958 resultados para Fibroblasts
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Zusammenfassung Diese Arbeit beschreibt Untersuchungen über die zellulären Mechanismen, die zur Bildung dieser DNA-Schäden führen, sowie über die biologischen Auswirkungen dieser Schäden. Die Untersuchungen zu Uracil in der DNA wurden in ung-knockout-MEFs und Mäusen durchgeführt, die es erlauben, die Konsequenzen eines Ausfalls der wichtigsten Reparaturglykosylase für Uracil zu beleuchten. Die Ergebnisse zeigen eine deutliche Akkumulation von Uracil in den ung-/--Mausfibroblasten im Vergleich zum Wildtyp. In frisch isolierten Leber- und Milzzellen der Mäuse konnte dieser genotypspezifische Unterschied, wenn auch weniger ausgeprägt, ebenso beobachtet werden, nicht jedoch in reifen Spermien. Dieser gewebespezifische Unterschied und die quantitativ stärker ausgeprägte Akkumulation in ung-/--Mausfibroblasten im Vergleich zu den Mäusegeweben gab Anlass zur Vermutung, dass die Proliferation der Zellen für den Haupteintrag an Uracil in die DNA verantwortlich ist. Erstmals konnte in Versuche mit konfluenten (nicht mehr proliferierenden) ung-/--Mausfibroblasten gezeigt werden, dass nicht die spontane hydrolytische Desaminierung von Cytosin, sondern der Fehleinbau von dUMP während der DNA-Replikation die Hauptquelle für Uracil in der DNA von Säugerzellen darstellt. Da der Uracilmetabolismus ein wichtiges Target in der Chemotherapie ist, lag es nahe, das zur Verfügung stehende ung-knockout-Modell der MEFs zur Untersuchung mit Fluorpyrimidinen, die als Zytostatika verwendet werden, einzusetzen. Da bisher die Ursachen der beobachteten Apoptose der Tumorzellen und aller anderen metabolisch hochaktiven Zellen eines behandelten Organismus noch nicht vollständig verstanden ist, wurden diese Zellen mit verschiedenen Fluorpyrimidinen behandelt, die als Thymidylatsynthasehemmer die de novo Synthese von Thymidin unterbinden. Es konnte gezeigt werden, dass ung-/- Mausfibroblasten, im Gegensatz zu ung+/+ Mausfibroblasten, verstärkt Uracil in der DNA akkumulieren. Obwohl die ung+/+ Mausfibroblasten keine erhöhten Uracil-Spiegel in der DNA aufwiesen, zeigten sie bei Inkubation mit einem der beiden Thymidylatsynthasehemmern, 5-Fluoruracil (5-FU), die gleiche Sensitivität in einem nachfolgenden Proliferationsversuch wie die ung-/- Mausfibroblasten. Dies lässt darauf schließen, dass weder Reparatur noch Einbau von Uracil in die DNA für die beobachtete Toxizität dieser Zytostatika notwendig sind. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung des DNA-schädigenden Potenzials endogener ROS, die aus dem Fremdstoffmetabolismus stammen. Dazu wurden V79-Zellen verwendet, die mit dem humanen Enzym Cytochrom 2E1 (CYP2E1) transfiziert wurden (V79 CYP2E1) sowie Zellen, die ebenfalls durch Transfektion das humane Enzym Cytochromreduktase (auch Oxidoreduktase genannt) überexprimieren (V79 hOR). Beide Enzyme sind zusammen an der Hydroxylierung von Fremdstoffen beteiligt, bei der die Reduktion von molekularem Sauerstoff durch Übertragung von zwei Elektronen notwendig ist. Wird anstatt zweier Elektronen in Folge nur eines auf den Sauerstoff übertragen, so führt dieser von der Substratoxygenierung enkoppelte Vorgang zur Bildung von Superoxid. Daher galt es zu klären, ob das so erzeugte Superoxid und daraus gebildete ROS in der Lage sind, die DNA zu schädigen. Es konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von CYP2E1 nicht zu einem erhöhten basalen Gleichgewichtsspiegel oxidativer DNA-Schäden führt und die Metabolisierung von Ethanol durch dieses Enzym ebenfalls keine DNA-Modifikationen verursacht. Die Überexpression der Cytochromreduktase hingegen führte gegenüber dem Wildtyp zu einem erhöhten basalen Gleichgewichtsspiegel oxidativer Basenmodifikationen nach Depletion von Glutathion, einem wichtigen zellulären Antioxidans. Im Mikrokerntest, der gentoxische Ereignisse wie Chromosomenbrüche in Zellen aufzeigt, zeigte sich schon ohne Glutathion-Depletion eine doppelt so hohe Mikrokernrate im Vergleich zum Wildtyp. In weiteren Versuchen wurden die V79-hOR-Zellen mit dem chinoiden Redoxcycler Durochinon inkubiert, um zu untersuchen, ob das vermutlich durch die Reduktase vermittelte Redoxcycling über Generierung von ROS in der Lage ist, einen oxidativen DNA-Schaden und Toxizität zu verursachen. Hier zeigte sich, dass die Überexpression der Reduktase Voraussetzung für Toxizität und den beobachteten DNA-Schaden ist. Die Wildtyp-Zellen zeigten weder einen DNA-Schaden noch Zytotoxizität, auch eine zusätzliche Glutathion-Depletion änderte nichts an dem Befund. Die V79-hOR-Zellen hingegen reagierten auf die Inkubation mit Durochinon mit einer konzentrationsabhängigen Zunahme der Einzelstrangbrüche und oxidativen Basenmodifikationen, wobei sich der DNA-Schaden durch vorherige Glutathion-Depletion verdoppeln ließ.
