L’implication de SHP-1 en condition élevée de glucose inhibe la signalisation de l’insuline et du PDGF-BB dans les cellules musculaires lisses vasculaires hypoxiques

Résumé : Bien que l’hypoxie soit un puissant inducteur de l’angiogenèse, l’activation des facteurs de croissance est perturbée en hyperglycémie au niveau du pied et du cœur. Cette perturbation entraîne la perte de prolifération et de migration chez les cellules endothéliales, musculaires lisses vasculaires et péricytes empêchant la formation de nouveaux vaisseaux qui mènera à l’amputation des membres inférieurs chez les patients diabétiques. Une étude a démontré qu’une augmentation de la protéine tyrosine phosphatase Src homology-2 domain-containing phosphatase-1 (SHP-1) en condition hyperglycémique chez les péricytes entraînait l’inhibition de la signalisation du PDGF-BB, ce qui résultait en le développement d’une rétinopathie diabétique. Nous avons alors soulevé l’hypothèse que l’expression de SHP-1 dans les cellules musculaires lisses vasculaires affecte la prolifération et la migration cellulaire par l’inhibition de la signalisation de l’insuline et du PDGF-BB en condition diabétique. Nos expérimentations ont été effectuées principalement à l’aide d’une culture primaire de cellules musculaires lisses primaires provenant d’aortes bovines. Comparativement aux concentrations normales de glucose (NG : 5,6 mM), l’exposition à des concentrations élevées de glucose (HG : 25 mM) pendant 48 h a résulté en l’inhibition de la prolifération cellulaire par l’insuline et le PDGF-BB autant en normoxie (20% O2) qu’en hypoxie (24 dernières heures à 1% O2). Lors des essais de migration cellulaire, aucun effet de l’insuline n’a été observé alors que la migration par le PDGF-BB fut inhibée en HG autant en normoxie qu’en hypoxie. L’exposition en HG à mener à l’inhibition de la signalisation de la voie PI3K/Akt de l’insuline et du PDGF-BB en hypoxie. Aucune variation de l’expression de SHP-1 n’a été observée mais son activité phosphatase en hypoxie était fortement inhibée en NG contrairement en HG où on observait une augmentation de cette activité. Finalement, une association a été constatée entre SHP-1 et la sous-unité bêta du récepteur au PDGF. En conclusion, nous avons démontré que l’augmentation de l’activité phosphatase de SHP-1 en hypoxie cause l’inhibition des voies de l’insuline et du PDGF-BB réduisant les processus angiogéniques des cellules musculaires lisses vasculaires dans la maladie des artères périphériques.

Ibuprofen Inhibits Overexpression of Tumor-Related Rac1b through SRSF1

Abstract: The serrated pathway to colorectal tumor formation involves oncogenic mutations in the BRAF gene, which are sufficient for initiation of hyperplastic growth but not for tumor progression. A previous analysis of colorectal tumors revealed that overexpression of splice variant Rac1b occurs in around 80% of tumors with mutant BRAF and both events proved to cooperate in tumor cell survival. Patients with inflamed human colonic mucosa also have increased expression of Rac1b as well as mice with experimentally induced colitis. The increase of Rac1b in the mouse model was specifically prevented by the nonsteroidal anti-inflammatory drug ibuprofen. Purpose: The objective of our study is to understand the molecular regulation of Rac1b alternative splicing event and how it contributes to tumorigenesis. Experimental description: HT29 colorectal cell line was used as model to test several signaling pathways after 48h of treatment with ibuprofen. For this we analyzed the proteins of interest by Western Blot and the transcript levels by RT-PCR. Results: Mechanistic studies in cultured HT29 colorectal tumor cells revealed that ibuprofen inhibited Rac1b expression in a cyclooxygenase inhibition–independent manner and targets directly the alternative splicing event. Here, we provide evidence that ibuprofen leads to a decrease in expression of SRSF1, a splicing factor that we previously identified to promote Rac1b alternative splicing. Together, our results suggest that stromal cues, namely, inflammation, can trigger changes in Rac1b expression in the colon and identify ibuprofen as a highly specific and efficient inhibitor of Rac1b overexpression in colorectal tumors. Conclusions: Our data identify an additional cyclooxygenase–independent action of ibuprofen and suggest it may be beneficial in the treatment of patients with the subtype of BRAF-mutated serrated colorectal tumors.

