure quant leffet de cette surexpression sur lefficacit de transfection. Par contre, lorsquils sont prsents dans le milieu de culture, le domaine extracellulaire des HSPG rduit lefficacit de transfection des cellules CHO sans induire la dissociation des polyplexes. Curieusement, lorsque chaque HSPG est exprim de manire stable dans les cellules CHO, seulement une lgre modulation de lexpression du transgne a pu tre observe. Ces travaux ont contribu la comprhension des mcanismes d'action du vecteur polycationique polythylnimine et prciser le rle des protoglycanes hparane sulfate dans le transfert de gne des cellules CHO et HEK293.
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Une caractristique intressante de la protine Bcl-xL est la prsence d'un domaine en boucle non-structure entre les hlices 1 and 2 de la protine. Ce domaine protique n'est pas essentiel pour sa fonction anti-apoptotique et absent chez CED-9, la protine orthologue chez Caenorhabditis elegans. A l'intrieur de ce domaine, Bcl-xL subit une phosphorylation et dphosphorylation dynamique sur les rsidus Ser49 et Ser62 en phase G2 du cycle cellulaire et lors de la mitose. Lorsque ces rsidus sont muts et les protines exprimes dans des cellules cancreuses, les cellules dmontrent plusieurs dfauts mitotiques lis l'instabilit chromosomique. Pour analyser les effets de Bcl-xL Ser49 et Ser62 dans les cellules normales, les prsentes tudes ont t ralises dans des cellules diplodes humaines normales, et in vivo chez Caenorhabditis elegans. Dans une premire tude, nous avons utilis la ligne cellulaire de cellules fibroblastiques diplodes humaines normales BJ, exprimant Bcl-xL (type sauvage), (S49A), (S49D), (S62A), (S62D) et les double (S49/62A) et (S49/62D) mutants. Les cellules exprimant les mutants de phosphorylation ont montr des cintiques de doublement de la population cellulaire rduites. Ces effets sur la cintique de doublement de la population cellulaire corrle avec l'apparition de la snescence cellulaire, sans impact sur les taux de mort cellulaire. Ces cellules snescentes affichent des phnotypes typiques de snescence associs notamment haut niveau de l'activit -galactosidase associe la snescence, la scrtion d' interleukine-6, l'activation de p53 et de p21WAF1/ Cip1, un inhibiteur des complexes kinase cycline-dpendant, ainsi que la formation de foyers de chromatine nuclaire associs H2A.X. Les analyses de fluorescence par hybridation in situ et des caryotypes par coloration au Giemsa ont rvl que l'expression des mutants de phosphorylation de Bcl-xL provoquent de l'instabilit chromosomique et l'aneuplodie. Ces rsultats suggrent que les cycles de phosphorylation et dphosphorylation dynamiques de Bcl-xL Ser49 et Ser62 sont importants dans le maintien de l'intgrit des chromosomes lors de la mitose dans les cellules normales. Dans une deuxime tude, nous avons entrepris des expriences chez Caenorhabditis elegans pour comprendre l'importance des rsidus Ser49 et Ser62 de Bcl-xL in vivo. Les vers transgniques portant les mutations de Bcl-xL (S49A, S62A, S49D, S62D et S49/62A) ont t gnrs et leurs effets ont t analyss sur les cellules germinales des jeunes vers adultes. Les vers portant les mutations de Bcl-xL ont montr une diminution de ponte et d'closion des oeufs, des variations de la longueur de leurs rgions mitotiques et des zones de transition, des anomalies chromosomiques leur stade de diplotne, et une augmentation de l'apoptose des cellules germinales. Certaines de ces souches transgniques, en particulier les variants Ser/Ala, ont galement montr des variations de dure de vie par rapport aux vers tmoins. Ces observations in vivo ont confirm l'importance de Ser49 et Ser62 l'intrieur du domaine boucle de Bcl-xL pour le maintien de la stabilit chromosomique. Ces tudes auront une incidence sur les futures stratgies visant dvelopper et identifier des composs qui pourraient cibler non seulement le domaine anti-apoptotique de la protine Bcl-xL, mais aussi son domaine mitotique pour la thrapie du cancer.