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Es ist bekannt, dass die Überexpression eines einzigen Onkogens im Tumorgewebe einen maligneren Phänotyp zur Folge haben kann. Ein Beispiel hierfür ist die Rezeptortyrosinkinase HER-2. Besonders in Mamma- und Ovarialkarzinomen tritt häufig eine HER-2 Überexpression auf, die mit einer schlechteren Prognose für die Patientinnen einhergeht. Die HER-2 blockierende Therapie mit Trastuzumab (Herceptin®) konnte zu einer signifikanten Verbesserung der Überlebenszeit bei Patientinnen mit metastasierendem Mammakarzinom führen. Es ist deshalb von großem Interesse herauszufinden, ob ein Tumor durch gezielte Blockade eines bestimmten Onkogens sein tumorigenes Potential verlieren kann, und dadurch das Tumorwachstum zumindest zeitweise unterbunden wird. Die Frage ist also, ob ein Tumor reversibel sein kann, wenn die Expression seiner Onkogene blockiert wird. Frühere Arbeiten meiner Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass Tumore, die konditional humanes HER-2 exprimierten, nach Ausschalten von HER-2 tatsächlich in Remission gingen, d.h. reversibel waren. Tumorgrößenabhängig konnte sogar eine vollständige Tumorremission beobachtet werden. Die vorliegende Arbeit soll nun helfen, die beobachtete Remission nach Ausschalten von HER-2 besser verstehen zu können. Von Interesse sind dabei vor allem die molekularen Mechanismen, die in dem Tumor nach Ausschalten der HER-2 Expression ablaufen. Die konditionale Expression von HER-2 wurde mit Hilfe des TET-OFF Systems in NIH3T3 Mausfibroblasten erreicht. Mit dieser Technik wurde ein Maustumormodell etabliert, das ermöglichte, die Veränderungen in den Tumoren nach Ausschalten von HER-2 zu untersuchen. Ein besonderes Augenmerk wurde dabei auf zwei der durch HER-2 vermittelten Signalwege gerichtet, den Ras-MAP Kinase Signalweg und die Aktivierung von Akt über die Phosphoinositol-3 Kinase. Beide wurden nach Ausschalten der HER-2 Expression deaktiviert. Um herausfinden zu können, welcher der beiden Wege eine wichtigere Rolle bei der Tumorremission spielt, wurden in der vorliegenden Arbeit zwei weitere Maustumormodelle zur konditionalen Expression von humanem H-Ras bzw. einer Form des humanen c-Raf-1 (BXB-Raf1) etabliert. Die Modelle funktionierten auf dieselbe Weise wie das HER-2 Maustumormodell und es wurden auch dieselben Faktoren untersucht. Ras und Raf sind Mitglieder des Ras-MAP Kinase Signalweges. Raf ist aber im Gegensatz zu HER-2 und Ras nicht in der Lage, Akt zu aktivieren. Durch Vergleich der Ergebnisse der drei Maustumormodelle war es deshalb möglich zu differenzieren, ob Einflüsse auf die Tumorentwicklung über denn Ras-MAP Kinase oder den PI3K/Akt Signalweg vermittelt wurden. Auch Ausschalten von H-Ras oder BXB-Raf1 führte zu einer raschen Tumorremission. Damit wurde erneut die Frage nach der Reversibilität eines Tumors beantwortet. Ob die Remission auf einer Induktion von Apoptose beruhte, konnte nicht endgültig geklärt werden, da es zwar nach Ausschalten von HER-2 zu einer Erhöhung der Apoptoserate kam, nicht jedoch nach Ausschalten von H-Ras oder BXB-Raf1. Aufgrund der vorhandenen Ergebnisse wird vermutet, dass es zu einer Störung des Gleichgewichtes zwischen proliferationsfördernden und apoptotischen Faktoren nach Ausschalten der Onkogene kam. Die in den Tumoren vorhandene Spontanapoptose könnte dann ausreichen, den Prozess der Tumorremission auszulösen. Die Untersuchungen haben gezeigt, dass ERK bzw. der Ras-MAP Kinase Signalweg die bedeutendere Rolle bei der Tumorremission spielte. Zum einen wurde dies belegt durch die Beobachtung, dass die Tumorverläufe von HER-2 und BXB-Raf1 nahezu identisch waren. Zum anderen kam es in allen drei Modellen zu einer Dephosphorylierung von ERK, die der Tumorremission vorausging. Akt schien dagegen keine Rolle zu spielen, da das Ausschalten der HER-2, H-Ras oder BXB-Raf1 Expression zu keiner einheitlichen Veränderung des Posphorylierungsgrades von Akt führte. Demnach ist die Blockade des Ras-MAP Kinase Signalweges, der hauptsächlich proliferationsfördernde Eigenschaften besitzt, wichtiger für die Tumorremission als die Blockade des PI3K/Akt Signalweges, der hauptsächlich anti-apoptotische Eigenschaften vermittelt.