Effets préventifs et thérapeutiques des polyphénols dans un modèle in vitro et in vivo de maladie inflammatoire de l’intestin : caractérisation des polyphénols de la pelure de pomme et de la canneberge par spectrométrie de masse

La muqueuse intestinale est exposée à des agents oxydants provenant de l’ingestion d’aliments modifiés, de cellules immuno-inflammatoires et de la flore intestinale. Une diète élevée en fruits et légumes peut diminuer le stress oxydant (SOx) ainsi que l’inflammation via plusieurs mécanismes. Ces effets bénéfiques peuvent être attribuables à leur contenu élevé en polyphénols. La première étude de mon doctorat consistait à tester l’hypothèse que les polyphénols extraits de pelures de pomme (DAPP) pouvaient diminuer le stress oxydant et l'inflammation impliqués dans les maladies inflammatoires de l'intestin (MII). Nous avons caractérisé les polyphénols des DAPP par spectrométrie de masse (LC-MS) et examiné leur potentiel antioxydant et anti-inflammatoire au niveau des cellules intestinales. L’identification des structures chimiques des polyphénols a été effectuée par LC-MS. Le SOx a été induit par l’ajout du complexe fer/ascorbate (Fe/Asc, 200 µM/2 mM) et l’inflammation par la lipopolysaccharide (LPS, 200µg/mL) à des cellules intestinales Caco-2/15 pré-incubées avec les DAPP (250 µg/mL). L’effet du SOx est déterminé par le dosage du malondialdéhyde (MDA), de la composition des acides gras polyinsaturés et de l’activité des enzymes antioxydantes endogènes (SOD et GPx). L’impact des DAPP sur l’inflammation a été testé par l’analyse de l’expression des marqueurs inflammatoires: cyclooxygénase-2 (COX-2), le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-a et l’interleukine-6 (IL-6) et les facteurs de transcription NF-KB, Nrf-2 et PGC1α par immunobuvardage. Nos données ont montré que les flavonols et les flavan-3-ols constituent les composés polyphénoliques majoritaires des DAPP. L’ajout de Fer2+/Asc a provoqué une augmentation de la peroxidation lipidique comparativement aux cellules contrôles, un appauvrissement des acides gras polyinsaturés n-3 et n-6, et une modulation des enzymes antioxydantes, se traduisant par une augmentation de l’activité de la SOD et une diminution de la GPx. En contrepartie, les DAPP ont exhibé leur potentiel à corriger la plupart des perturbations, y compris l’expression protéique anormalement élevée du COX-2 et la production de la prostaglandine E2 (PGE2), ainsi que l’inflammation telle que réflétée par les facteurs NF-κB, TNF-α et IL-6. Par ailleurs, les mécanismes sous-jacents à ces changements bénéfiques des DAPP ont fait intervenir les facteurs de transcription antioxydants (Nrf-2, PGC1α). Vraisemblablement, cette première étude a permis de démontrer la capacité des DAPP à amoindrir le SOx et à réduire l’inflammation, deux processus étroitement impliqués dans les MII. Dans la deuxième étape de mon doctorat, nous avons voulu comparer les résultats de DAPP à ceux des polyphénols dérivant de la canneberge qui est considérée par la communauté scientifique comme le fruit ayant le plus fort potentiel antioxydant. À cette fin, nous avons caractérisé l’effet des composés polyphénoliques de la canneberge (CPC) sur le SOx, la défense antioxydante et l’inflammation au niveau intestinal tout en définissant leur métabolisme intraluminal. Les différents CPC ont été séparés selon leur poids moléculaire par chromatographie et leurs structures chimiques ont été identifiées par LC-MS. Suite à une pré-incubation des cellules Caco-2/15 avec les extraits CPC (250 µg/mL), le Fe/Asc et la LPS ont été administrés comme inducteurs du SOx et de l’inflammation, respectivement. La caractérisation globale des CPC a révélé que les acides phénoliques composaient majoritairement l’extrait de canneberge de petit poids moléculaire (LC) alors que les flavonoïdes et les procyanidines dimériques/trimériques représentaient l’extrait de poids moléculaire moyen (MC) tout en laissant les procyanidines oligo et polymériques à l’extrait de haut poids moléculaire (HC). Les CPC ont permis de restaurer la plupart des perturbations engendrées dans les Caco-2/15 par le Fe/Asc et le LPS. Les CPC exhibaient le potentiel d’abaisser les niveaux de MDA, de corriger la composition des acides gras polyinsaturés n-3 et n-6, d’augmenter l’activité des enzymes antioxydantes (SOD, GPx et CAT) et d’élever l’expression de Nrf2 et PGC1α. En outre, les CPC pouvaient aussi réduire les niveaux élevés des protéines inflammatoires COX-2, TNF-α et IL-6 ainsi que la production des PGE2 par un mécanisme impliquant le NF-κB. Au niveau mitochondrial, les procyanidines oligomériques ont réussi à corriger les dysfonctions reliées à la production d’énergie (ATP), l’apoptose (Bcl-2, Cyt C et AIF) et le statut des facteurs de transcription mitochondriaux (mtTFA, mtTFB1, mtTFB2). Dans le but de bien comprendre les mécanismes d’action des CPC, nous avons défini par LC-MS les composés polyphénoliques qui ont été transportés ou absorbés par l’entérocyte. Nos analyses soulignent le transport (i) des acides cinnamiques et benzoïques (LC); (ii) la quercétine glycosylée et conjuguée et les procyanidines dimériques de type A (MC); et (iii) l’épicatéchine et les procyanidines oligomériques (HC). Les processus de métabolisation (méthylation, glucuronidation et sulfatation) au niveau de l’entérocyte ont probablement permis le transport de ces CPC surtout sous leur forme conjuguée. Les procyanidines oligomériques ayant un degré de polymérisation supérieur à 2 (HC) ont semblé adhérer aux cellules Caco-2/15. L’épicatéchine suivi par les procyanidines dimériques de type A ont été trouvés majoritaires au niveau des mitochondries. Même si nous ignorons encore l’action biologique de chaque composé polyphénolique, nous pouvons suggérer que leurs effets combinatoires exercent des fonctions antioxydantes, anti-inflammatoires et mitochondriales dans le modèle intestinal Caco-2/15. Dans une troisième étape, nous avons procédé à l’évaluation des aspects préventifs et thérapeutique des DAPP tout en sondant les mécanismes sous-jacents dans une étude préclinique. À cette fin, nous avons exploité le modèle de souris avec colite expérimentale provoquée par le Dextran Sulfate de Sodium (DSS). L’induction de l’inflammation intestinale chez la souris C57BL6 a été effectuée par l’administration orale de DSS à 2.5% pendant 10 jours. Des doses physiologiques et supra-physiologiques de DAPP (200 et 400 mg/kg/j, respectivement) ont été administrées par gavage pendant 10 jours pré- et post-DSS. L’inflammation par le DSS a provoqué une perte de poids, un raccourcissement du côlon, le décollement dystrophique de l’épithélium, l’exulcération et les infiltrations de cellules mono et polynucléaires au niveau du côlon. De plus, le DSS a induit une augmentation de la peroxidation lipidique, une régulation à la baisse des enzymes antioxydantes, une expression protéique à la hausse de la myéloperoxidase (MPO), du COX-2 et de la production des PGE2. Par ailleurs, les DAPP ont permis de corriger ou du moins d’alléger la plupart de ces anomalies en situation préventive ou thérapeutique, en plus d’abaisser l’expression protéique de NF-κB et des cytokines inflammatoires (TNF-a et l’IL-6) tout en stimulant les facteurs de transcription antioxydants (Nrf-2, PGC1α). Conséquemment, les polyphénols des DAPP ont exhibé leur puissant pouvoir antioxydant et anti-inflammatoire au niveau intestinal dans un modèle in vivo. Leurs actions sont associées à la régulation des voies de signalisation cellulaire et des changements dans la composition du microbiote. Ces trois projets de recherche permettent d’envisager l’évaluation des effets préventifs et thérapeutiques des DAPP cliniquement chez les patients avec des désordres inflammatoires de l’intestin.