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La transplantation de sang de cordon ombilical (TSCO) constitue un traitement de choix pour une multitude de pathologies hmatologiques malignes et non malignes chez lenfant et dans certains cas ladulte. La TSCO est associe certaines complications, dont une reconstitution immunitaire plus lente et une incidence leve dinfections opportunistes, notamment celles relies au cytomgalovirus (CMV) et au virus varicella-zoster (VZV). Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes intresss dans un premier temps la caractrisation de la reconstitution immunitaire spcifique au CMV et au VZV. Nos rsultats ont dmontr que la reconstitution de limmunit cellulaire ne requiert ni un statut sropositif pr-transplantation ni le dveloppement de la maladie. De plus, des reconstitutions spontanes ont t dtectes chez certains patients srongatifs vis--vis du CMV ou du VZV. Outre le fait quelle se manifeste surtout partir de 6 mois post-transplantation, ladite reconstitution mrite le qualificatif de protectrice en termes de ractivations virales et du dveloppement de signes cliniques lorsquune frquence de 150 cellules produisant lIFN-/million est dpasse. Toutefois, moins de 5% des patients dveloppent une rponse T anti-VZV et anti-CMV au cours 100 premiers jours suivant la TSCO. Il est donc possible que les lymphocytes CD8+ T provenant du SCO, comparativement leurs homologues provenant de la moelle osseuse (MO), prsentent un dfaut de fonctionnalit, communment appel puisement clonal . La caractrisation du rpertoire de rcepteurs inhibiteurs exprims par les cellules T CD8+ suivant la TSCO ou la transplantation de moelle osseuse (TMO) a rvl une augmentation significative de la frquence des cellules exprimant PD-1 tt suivant la transplantation. Cette population, caractrise majoritairement par un phnotype effecteur-mmoire (EM), dmontre une perte significative de la capacit prolifrative et exprime moins d'IFN-, d'IL-2, de TNF- et de CD107a. Une meilleure caractrisation de la reconstitution immunitaire aprs TSCO permettrait, d'une part de slectionner des biomarqueurs en vue dune meilleure gestion des patients risques de dvelopper des infections virales et/ou de rechuter, et d'autre part d'amliorer leur pronostic.
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Notre quipe a identifi le th Labrador [Rhododendron groenlandicum L. (Ericaceae)] comme une plante potentiellement antidiabtique de la pharmacope traditionnelle des Cris de la Baie James orientale. Dans la prsente tude, nous avons valu les effets nphroprotecteurs potentiels de la plante. De la microalbuminurie et de la fibrose rnale ont t dveloppes chez des souris alimentes avec une dite grasse (DG). Le R. groenlandicum amliore dune faon non-significative la microalbuminurie, avec des valeurs de laire sous la courbe (ACR) diminuant de 0.69 0.53. La valeur de la fibrose rnale qui tait, lorigine, de 4.85 units arbitraires (UA) dans des souris alimentes la DG, a chut 3.27 UA aprs avoir reu un traitement de R. groenlandicum. Le R. groenlandicum a rduit la statose rnale de presque la moiti alors que lexpression du facteur de modification Bcl-2 (Bmf) a chut de 13.96 UA 9.43 UA. Dans leur ensemble les rsultats suggrent que le traitement avec R. groenlandicum peut amliorer la fonction rnale altre par DG. Dans ltude subsquente, notre quipe a identifi 17 espces de la fort borale, de la pharmacope traditionnelle des Cris de la Baie James orientale, qui ont prsent des activits biologiques prometteuses in vitro et in vivo dans le contexte du DT2. Nous avons maintenant examin ces 17 extraits afin didentifier lesquels possdent un potentiel cytoprotecteur rnale en utilisant des cellules Madin Darby Canine Kidney (MDCK) mises lpreuve dans un mdium hypertonique. Nous concluons que plusieurs plantes antidiabtiques Cris exercent une activit de protection rnale qui pourrait tre pertinente dans le contexte de la nphropathie diabtique (ND) qui affecte une proportion importante des Cris. La G. hispidula et la A. balsamea sont parmi les plantes les plus puissantes dans ce contexte et elles semblent protectrices principalement en inhibant la caspase 9 dans la voie de signalisation apoptotique mitochondriale. Finalement, nous avons utilis une approche de fractionnement guide par un test biologique pour identifier les fractions actives et les composs de A. balsamea avec un potentiel de protection rnale in vitro dans des cellules MDCK mises au dfi avec un mdium hypertonique. La fraction dhexane (Hex) possde le potentiel le plus lev parmi toutes les fractions de solvant contre les dommages cellulaires induits par le stress hypertonique. Dans des tudes prcdentes, trois composs purs ont t identifis partir de la fraction Hex, savoir, lacide abitique, lacide dhydroabitique et le squalne. Lacide abitique se distinguait par son effet puissant dans le maintien de la viabilit des cellules MDCK (AnnV-/PI-) un niveau relativement lev (augmentation de 25.48% relative au stress hypertonique, P<0.0001), ainsi quune rduction significative (diminution de 20.20% par rapport au stress hypertonique, P<0.0001) de lapoptose de stade prcoce (AnnV+/PI-). Lacide abitique peut donc servir normaliser les prparations traditionnelles dA. balsamea et trouver des applications potentielles dans le traitement de la nphropathie diabtique. Les trois tudes ont t intrinsquement lies les unes aux autres, par consquent, nous avons russi identifier R. groenlandicum ainsi que A. balsamea comme nouvelles plantes prometteuses contre la nphropathie diabtique. Nous croyons que ces rsultats profiteront la communaut crie pour la gestion des complications diabtiques, en particulier la nphropathie diabtique. En parallle, nos donnes pourraient faire avancer l'essai clinique de certaines plantes mdicinales de la pharmacope traditionnelle des Cris de la Baie James orientale du Canada.