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Konditionale Modellsysteme zur Untersuchung der ERBB2-induzierten Tumorgenese Die Rezeptor-Tyrosinkinase ERBB2 ist in einer Vielzahl epithelialer Tumore, wie Mamma- und Ovarialkarzinomen, überexprimiert. Diese erhöhte Expression korreliert mit aggressivem Tumorwachstum, verstärkter Metastasierung und schlechter Prognose für den Patienten. Zur genaueren Untersuchung molekularer Mechanismen, die zur Tumorentstehung infolge der ERBB2-Überexpression führen, wurden im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe des Tet-Systems induzierbare MCF-7 Zelllinien generiert. Diese exprimieren bei Gabe von Doxyzyklin ERBB2 bzw. die zum humanen ERBB2 homologe und durch Punktmutation onkogen aktivierte Rattenvariante NeuT. Nachdem die stringente Regulierbarkeit durch Doxyzyklin für die untersuchten Zellklone gezeigt werden konnte, stellte sich bei der Charakterisierung der Zelllinien heraus, dass die Induktion von ERBB2 erstaunlicherweise nicht zur Proliferation der Zellen, sondern zum Wachstumsarrest führt. Bei der Untersuchung verschiedener Zellzyklusregulatoren konnte dieser Zellzyklusarrest dem CDK-Inhibitor P21 zugeordnet werden, dessen Expression durch ERBB2 induziert wird. In P21-Antisense-Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass P21 eine Schlüsselrolle beim ERBB2-induzierten Zellzyklusarrest spielt. Neben der Induktion von P21 und der daraus resultierenden Wachstumsinhibition zeigten die Zellen starke morphologische Veränderungen und waren positiv beim Nachweis der Seneszenz-assoziierten -Galaktosidase. Erstmals konnte gezeigt werden, dass die Induktion des Onkogens ERBB2 nicht zur Proliferation, sondern zur Aktivierung eines verfrühten Seneszenz-Programms führt, welches der Zelle Schutz gegen die Onkogeneinwirkung bietet. Bei der Untersuchung verschiedener Signaltransduktionskaskaden mit Inhibitormolekülen konnte die Aktivierung dieses Seneszenz-Programms der Stress-aktivierten Proteinkinase P38 zugeordnet werden. Zur Identifizierung von Genen, die für die ERBB2-induzierte Tumorgenese relevant sind, wurde die differenzielle Genexpression eines NeuT-Klons nach 8- bzw. 48-stündiger Induktion mit Doxyzyklin in einem cDNA-Array untersucht. Dabei zeigte sich eine besonders starke Induktion von Integrin 5 und Integrin 1, die zusammen den Fibronektinrezeptor bilden. Der funktionale Nachweis des Rezeptors in einem Adhäsionsassay demonstrierte ein stark erhöhtes Adhäsionsverhalten ERBB2-überexprimierender Zellen an Fibronektin. Bei der Untersuchung von Mamma-, Ovarial- und Endometriumkarzinomen konnte die Expression von ERBB2 mit der von Integrin 5 korreliert werden. Diese Ergebnisse machen Integrin 5 zu einem potenziellen neuen Tumormarker und Therapieziel in ERBB2-überexprimierenden Tumoren. Ein weiteres interessantes Gen, das sich im Array durch ERBB2 überexprimiert zeigte, war die Matrix-Metalloproteinase MMP-9. In einem Zymografieassay konnte die erhöhte Gelatinaseaktivität von MMP-9 in Dox-induzierten Zellen nachgewiesen werden. Der Einsatz verschiedener Signaltransduktionsinhibitoren ergab, dass auch die ERBB2-induzierte Expression von MMP-9 über die Aktivierung von P38 läuft. Bei der Suche nach weiteren MMPs, die für die ERBB2-induzierte Tumorgenese relevant sein könnten, wurde MMP-13 untersucht. Erstmals konnte gezeigt werden, dass diese Matrix-Metalloproteinase von ERBB2 induziert wird. Dieser interessante Befund wurde auch in einem anderen Zellmodell in NIH3T3 Mausfibroblasten verifiziert. Durch ihre Matrix-degradierenden Eigenschaften sind MMPs potente „Werkzeuge“ für Tumorzellen und stellen ein wichtiges Ziel zur Unterbindung der Invasion und Metastasierung dieser Zellen dar. Neben den Zellkulturarbeiten wurden im Rahmen dieser Dissertation transgene Responder-Mäuse generiert, die NeuT unter Kontrolle