Rôles de deux corécepteurs impliqués dans le maintien des cellules T mémoires CD8+ et la maturation des cellules dendritiques

La reconnaissance d’un antigène présenté par les cellules présentatrices d’antigène induit la prolifération et la différenciation des lymphocytes T naïfs en lymphocytes T effecteurs et mémoires. Cette reconnaissance se fait par l’interaction du récepteur des cellules T (TCR) des lymphocytes T et le complexe CMH-peptide présent à la surface des DC. Cependant, des signaux additionnels sont requis, une meilleure activation des lymphocytes T implique des corécepteurs présents à la surface de ces deux types cellulaires. Après l’élimination de l’antigène, la plupart des lymphocytes T effecteurs vont mourir. Une petite population de lymphocytes T va persister pour se différencier en lymphocytes T mémoires capables de protéger l’organisme contre une réinfection. Les signaux qui contrôlent le maintien des lymphocytes T mémoires sont encore mal compris. Pour comprendre le rôle de la molécule de costimulation 4-1BB dans le maintien des lymphocytes T CD8 mémoires, nous avons émis l’hypothèse que l’état de phosphorylation de la protéine adaptatrice TRAF1, qui se lie à 4-1BB, module le maintien des lymphocytes T CD8 mémoires. Ainsi, nous avons montré par des expériences de spectrométrie de masse que TRAF1 s’associe préférentiellement à TBK1 lorsqu’elle n’est pas phosphorylée. Nous avons aussi montré que la présence de TRAF1 est requise pour stabiliser TBK1 au récepteur 4-1BB après stimulation des lymphocytes T. Par ailleurs, les lymphocytes T CD8 OT-I TRAF1-/- reconstituées avec un mutant phospho-déficient de TRAF1 (S139A) et ensuite différenciées en lymphocytes T mémoires in vitro induisent une activation de la voie de signalisation NF-ĸB contrairement à ceux exprimant la forme phospho-mimétique de TRAF1 (S139D). Ces premières études démontrent l’importance de l’état de phosphorylation de TRAF1 en aval de 4-1BB dans les cellules T. Dans la seconde partie, nous avons évalué le rôle d’un autre corécepteur; la neuropiline 1, dans la maturation des DC. A cet effet, nous avons émis l’hypothèse que l’interaction de la neuropiline 1 et ses ligands contribuerait à la fonction des DC. Nous avons démontré que l’absence de la neuropiline 1 n’a pas d’effet sur la maturation au LPS des DC. Cependant, la présence du VEGF (un ligand de Nrp-1) inhibe la maturation des DC dérivées de la moelle osseuse. Notre étude a démontré que VEGF inhibe l’expression des molécules de costimulation, la sécrétion des cytokines pro inflammatoires et la signalisation TLR4 principalement les voies MAP Kinase et NF-ĸB. Contrairement aux résultats avec les cellules WT, VEGF n’est pas capable d’affecter la maturation, la sécrétion des cytokines et la signalisation TLR4 des DC Nrp1-Lyz où la neuropiline 1 est délétée. Ainsi, nos résultats ont démontré que VEGF inhibe la maturation des DC de façon Nrp1-dépendante. Enfin, l’analyse des molécules partenaires de la neuropiline 1 montre que Nrp1, VEGF et TLR4 se retrouvent dans le même complexe. Nos résultats démontrent que VEGF, en présence de la neuropiline 1 est capable d’interagir avec TLR4 pour inhiber la maturation des DC. Toutefois, en absence de la neuropiline1, VEGF n’est pas capable de recruter TLR4 pour réduire l’expression des molécules de costimulation. Ces études sur les corécepteurs pourraient être importantes dans l’élaboration de nouvelles approches vaccinales.