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La reconnaissance dun antigne prsent par les cellules prsentatrices dantigne induit la prolifration et la diffrenciation des lymphocytes T nafs en lymphocytes T effecteurs et mmoires. Cette reconnaissance se fait par linteraction du rcepteur des cellules T (TCR) des lymphocytes T et le complexe CMH-peptide prsent la surface des DC. Cependant, des signaux additionnels sont requis, une meilleure activation des lymphocytes T implique des corcepteurs prsents la surface de ces deux types cellulaires. Aprs llimination de lantigne, la plupart des lymphocytes T effecteurs vont mourir. Une petite population de lymphocytes T va persister pour se diffrencier en lymphocytes T mmoires capables de protger lorganisme contre une rinfection. Les signaux qui contrlent le maintien des lymphocytes T mmoires sont encore mal compris. Pour comprendre le rle de la molcule de costimulation 4-1BB dans le maintien des lymphocytes T CD8 mmoires, nous avons mis lhypothse que ltat de phosphorylation de la protine adaptatrice TRAF1, qui se lie 4-1BB, module le maintien des lymphocytes T CD8 mmoires. Ainsi, nous avons montr par des expriences de spectromtrie de masse que TRAF1 sassocie prfrentiellement TBK1 lorsquelle nest pas phosphoryle. Nous avons aussi montr que la prsence de TRAF1 est requise pour stabiliser TBK1 au rcepteur 4-1BB aprs stimulation des lymphocytes T. Par ailleurs, les lymphocytes T CD8 OT-I TRAF1-/- reconstitues avec un mutant phospho-dficient de TRAF1 (S139A) et ensuite diffrencies en lymphocytes T mmoires in vitro induisent une activation de la voie de signalisation NF-B contrairement ceux exprimant la forme phospho-mimtique de TRAF1 (S139D). Ces premires tudes dmontrent limportance de ltat de phosphorylation de TRAF1 en aval de 4-1BB dans les cellules T. Dans la seconde partie, nous avons valu le rle dun autre corcepteur; la neuropiline 1, dans la maturation des DC. A cet effet, nous avons mis lhypothse que linteraction de la neuropiline 1 et ses ligands contribuerait la fonction des DC. Nous avons dmontr que labsence de la neuropiline 1 na pas deffet sur la maturation au LPS des DC. Cependant, la prsence du VEGF (un ligand de Nrp-1) inhibe la maturation des DC drives de la moelle osseuse. Notre tude a dmontr que VEGF inhibe lexpression des molcules de costimulation, la scrtion des cytokines pro inflammatoires et la signalisation TLR4 principalement les voies MAP Kinase et NF-B. Contrairement aux rsultats avec les cellules WT, VEGF nest pas capable daffecter la maturation, la scrtion des cytokines et la signalisation TLR4 des DC Nrp1-Lyz o la neuropiline 1 est dlte. Ainsi, nos rsultats ont dmontr que VEGF inhibe la maturation des DC de faon Nrp1-dpendante. Enfin, lanalyse des molcules partenaires de la neuropiline 1 montre que Nrp1, VEGF et TLR4 se retrouvent dans le mme complexe. Nos rsultats dmontrent que VEGF, en prsence de la neuropiline 1 est capable dinteragir avec TLR4 pour inhiber la maturation des DC. Toutefois, en absence de la neuropiline1, VEGF nest pas capable de recruter TLR4 pour rduire lexpression des molcules de costimulation. Ces tudes sur les corcepteurs pourraient tre importantes dans llaboration de nouvelles approches vaccinales.