eines Tet-responsiven Promotors exprimieren. Von vier transgenen Gründerlinien zeigten zwei eine unerwünschte, basale NeuT-Expression, für die beiden anderen Linien konnte sowohl in MEF-Assays, als auch nach Kreuzung mit rtTA- bzw. tTA-Effektor-Mäusen eine Dox-abhängige Regulation des Transgens gezeigt werden. Die Tiere dieser Linien sollen in Zukunft mit Effektor-Mäusen gepaart werden, die den rtTA bzw. tTA spezifisch in für die ERBB2-Tumorgenese relevanten Geweben, wie Ovarial- oder Lungenepithelzellen, exprimieren. So können individuelle Tumormodelle für die verschiedenen epithelialen Tumore, bei denen die Überexpression von ERBB2 von Bedeutung ist, entwickelt und untersucht werden.
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Die Kontrolle der produktiven Cytomegalovirus- (CMV) Infektion ist von der effizienten Rekonstitution antiviraler CD8 T-Zellen abhängig. Dies führt jedoch nicht zur vollständigen Eliminierung des viralen Genoms aus den Zielorganen, sondern das Virus verbleibt in einem nicht-replikativen Zustand: der Latenz. Es ist bekannt, dass während der Latenz nur ein geringer Anteil latenter mCMV-Genome in der Lunge die Major Immediate Early (MIE) Gene ie1 und ie2 exprimiert, die Latenz aber dennoch bestehen bleibt, weil das differentielle Splicing des primären IE1/3-Transkripts zum Transaktivator-Transkript IE3 nicht erfolgt. Damit war neben der Initiation der IE-Genexpression am MIE-Promotor-Enhancer das IE1/3-Splicing als zweiter molekularer Latenz-Kontrollpunkt identifiziert. Parallel zur Latenz-assoziierten IE1-Genexpression sind in der Lunge aktivierte CD62L-low CD8 T-Zellen mit Spezifität für das immundominante IE1-Peptid 168-YPHFMPTNL-176 angereichert. Dies legte die Hypothese nahe, dass neben der molekularen Kontrolle der Latenz auch eine immunologische Kontrolle, beispielsweise durch IE1-Epitop-spezifische CD8 T-Zellen besteht. Zur Evaluierung dieser Hypothese wurde in der vorliegenden Arbeit mittels BAC-Mutagenese erstmals ein rekombinantes mCMV generiert, in dem das IE1-Peptid durch Punktmutation der C-terminalen MHC-Ankeraminosäure L176A zerstört ist. Dazu musste zunächst die Technik der BAC-Mutagenese herpesviraler Genome (in Anlehnung an die publizierten Arbeiten von Messerle et al., 1997; Borst et al., 1999, 2004; Wagner et al., 1999) in der Arbeitsgruppe etabliert werden. Neben der Funktionsverlust-Mutante (mCMV-IE1-L176A) wurden zur Kontrolle zwei Revertanten (mCMV-IE1-A176L und mCMV-IE1-A176L*) generiert. In letzterer, als Wobble-Revertante bezeichnet, wird wieder die authentische MHC-Ankeraminosäure L eingesetzt, es verbleibt aber ein singulärer Nukleotidaustausch A->T in der Wobble-Position des Codons als Marker zur Unterscheidung zum WT-mCMV zurück. Der immunologische Phänotyp der Funktionsverlust-Mutante, also die funktionelle Auslöschung des antigenen IE1-Peptids im Priming einer CD8 T-Zell-Antwort, entsprach der Erwartung. Entsprechend konnte nach Infektion mit der Funktionsverlust-Mutante keine Reaktivität gegen das IE1-Peptid nachgewiesen werden. In den Revertanten hingegen war die Erkennung des IE1-Peptids wieder hergestellt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen weiter, dass die Funktionsverlust-Mutante sowie die Revertanten ohne signifikante Beeinflussung in vitro in permissiven Fibroblasten und in vivo in verschiedenen Geweben replizieren. Wie aktuelle Daten nach Knochenmarktransplantation und Infektion mit der Funktionsverlust-Mutante im Vergleich zu den Revertanten zeigen, ist die Frequenz Latenz-assoziierter IE1-Transkriptionsereignisse bei der Funktionsverlust-Mutante signifikant erhöht. Damit konnte erstmalig der Beweis für eine Kontrolle der Latenz-assoziierten IE1-Genexpression durch IE1-Epitop-spezifische CD8 T-Zellen und damit für eine Präsentation des IE1-Peptids während der Latenz erbracht werden.