Studying the role of the strawberry Fra protein family in the flavonoid metabolism during fruit ripening

Strawberry fruits are highly appreciated worldwide due to their pleasant flavor and aroma and to the health benefits associated to their consumption. An important part of these properties is due to their content in secondary metabolites, especially phenolic compounds, of which flavonoids are the most abundant in the strawberry fruit. Although the flavonoid biosynthesis pathway is uncovered, little is known about its regulation. The strawberry Fra a (Fra) genes constitute a large family of homologs of the major birch pollen allergen Bet v 1 and for which no equivalents exist in Arabidopsis. Our group has shown that Fra proteins are involved in the formation of colored compounds in strawberries (Muñoz et al., 2010), which mainly depends on the production of certain flavonoids; that they are structurally homologs to the PYR/PYL/RCAR Arabidopsis ABA receptor, and that they are able to bind flavonoids (Casañal et al., 2013). With these previous results, our working hypothesis is that the Fra proteins are involved in the regulation of the flavonoids pathway. They would mechanistically act as the ABA receptor, binding a protein interactor and a ligand to regulate a signaling cascade and/or act as molecular carriers. The main objective of this research is to characterize the Fra family in strawberry and gain insight into their role in the flavonoid metabolism. By RNAseq expression analysis in ripening fruits we have identified transcripts for 10 members of the Fra family. Although expressed in all tissues analyzed, each family member presents a unique pattern of expression, which suggests functional specialization for each Fra protein. Then, our next approach was to identify the proteins that interact with Fras and their ligands to gain knowledge on the role that these proteins play in the flavonoids pathway. To identify the interacting partners of Fras we have performed a yeast two hybrid (Y2H) screening against cDNA libraries of strawberry fruits at the green and red stages. A protein that shares a 95% homology to the Heat stress transcription factor A-4-C like of Fragaria vesca (HSA4C) interacts specifically with Fra1 and not with other family members, which suggests functional diversification of Fra proteins in specific signaling pathways. The Y2H screening is not yet saturated, so characterization of other interacting proteins with other members of the Fra family will shed light on the functional diversity within this gene family. This research will contribute to gain knowledge on how the flavonoid pathway, and hence, the fruit ripening, is regulated in strawberry; an economically important crop but for which basic research is still very limited. References: Muñoz, C, et al. (2010). The Strawberry Fruit Fra a Allergen Functions in Flavonoid Biosynthesis. Molecular Plant, 3(1): 113–124. Casañal, A, et al (2013). The Strawberry Pathogenesis-related 10 (PR-10) Fra a Proteins Control Flavonoid Biosynthesis by Binding Metabolic Intermediates. Journal of Biological Chemistry, 288(49): 35322–35332.

Microfluidics-based single-cell functional proteomics microchip for portraying protein signal transduction networks within the framework of physicochemical principles, with applications in fundamental and translational cancer research

Single-cell functional proteomics assays can connect genomic information to biological function through quantitative and multiplex protein measurements. Tools for single-cell proteomics have developed rapidly over the past 5 years and are providing unique opportunities. This thesis describes an emerging microfluidics-based toolkit for single cell functional proteomics, focusing on the development of the single cell barcode chips (SCBCs) with applications in fundamental and translational cancer research.