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Lutilisation de methodes dinvestigation cerebrale avancees a permis de mettre en evidence la presence dalterations a court et a long terme a la suite dune commotion cerebrale. Plus specifiquement, des alterations affectant lintegrite de la matiere blanche et le metabolisme cellulaire ont recemment ete revelees par lutilisation de limagerie du tenseur de diffusion (DTI) et la spectroscopie par resonance magnetique (SRM), respectivement. Ces atteintes cerebrales ont ete observees chez des athletes masculins quelques jours apres la blessure a la tete et demeuraient detectables lorsque les athletes etaient a nouveau evalues six mois post-commotion. En revanche, aucune etude na evalue les effets neurometaboliques et microstructuraux dans la phase aigue et chronique dune commotion cerebrale chez les athletes feminines, malgre le fait quelles presentent une susceptibilite accrue de subir ce type de blessure, ainsi quun nombre plus eleve de symptomes post-commotionnels et un temps de rehabilitation plus long. Ainsi, les etudes composant le present ouvrage visent globalement a etablir le profil datteintes microstructurales et neurometaboliques chez des athletes feminines par lutilisation du DTI et de la SRM. La premiere etude visait a evaluer les changements neurometaboliques au sein du corps calleux chez des joueurs et joueuses de hockey au cours dune saison universitaire. Les athletes ayant subi une commotion cerebrale pendant la saison ont ete evalues 72 heures, 2 semaines et 2 mois apres la blessure a la tete en plus des evaluations pre et post-saison. Les resultats demontrent une absence de differences entre les athletes ayant subi une commotion cerebrale et les athletes qui nen ont pas subie. De plus, aucune difference entre les donnees pre et post-saison a ete observee chez les athletes masculins alors quune diminution du taux de N-acetyl aspartate (NAA) na ete mise en evidence chez les athletes feminines, suggerant ainsi un impact des coups dintensite sous-clinique a la tete. La deuxieme etude, qui utilisait le DTI et la SRM, a revele des atteintes chez des athletes feminines commotionnees asymptomatiques en moyenne 18 mois post-commotion. Plus specifiquement, la SRM a revele une diminution du taux de myo-inositol (mI) au sein de lhippocampe et du cortex moteur primaire (M1) alors que le DTI a mis en evidence une augmentation de la diffusivite moyenne (DM) dans plusieurs faisceaux de matiere blanche. De iii plus, une approche par region dinteret a mis en evidence une diminution de la fraction danisotropie (FA) dans la partie du corps calleux projetant vers laire motrice primaire. Le troisieme article evaluait des athletes ayant subi une commotion cerebrale dans les jours suivant la blessure a la tete (7-10 jours) ainsi que six mois post-commotion avec la SRM. Dans la phase aigue, des alterations neuropsychologiques combinees a un nombre significativement plus eleve de symptomes post-commotionnels et depressifs ont ete trouves chez les athletes feminines commotionnees, qui se resorbaient en phase chronique. En revanche, aucune difference sur le plan neurometabolique na ete mise en evidence entre les deux groupes dans la phase aigue. Dans la phase chronique, les athletes commotionnees demontraient des alterations neurometaboliques au sein du cortex prefrontal dorsolateral (CPDL) et M1, marquees par une augmentation du taux de glutamate/glutamine (Glx). De plus, une diminution du taux de NAA entre les deux temps de mesure etait presente chez les athletes controles. Finalement, le quatrieme article documentait les atteintes microstructurales au sein de la voie corticospinale et du corps calleux six mois suivant une commotion cerebrale. Les analyses nont demontre aucune difference au sein de la voie corticospinale alors que des differences ont ete relevees par segmentation du corps calleux selon les projections des fibres calleuses. En effet, les athletes commotionnees presentaient une diminution de la DM et de la diffusivite radiale (DR) au sein de la region projetant vers le cortex prefrontal, un volume moindre des fibres de matiere blanche dans la region projetant vers laire premotrice et laire motrice supplementaire, ainsi quune diminution de la diffusivite axiale (DA) dans la region projetant vers laire parietale et temporale. En somme, les etudes incluses dans le present ouvrage ont permis dapprofondir les connaissances sur les effets metaboliques et microstructuraux des commotions cerebrales et demontrent des effets deleteres persistants chez des athletes feminines. Ces donnees vont de pair avec la litterature scientifique qui suggere que les commotions cerebrales nentrainent pas seulement des symptomes temporaires.