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Die Alterung stellt den größten Risikofaktor für die Entwicklung der Alzheimer Krankheit dar, wobei die biochemische Basis dieser Korrelation bisher nicht bekannt ist. Ein möglicherweise zentraler Mechanismus der Alzheimer Pathologie wird durch die Prozessierung von APP repräsentiert, die in der Synthese von Aβ resultiert. Der Einfluss zellulärer Alterung auf die Biochemie der APP-Prozessierung ist bislang weitestgehend ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Prozessierung von endogenem APP im Verlauf der Zellalterung humaner Fibroblasten progressiv verringert wird. Die Bildung der intrazellulären APP-Spaltfragmente (C99, C83 und AICD) nahm mit zunehmender Lebensspanne ab und war gleichfalls mit einer reduzierten Synthese von extrazellulären APP-Fragmenten (sAPP, sAPPα) verbunden. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass die Reifung von APP in seneszenten Zellen selektiv reduziert war, und dass dies durch altersabhängig erhöhte zelluläre Cholesterolspiegel vermittelt wurde. Von den APP-prozessierenden Sekretasen waren die Proteinspiegel von Presenilin-1 und Nicastrin, beides Komponenten der γ-Sekretase, im Verlauf der Zellalterung graduell verringert. Dies hatte einen progressiven Rückgang der enzymatischen Aktivität der γ-Sekretase zur Folge, wodurch die Prozessierung von APP unmittelbar reduziert wurde. Die Proteinspiegel von ADAM10, einer α-Sekretase, sowie der β-Sekretase, BACE, wiesen keine Altersregulation auf, aber interessanterweise wurde eine erhöhte enzymatische Aktivität der β-Sekretase in seneszenten Zellen nachgewiesen. Die γ-Sekretase sowie BACE sind in Lipid Rafts lokalisiert, geordneten Membransubdomänen, die hohe Cholesterol- und Caveolin-1-Spiegel aufweisen. Obwohl das Gesamtniveau dieser strukturellen Komponenten von Lipid Rafts in seneszenten Zellen erhöht war, war die Assoziation beider Moleküle mit Lipid Rafts reduziert und sie akkumulierten in speziellen Organellen, die höchstwahrscheinlich Lipidkörper darstellen. Somit wurde gezeigt, dass Lipid Rafts im Zuge der Zellalterung disintegrieren beziehungsweise in ihrem Gesamtspiegel reduziert waren. Diese altersabhängige Membranmodifikation war mit einer veränderten Verteilung von Presenilin-1 und BACE zwischen der Lipid Raft und der Nicht Raft Fraktion der Membran verbunden, die möglicherweise das Potential dieser Enzyme zur Prozessierung von APP reduzierte. In einem zweiten Teil der Arbeit wurden transgene C. elegans konstruiert, die humanes APP exprimieren, das C-terminal an GFP gekoppelt war. Diese Würmer wiesen eine reduzierte Fertilität, Eilegedefekte und eine verzögerte post-embryonale Entwicklung auf, die möglicherweise auf eine Transgen-vermittelte Neurodegeneration zurückgeführt werden können. Durch erste Untersuchungen der Prozessierung des Transgens konnten Spaltfragmente nachgewiesen werden, die potentiell auf eine spezifische Spaltung von APP durch die endogenen Sekretasen schließen lassen. Somit werden die Prozessierung sowie die Reifung von APP durch die altersabhängige Modifikationen zellulärer Biochemie nachhaltig beeinflusst. Zukünftige Studien sollen zeigen, ob sich diese zellulären Zusammenhänge in den Gesamtorganismus C. elegans übertragen lassen. Des Weiteren sollen die altersabhängigen zellulären Veränderungen, insbesondere des Cholesterol-Metabolismus und der Sekretaseaktivitäten, weitergehend analysiert werden, um zusätzliche Erkenntnisse über altersassoziierte Regulationen möglicher therapeutischer Ziele der Alzheimer Erkrankung zu gewinnen.