The microchip designed to simultaneously quantify a panel of secreted, cytoplasmic and membrane proteins from single cells will be discussed at the beginning, which is the prototype for subsequent proteomic microchips with more sophisticated design in preclinical cancer research or clinical applications. The SCBCs are a highly versatile and information rich tool for single-cell functional proteomics. They are based upon isolating individual cells, or defined number of cells, within microchambers, each of which is equipped with a large antibody microarray (the barcode), with between a few hundred to ten thousand microchambers included within a single microchip. Functional proteomics assays at single-cell resolution yield unique pieces of information that significantly shape the way of thinking on cancer research. An in-depth discussion about analysis and interpretation of the unique information such as functional protein fluctuations and protein-protein correlative interactions will follow.

The SCBC is a powerful tool to resolve the functional heterogeneity of cancer cells. It has the capacity to extract a comprehensive picture of the signal transduction network from single tumor cells and thus provides insight into the effect of targeted therapies on protein signaling networks. We will demonstrate this point through applying the SCBCs to investigate three isogenic cell lines of glioblastoma multiforme (GBM).

The cancer cell population is highly heterogeneous with high-amplitude fluctuation at the single cell level, which in turn grants the robustness of the entire population. The concept that a stable population existing in the presence of random fluctuations is reminiscent of many physical systems that are successfully understood using statistical physics. Thus, tools derived from that field can probably be applied to using fluctuations to determine the nature of signaling networks. In the second part of the thesis, we will focus on such a case to use thermodynamics-motivated principles to understand cancer cell hypoxia, where single cell proteomics assays coupled with a quantitative version of Le Chatelier's principle derived from statistical mechanics yield detailed and surprising predictions, which were found to be correct in both cell line and primary tumor model.

The third part of the thesis demonstrates the application of this technology in the preclinical cancer research to study the GBM cancer cell resistance to molecular targeted therapy. Physical approaches to anticipate therapy resistance and to identify effective therapy combinations will be discussed in detail. Our approach is based upon elucidating the signaling coordination within the phosphoprotein signaling pathways that are hyperactivated in human GBMs, and interrogating how that coordination responds to the perturbation of targeted inhibitor. Strongly coupled protein-protein interactions constitute most signaling cascades. A physical analogy of such a system is the strongly coupled atom-atom interactions in a crystal lattice. Similar to decomposing the atomic interactions into a series of independent normal vibrational modes, a simplified picture of signaling network coordination can also be achieved by diagonalizing protein-protein correlation or covariance matrices to decompose the pairwise correlative interactions into a set of distinct linear combinations of signaling proteins (i.e. independent signaling modes). By doing so, two independent signaling modes – one associated with mTOR signaling and a second associated with ERK/Src signaling have been resolved, which in turn allow us to anticipate resistance, and to design combination therapies that are effective, as well as identify those therapies and therapy combinations that will be ineffective. We validated our predictions in mouse tumor models and all predictions were borne out.

In the last part, some preliminary results about the clinical translation of single-cell proteomics chips will be presented. The successful demonstration of our work on human-derived xenografts provides the rationale to extend our current work into the clinic. It will enable us to interrogate GBM tumor samples in a way that could potentially yield a straightforward, rapid interpretation so that we can give therapeutic guidance to the attending physicians within a clinical relevant time scale. The technical challenges of the clinical translation will be presented and our solutions to address the challenges will be discussed as well. A clinical case study will then follow, where some preliminary data collected from a pediatric GBM patient bearing an EGFR amplified tumor will be presented to demonstrate the general protocol and the workflow of the proposed clinical studies.

Aplicações biotecnológicas do supressor de silenciamento de cucumber mosaic virus

Tese de Doutoramento, Ciências Agrárias, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2015

Molecular analysis of exons 8, 9 and 10 of the fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) gene in two families with index cases of Apert Syndrome

Introduction: Apert syndrome (AS) is a craniosynostosis condition caused by mutations in the Fibroblast Growth Factor Receptor 2 (FGFR2) gene. Clinical features include cutaneous and osseous symmetric syndactily in hands and feet, with variable presentations in bones, brain, skin and other internal organs. Methods: Members of two families with an index case of Apert Syndrome were assessed to describe relevant clinical features and molecular analysis (sequencing and amplification) of exons 8, 9 and 10 of FGFR2 gen. Results: Family 1 consists of the mother, the index case and half -brother who has a cleft lip and palate. In this family we found a single FGFR2 mutation, S252W, in the sequence of exon 8. Although mutations were not found in the study of the patient affected with cleft lip and palate, it is known that these diseases share signaling pathways, allowing suspected alterations in shared genes. In the patient of family 2, we found a sequence variant T78.501A located near the splicing site, which could interfere in this process, and consequently with the protein function.