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Les protines membranaires intgrales jouent un rle indispensable dans la survie des cellules et 20 30% des cadres de lectures ouverts codent pour cette classe de protines. La majorit des protines membranaires se trouvant sur la Protein Data Bank nont pas une orientation et une insertion connue. Lorientation, linsertion et la conformation que les protines membranaires ont lorsquelles interagissent avec une bicouche lipidique sont importantes pour la comprhension de leur fonction, mais ce sont des caractristiques difficiles obtenir par des mthodes exprimentales. Des mthodes computationnelles peuvent rduire le temps et le cot de lidentification des caractristiques des protines membranaires. Dans le cadre de ce projet de matrise, nous proposons une nouvelle mthode computationnelle qui prdit lorientation et linsertion dune protine dans une membrane. La mthode est base sur les potentiels de force moyenne de linsertion membranaire des chanes latrales des acides amins dans une membrane modle compose de dioloylphosphatidylcholine.
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Le compartiment microvasculaire est une cible importante du stress oxydant qui est un facteur majeur de la dysfonction endothliale, notamment au cours dexposition aux rayonnements ionisants. Laltration de lendothlium induite par le stress oxydant est implique dans la toxicit radio-induite des tissus sains. Limiter les dysfonctions endothliales est donc un enjeu important des traitements radiothrapeutiques actuels. Cet objectif ncessite une meilleure caractrisation de la signalisation du stress oxydant dans les cellules endothliales. La voie p38 MAPK est incontournable dans la rponse au stress oxydant mais reste encore insuffisamment caractrise. Par une approche protomique, nous avons identifi la nuclophosmine (NPM) comme nouveau partenaire de p38 dans le cytoplasme des cellules endothliales. La phosphatase PP2a est aussi associe ce complexe NPM/p38. Nos travaux montrent que le stress oxydant (H2O2, 500M) rgule la dphosphorylation de NPM via PP2a, entraine sa dissociation rapide du complexe et favorise sa translocation vers le noyau. De plus, nous montrons que la prsence de NPM dphosphoryle au noyau altre la rponse des cellules aux dommages lADN induits par le stress oxydant. Le cramide sphingolipide membranaire est galement un facteur important des voies de stress, particulirement dans les cellules endothliales. Notre tude aborde donc limplication de ce sphingolipide dans la rgulation de la voie NPM/p38. Une meilleure caractrisation de la voie p38 et de ses acteurs permettra didentifier de potentielles cibles afin de limiter les dysfonctions endothliales et leurs consquences dltres sur les tissus environnants.
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Les tissus pithliaux recouvrent les surfaces et les cavits du corps et fonctionnent comme des barrires slectives capables dchanges entre les diffrents compartiments de lorganisme. La fonctionnalit de ces tissus repose notamment sur la mise en place et le maintien dune asymtrie structurale des cellules pithliales, aussi appele polarit pithliale . La modulation des mcanismes orchestrant lasymtrie membranaire est centrale dans la formation et le maintien de larchitecture des tissus pithliaux. Ainsi, des dfauts de polarit pithliale provoquent des anomalies morphologiques et fonctionnelles des tissus pithliaux, qui peuvent contribuer au cancer chez lHomme. Cest pourquoi, la comprhension des processus lis la polarit pithliale constitue des objectifs cruciaux dans la biologie des pithliums et dans la sant humaine, pour assurer le dveloppement de nouvelles thrapies lies au rtablissement des fonctions soutenues par une asymtrie membranaire. Les mcanismes de polarit pithliale et leurs fonctions signaltiques dans la morphogense des tissus pithliaux jouent un rle central dans ma thse et font lobjet de mon introduction. Mon projet de doctorat a consist caractriser la fonction et la rgulation de Crumbs, un acteur cl dans la mise en place du domaine apical, dans le contrle de la morphologie cellulaire et dans la morphogense des tissus pithliaux. Cest pourquoi, ltude de la rgulation de la fonction de Crb au sein de la cellule pithliale revt un rle capital dans la comprhension de la biologie des pithliums. Dans ce cadre, nous avons dabord permis dapprofondir les modalits dune ventuelle fonction du domaine extracellulaire de CRB3A. De plus, nous montrons que la GTPase Rac1 permet de contrler Crumbs dans un contexte tridimensionnel. Ainsi, nous proposons un modle fonctionnel de Crumbs, soutenu par des approches in vitro et in vivo, dans le contrle de la morphologie cellulaire et la morphogense des tissus tridimensionnels.