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DNA methylating compounds are widely used as anti-cancer chemotherapeutics. The pharmaceutical critical DNA lesion induced by these drugs is O6-methylguanine (O6MeG). O6MeG is highly mutagenic and genotoxic, by triggering apoptosis. Despite the potency of O6MeG to induce cell death, the mechanism of O6MeG induced toxicity is still poorly understood. Comparing the response of mouse fibroblasts wild-type (wt) and deficient for ataxia telangiectasia mutant protein (ATM), a kinase responsible for both the recognition and the signalling of DNA double-strand breaks (DSBs), it was shown that ATM deficient cells are more sensitive to the methylating agents N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), methyl methansulfonate (MMS) and the anti-cancer drug temozolomide, in both colony formation and apoptosis assays. This clearly shows that DSBs are involved in O6MeG toxicity. By inactivating the O6MeG repair enzyme O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) with the specific inhibitor O6-benzylguanine (O6BG), ATM wt and deficient cells became more sensitive to MNNG and MMS. The opposite effect was observed when over-expressing MGMT in ATM -/- cells. The results show that O6MeG is the critical DNA lesion causing death in ATM cells following MNNG treatment, and is partially responsible for the toxicity observed following MMS treatment. Furthermore, by inhibiting the ATM kinase activity with caffeine, it was shown that the resistance of wt cells to MNNG was due to the kinase activity of ATM, as wt cells underwent more apoptosis following methylating agent treatment in the presence of caffeine. Apoptosis and caspase-3 activation were late events, starting 48h after treatment. This lends support to the model where O6MeG lesions are converted into DSBs during replication. As ATM wt and deficient cells showed similar G2/M blockage and Chk1 activation following MNNG and MMS treatment, it was concluded that the protective effect of ATM is not due to cell cycle progression control. The hypersensitivity of ATM deficient cells was accompanied by their inability to activate the anti-apoptotic NFkB pathway. In a second part of this study, it was shown that the inflammatory cytokine IL-1 up-regulates the DNA repair gene apurinic endonuclease 2 (APEX2). Up-regulation of APEX2 occurred by transcriptional regulation as it was abrogated by actinomycin D. APEX2 mRNA accumulation was accompanied by increase in APEX2 protein level. IL-1 induced APEX2 expression as well as transfection of cells with APEX2 cDNA positively correlated with a decrease in apoptosis after treatment with genotoxic agents, particularly affecting cell death after H2O2. This indicates an involvement of APEX2 in the BER pathway in cells responding to IL-1.
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Generierung und Prozessierung oxidativer DNA Schäden --- Ziel dieser Arbeit war es, adaptive Antworten der Zellen auf einen DNA Schädigung zu untersuchen. Hierzu wurden Experimente zur Reparatur oxidierter Basen (Substrate der Basen Exzisions Reparatur (BER)) oder von Pyrimidindimeren (Substrate der Nukleotid Exzisions Reparatur (NER)) nach einer Vorbehandlung mit DNA-schädigender Agenzien durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl eine Vorbehandlung mit einer alkylierenden als auch mit einer oxidierenden Substanz zu einer adaptiven Erhöhung des zellulären Glutathionspiegels führte, die 16 h nach der Schädigung ihr Maximum erreichte. Jedoch waren die 8-oxoG Glykosylaseaktivitäten über einen Zeitraum von 18 h konstant. Diese Effekte waren unabhängig davon, ob Maus Embryofibroblasten, primäre oder p53 profiziente menschliche Zellen verwendet wurden. Die BER war ebenfalls in keiner der verschiedenen Zelllinien signifikant verbessert. Die adaptive Antwort bezüglich der Glutathionspiegel war also nicht mit einer entsprechenden Veränderung bei der DNA-Reparatur verbunden. Folglich ist die Reparatur von oxidativen DNA-Schäden durch eine vorausgehende Schädigung nicht induzierbar. Der zweite Teil der Untersuchungen zu der Reparatur beschäftigte sich mit der NER. Hierzu wurde die Reaktivierung eines mit UVB-Strahlung geschädigten Plasmids untersucht. Als Wirtszellen fungierten primäre menschliche Fibroblasten und Keratinozyten, die entweder mit UVB vorbehandelt oder ungeschädigt waren. Auch für die NER konnte keine signifikante Beschleunigung der Reparatur von Pyrimidindimeren durch eine Vorbehandlung festgestellt werden. Die Reaktivierung erfolgte ferner unabhängig vom p53-Status der Zellen, wie Versuche mit p53-siRNA zeigten. Neben der Prozessierung war die Generierung oxidativer DNA Schäden Gegenstand