Exercise, skeletal muscle and circulating microRNAs

Regular exercise stimulates numerous structural, metabolic, and morphological adaptations in skeletal muscle. These adaptations are vital to maintain human health over the life span. Exercise is therefore seen as a primary intervention to reduce the risk of chronic disease. Advances in molecular biology, biochemistry, and bioinformatics, combined with exercise physiology, have identified many key signaling pathways as well as transcriptional and translational processes responsible for exercise-induced adaptations. Noncoding RNAs, and specifically microRNAs (miRNAs), constitute a new regulatory component that may play a role in these adaptations. The short single-stranded miRNA sequences bind to the 3' untranslated region of specific messenger RNAs (mRNAs) on the basis of sequence homology. This results in the degradation of the target mRNA or the inhibition of protein translation causing repression of the corresponding protein. While tissue specificity or enrichment of certain miRNAs makes them ideal targets to manipulate and understand tissue development, function, health, and disease, other miRNAs are ubiquitously expressed; however, it is uncertain whether their mRNA/protein targets are conserved across different tissues. miRNAs are stable in plasma and serum and their altered circulating expression levels in disease conditions may provide important biomarker information. The emerging research into the role that miRNAs play in exercise-induced adaptations has predominantly focused on the miRNA species that are regulated in skeletal muscle or in circulation. This chapter provides an overview of these current research findings, highlights the strengths and weaknesses identified to date, and suggests where the exercise-miRNA field may move into the future.

Rôle de la signalisation Wnt non-canonique dans l’étiologie de l’ostéoarthrose chez l’humain

Les études cliniques et in vitro suggèrent que la sclérose de l’os sous-chondral due aux ostéoblastes (Ob) anormaux est impliquée dans la progression de l’ostéoarthrose (OA). Les Ob OA humains isolés à partir d’os sous-chondral sclérosé montrent un phénotype altéré, un niveau réduit de signalisation Wnt/β-caténine canonique et une minéralisation in vitro réduite. Il existe également deux voies non-canoniques, Wnt/PKC et Wnt/PCP qui ont étés décrites dans la littérature. Cependant, il n’existe aucune étude qui traite de ces deux voies dans les Ob OA. Ces voies sont activées après qu’un ligand Wnt non-canonique tel que Wnt-5a se lie à un récepteur Wnt couplé à des corécepteurs de la voie non-canonique. Ceci enclenche, respectivement pour la voie Wnt/PKC-Ca2+ et Wnt/PCP, la phosphorylation de PKC (p-PKC) et la phosphorylation de JNK (p-JNK) et agit sur les cibles en aval. Nous avons voulu déterminer s’il était possible de constater des altérations dans les voies Wnt non-canoniques dans les Ob OA. Nous avons préparé des cultures primaires d’ostéoblastes sous-chondral humains à partir de plateaux tibiaux de patients OA subissant une arthroplastie totale du genou, ainsi qu’à partir de plateaux tibiaux recueillis à l’autopsie de patients « normaux ». L’expression des gènes impliqués dans les voies Wnt/PKC et Wnt/PCP a été évaluée par RT-qPCR et la production par Western Blot des protéines, ainsi que celle de p-PKC et p-JNK et que l’activité des facteurs NFAT et AP-1 utilisés par ces deux voies. L’activité phosphatase alcaline (ALPase) et la quantité d’ostéocalcine (OC) ont étés évaluées respectivement à l’aide d’hydrolyse de substrat et d’ELISA. Le niveau de minéralisation a été évalué par la coloration au rouge Alizarine. Nos résultats montrent que l’expression et la production de Wnt-5a étaient augmentées dans les Ob OA comparées aux Ob N et LGR5 était significativement plus élevée. De plus, l’expression de LGR5 est directement régulée via la stimulation ou la diminution de Wnt-5a, à la fois au niveau de l’ARNm et des protéines. Par ailleurs, Wnt-5a a stimulé la phosphorylation de JNK et de PKC ainsi que l’activité NFAT et AP-1. Les niveaux de minéralisation ainsi que d’activité ALPase et de sécrétion d’OC ont aussi été affectés par les changements du niveau de Wnt-5a. Ces résultats suggèrent que Wnt-5a, qui est augmentée dans les OA Ob, peut stimuler les voies Wnt non-canoniques et affecter le phénotype et la minéralisation des OA Ob humains.