der Arbeit. Die verwendete Substanz Tirapazamin (TPZ) ist ein für hypoxische Zellen selektives, neues Zytostatikum und befindet sich momentan in Phase 2/3 der klinischen Prüfung. Ziel war es die von TPZ verursachten DNA Modifikationen zu charakterisieren, sowie die Toxizität und Genotoxizität zu untersuchen. Da es Hinweise auf eine Aktivierung von TPZ über eine Oxidoreduktase (OR) gab, wurden die Experimente in Wildtyp und hOR überexprimierenden Zellen durchgeführt. Die Quantifizierung der verursachten DNA-Modifikationen zeigte, dass der von TPZ verursachte Schaden in Zellen mit hOR erhöht war. Das erhaltene Schadensprofil der durch TPZ verursachten DNA-Modifikationen war dem Schadensprofil von durch Gamma-Strahlung intrazellulär verursachten Hydroxylradikalen sehr ähnlich. Da es nach der Aktivierung von TPZ durch eine OR zu einer Abspaltung von Hydroxylradikalen kommt, bestätigte dies den vermuteten Mechanismus. Weitere Untersuchungen mit t-Butanol, einem Hydroxylradikal Fänger, ergaben eine verminderte DNA-Schädigung, was ebenfalls für eine DNA-Schädigung durch Hydroxylradikale spricht. Untersuchungen zur Mutagenität zeigten das die Mutationsrate in Zellen mit hOR um das 4 fache erhöht ist. Erstaunlich war jedoch, dass der im gleichen Ausmaß von Gamma-Strahlung verursachte DNA-Schaden für die beobachtete Toxizität dieser verantwortlich war, während bei TPZ unter den gleichen Bedingungen keine Toxizität vorlag. Erklärt werden könnte die erhöhte Toxizität und Mutagenität durch so genannte geclusterte DNA-Schäden, die von Gamma-Strahlen, nicht jedoch von TPZ gebildet werden. Nach einer verlängerten Inkubation wurde sowohl für die Toxizität als auch für die Genotoxizität erneut ein verstärkender Effekt durch die OR bestätigt. Überraschend war weiterhin die von der OR unabhängige Generierung von Doppelstrangbrüchen, für die demnach ein grundsätzlich anderer Mechanismus, wie zum Beispiel eine direkte Interaktion mit der Topoisomerase II, angenommen werden muss.
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Apolipoprotein J (ApoJ) ist ein sezerniertes heterodimeres 80kDa Glykoprotein mit zytoprotektiven und antiinflammatorischen Eigenschaften, das ein nahezu ubiquitäres Expressionsmuster aufweist. Eine stark erhöhte ApoJ-Expression ist mit neurodegenerativen Erkrankungen, Atherosklerose, myokardialem Infarkt sowie einer Vielzahl anderer pathophysiologischer Bedingungen assoziiert. Die potentielle Bedeutung von ApoJ umfasst eine Funktion als extrazelluläres Chaperon, Komplementinhibitor, NF-kB-Inhibitor sowie eine Beteiligung an der Endozytose von nekrotischen Zellfragmenten. Unter Bedingungen, die zu einer massiven Akkumulation von absterbenden Zellen führen, ist eine vermehrte Expression von ApoJ auf die überlebenden Nachbarzellen in den betroffenen Geweben beschränkt. Die molekularen Mechanismen, die dieser gesteigerten ApoJ-Genexpression zugrunde liegen, sind jedoch unbekannt. Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe konnten zeigen, dass eine Inkubation mit nekrotischem Zellmaterial in vitro eine Akkumulation von ApoJ-mRNA in Fibroblasten der Zelllinie Rat1 induziert, was darauf hindeutet, dass unter pathophysiologischen Bedingungen von nekrotischen Zellen exponierte bzw. freigesetzte Faktoren zu einer gesteigerten ApoJ-Genexpression in umliegenden vitalen Zellen beitragen können. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen zeigen eine Korrelation zwischen der Expression von Toll-like Rezeptoren (TLRs) in Fibroblasten (Rat1), glatten Gefäßmuskelzellen (CRL2018) sowie embryonalen Dottersackzellen (10A) und einer durch nekrotische Zellen induzierten ApoJ-mRNA-Expression in diesen Zelllinien. Es wird angenommen, dass TLRs neben pathogenassoziierten Strukturen (PAMPs) auch durch körpereigene Agonisten wie Hitzeschockproteine und Nukleinsäuren aktiviert werden. In weiterführenden Experimenten stellte sich unter anderem heraus, dass neben nekrotischen Zellen auch der TLR3-spezifische Agonist Poly(I:C), eine synthetische doppelsträngige RNA, ausschließlich in den beiden TLR3-exprimierenden Zelllinien CRL2018 und Rat1, nicht jedoch in TLR3-defizienten 10A-Zellen, die ApoJ-mRNA-Expression induziert. Darüber hinaus führt auch die Inkubation mit eukaryotischer RNA (Gesamt-RNA, t-RNA) zu einer Akkumulation von ApoJ-mRNA in CRL2018-Zellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen erstmals, dass die Expression von ApoJ-mRNA durch extrazelluläre Ribonukleinsäuren in TLR3-abhängiger Weise induziert wird, was darauf hindeutet, dass in verletzten Geweben aus post-apoptotischen oder nekrotischen Zellen freigesetzte Ribonukleinsäuren zu einer vermehrten ApoJ-Genexpression in vitalen Nachbarzellen beitragen.