Étude des voies de signalisation activées par la prostaglandine F2α dans les cellules de cancer colorectal

Le cancer colorectal représente la troisième forme de cancer la plus fréquente au Canada. Malgré les récents développements, aucun traitement curatif n’est disponible pour les patients diagnostiqués à un stade avancé de la maladie. Plusieurs évidences supportent un rôle important des prostaglandines dans cette maladie. En effet, une surexpression des récepteurs de type EP et FP est remarquée. Ces derniers ainsi que les molécules de signalisations intracellulaires qu’ils activent représentent donc de nouvelles cibles pour traiter ce cancer. Nous et d’autres groupes avons démontré que les protéines G monomériques sont des petits interrupteurs moléculaires importants dans la signalisation intracellulaire engagée par les récepteurs dans des cellules saines mais qu’un dérèglement de celles-ci est associé au cancer. L’objectif principal de ce projet de recherche vise donc à identifier les voies de signalisations par lesquelles le récepteur FP contribue aux capacités invasives des cellules tumorales d’origine colorectale. Notre hypothèse est que la protéine ARF6, une des 6 isoformes des ARFs, et la protéine RhoA, agissent pour coordonner l’activation des voies de signalisations associées à la migration et l’invasion cellulaire. Nos résultats ont indiqué que la stimulation des cellules HEK293 exprimant de façon stable le récepteur FP (HA-FP) ainsi que les cellules SW480, une lignée invasive de cancer colorectal, par le PGF2α augmentait les niveaux d’activation d’ARF6 mais également de la protéine RhoA. De plus, d’autres médiateurs et intermédiaires associés à la réorganisation du cytosquelette comme la cofiline et la chaine légère de la myosine (MLC) ont été hautement phosphorylés suite à la stimulation par la prostaglandine. Ces observations sont associées avec une augmentation des fibres de stress dans les cellules. Nous avons tenté de déterminer si l’inhibition de ces protéines G affectait la capacité du PGF2α à activer ces intermédiaires de signalisation ainsi que certains effets biologiques. Ainsi, nos expériences contribueront à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement du cancer colorectal.

Selective and Specific Activation of Rab5 during Endocytosis of Receptor Tyrosine Kinases

The Rab family of proteins are low molecular weight GTPases that have the ability to switch between GTP- (active) and GDP- (inactive) bound form, and in that sense act as molecular switches. Through distinct localization on various vesicles and organelles and by cycling through GTP/GDP bound forms, Rabs are able to recruit and activate numerous effector proteins, both spatially and temporally, and hence behave as key regulators of trafficking in both endocytic and biosynhtetic pathways. The Rab5 protein has been shown to regulate transport from plasma membrane to the early endosome as well as activate signaling pathways from the early endosome. This dissertation focused on understanding Rab5 activation via endocytosis of receptor tyrosine kinases (RTKs). First, tyrosine kinase activity of RTKs was linked to endosome fusion by demonstrating that tyrosine kinase inhibitors block endosome fusion and activation of Rab5, and a constitutively active form of Rab5 is able to rescue endosome fusion. However, depending on how much ligand is available at the cell surface, the receptor-ligand complexes can be internalized via a number of distinct pathways. Similarly, Rab5 was activated in a ligand-dependent concentration dependent manner via clathrin- and caveolin-mediated pathways, as well as a pathway independent of both. However, overexpression Rabex-5, a nucleotide exchange factor for Rab5, is able to rescue activation even when all of the pathways of EGF-receptor internalization were blocked. Next, the three naturally occurring splice variants of Rabex-5 selectively activated Rab5. Lastly, Rabex-5 inhibits differentiation of 3T3-L1 and PC12 cells through 1) degradation of signaling endosome via Rab5-dependent fusion with the early endosome, 2) and inhibition of signaling cascade via ubiquitination of Ras through the ZnF domain at the N-terminus of Rabex-5. In conclusion, these data shed light on complexity of the endosomal trafficking system where tyrosine kinase activity of the receptor is able to affect endosome fusion; how different endocytic pathways affect activation of one of the key regulators of early endocytic events; and how selective activation of Rab5 via Rabex-5 can control adipogenesis and neurogenesis.

Rôle de la signalisation Wnt non-canonique dans l’étiologie de l’ostéoarthrose chez l’humain

Les études cliniques et in vitro suggèrent que la sclérose de l’os sous-chondral due aux ostéoblastes (Ob) anormaux est impliquée dans la progression de l’ostéoarthrose (OA). Les Ob OA humains isolés à partir d’os sous-chondral sclérosé montrent un phénotype altéré, un niveau réduit de signalisation Wnt/β-caténine canonique et une minéralisation in vitro réduite. Il existe également deux voies non-canoniques, Wnt/PKC et Wnt/PCP qui ont étés décrites dans la littérature. Cependant, il n’existe aucune étude qui traite de ces deux voies dans les Ob OA. Ces voies sont activées après qu’un ligand Wnt non-canonique tel que Wnt-5a se lie à un récepteur Wnt couplé à des corécepteurs de la voie non-canonique. Ceci enclenche, respectivement pour la voie Wnt/PKC-Ca2+ et Wnt/PCP, la phosphorylation de PKC (p-PKC) et la phosphorylation de JNK (p-JNK) et agit sur les cibles en aval. Nous avons voulu déterminer s’il était possible de constater des altérations dans les voies Wnt non-canoniques dans les Ob OA. Nous avons préparé des cultures primaires d’ostéoblastes sous-chondral humains à partir de plateaux tibiaux de patients OA subissant une arthroplastie totale du genou, ainsi qu’à partir de plateaux tibiaux recueillis à l’autopsie de patients « normaux ». L’expression des gènes impliqués dans les voies Wnt/PKC et Wnt/PCP a été évaluée par RT-qPCR et la production par Western Blot des protéines, ainsi que celle de p-PKC et p-JNK et que l’activité des facteurs NFAT et AP-1 utilisés par ces deux voies. L’activité phosphatase alcaline (ALPase) et la quantité d’ostéocalcine (OC) ont étés évaluées respectivement à l’aide d’hydrolyse de substrat et d’ELISA. Le niveau de minéralisation a été évalué par la coloration au rouge Alizarine. Nos résultats montrent que l’expression et la production de Wnt-5a étaient augmentées dans les Ob OA comparées aux Ob N et LGR5 était significativement plus élevée. De plus, l’expression de LGR5 est directement régulée via la stimulation ou la diminution de Wnt-5a, à la fois au niveau de l’ARNm et des protéines. Par ailleurs, Wnt-5a a stimulé la phosphorylation de JNK et de PKC ainsi que l’activité NFAT et AP-1. Les niveaux de minéralisation ainsi que d’activité ALPase et de sécrétion d’OC ont aussi été affectés par les changements du niveau de Wnt-5a. Ces résultats suggèrent que Wnt-5a, qui est augmentée dans les OA Ob, peut stimuler les voies Wnt non-canoniques et affecter le phénotype et la minéralisation des OA Ob humains.

Étude des voies de signalisation activées par la prostaglandine F2α dans les cellules de cancer colorectal

Le cancer colorectal représente la troisième forme de cancer la plus fréquente au Canada. Malgré les récents développements, aucun traitement curatif n’est disponible pour les patients diagnostiqués à un stade avancé de la maladie. Plusieurs évidences supportent un rôle important des prostaglandines dans cette maladie. En effet, une surexpression des récepteurs de type EP et FP est remarquée. Ces derniers ainsi que les molécules de signalisations intracellulaires qu’ils activent représentent donc de nouvelles cibles pour traiter ce cancer. Nous et d’autres groupes avons démontré que les protéines G monomériques sont des petits interrupteurs moléculaires importants dans la signalisation intracellulaire engagée par les récepteurs dans des cellules saines mais qu’un dérèglement de celles-ci est associé au cancer. L’objectif principal de ce projet de recherche vise donc à identifier les voies de signalisations par lesquelles le récepteur FP contribue aux capacités invasives des cellules tumorales d’origine colorectale. Notre hypothèse est que la protéine ARF6, une des 6 isoformes des ARFs, et la protéine RhoA, agissent pour coordonner l’activation des voies de signalisations associées à la migration et l’invasion cellulaire. Nos résultats ont indiqué que la stimulation des cellules HEK293 exprimant de façon stable le récepteur FP (HA-FP) ainsi que les cellules SW480, une lignée invasive de cancer colorectal, par le PGF2α augmentait les niveaux d’activation d’ARF6 mais également de la protéine RhoA. De plus, d’autres médiateurs et intermédiaires associés à la réorganisation du cytosquelette comme la cofiline et la chaine légère de la myosine (MLC) ont été hautement phosphorylés suite à la stimulation par la prostaglandine. Ces observations sont associées avec une augmentation des fibres de stress dans les cellules. Nous avons tenté de déterminer si l’inhibition de ces protéines G affectait la capacité du PGF2α à activer ces intermédiaires de signalisation ainsi que certains effets biologiques. Ainsi, nos expériences contribueront à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement du cancer colorectal.

Polymorphism of the p38 beta gene in patients with colorectal cancer

The p38 mitogen‑activated protein kinase (MAPK) signaling pathways have been proposed to participate in the pathological process of cancer by affecting inflammation, proliferation, metastasis and cell survival. A single nucleotide polymorphism (SNP; rs2235356, ‑1628A→G) in the promoter region of the p38β gene has been proposed as a genetic modifier for colorectal cancer (CRC) in a Chinese population. The present study evaluated the susceptibility of patients possessing this SNP to CRC, in addition to determining its association with clinical parameters in Swedish patients with CRC. Using the LightSNiP genotyping assay, this SNP was screened in 389 patients with CRC and 517 control subjects. No significant difference in the genotype distribution or in the allelic frequencies was identified between the two groups nor was any association identified with the clinical parameters. These findings indicate that the ‑1628A→G polymorphism of the p38β gene is not significantly associated with a susceptibility to CRC in a Swedish population.