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The nervous system is the most complex organ in animals and the ordered interconnection of neurons is an essential prerequisite for normal behaviour. Neuronal connectivity requires controlled neuronal growth and differentiation. Neuronal growth essentially depends on the actin and microtubule cytoskeleton, and it has become increasingly clear, that crosslinking of these cytoskeletal fractions is a crucial regulatory process. The Drosophila Spectraplakin family member Short stop (Shot) is such a crosslinker and is crucial for several aspects of neuronal growth. Shot comprises various domains: An actin binding domain, a plakin-like domain, a rod domain, calcium responsive EF-hand motifs, a microtubule binding Gas2 domain, a GSR motif and a C-terminal EB1aff domain. Amongst other phenotypes, shot mutant animals exhibit severely reduced dendrites and neuromuscular junctions, the subcellular compartmentalisation of the transmembrane protein Fasciclin2 is affected, but it is also crucially required in other tissues, for example for the integrity of tendon cells, specialised epidermal cells which anchor muscles to the body wall. Despite these striking phenotypes, Shot function is little understood, and especially we do not understand how it can carry out functions as diverse as those described above. To bridge this gap, I capitalised on the genetic possibilities of the model system Drosophila melanogaster and carried out a structure-function analysis in different neurodevelopmental contexts and in tendon cells. To this end, I used targeted gene expression of existing and newly generated Shot deletion constructs in Drosophila embryos and larvae, analyses of different shot mutant alleles, and transfection of Shot constructs into S2 cells or cultured fibroblasts. My analyses reveal that a part of the Shot C-terminus is not essential in the nervous system but in tendon cells where it stabilises microtubules. The precise molecular mechanism underlying this activity is not yet elucidated but, based on the findings presented here, I have developed three alternative testable hypothesis. Thus, either binding of the microtubule plus-end tracking molecule EB1 through an EB1aff domain, microtubulebundling through a GSR rich motif or a combination of both may explain a context-specific requirement of the Shot C-terminus for tendon cell integrity. Furthermore, I find that the calcium binding EF-hand motif in Shot is exclusively required for a subset of neuronal functions of Shot but not in the epidermal tendon cells. These findings pave the way for complementary studies studying the impact of [Ca2+] on Shot function. Besides these differential requirements of Shot domains I find, that most Shot domains are required in the nervous system and tendon cells alike. Thus the microtubule Gas2 domain shows no context specific requirements and is equally essential in all analysed cellular contexts. Furthermore, I could demonstrate a partial requirement of the large spectrin-repeat rod domain of Shot in neuronal and epidermal contexts. I demonstrate that this domain is partially required in processes involving growth and/or tissue stability but dispensable for cellular processes where no mechanical stress resistance is required. In addition, I demonstrate that the CH1 domain a part of the N-terminal actin binding domain of Shot is only partially required for all analysed contexts. Thus, I conclude that Shot domains are functioning different in various cellular environments. In addition my study lays the base for future projects, such as the elucidation of Shot function in growth cones. Given the high degree of conservation between Shot and its mammalian orthologues MACF1/ACF7 and BPAG1, I believe that the findings presented in this study will contribute to the general understanding of spectraplakins across species borders.
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The thesis is set in three different parts, according to the relative experimental models. First, the domestic pig (Sus scrofa) is part of the study on reproductive biotechnologies: the transgenesis technique of Sperm Mediated Gene Transfer is widely studied starting from the quality of the semen, through the study of multiple uptakes of exogenous DNA and lastly used in the production of multi-transgenic blastocysts. Finally we managed to couple the transgenesis pipeline with sperm sorting and therefore produced transgenic embryos of predetermined sex. In the second part of the thesis the attention is on the fruit fly (Drosophila melanogaster) and on its derived cell line: the S2 cells. The in vitro and in vivo models are used to develop and validate an efficient way to knock down the myc gene. First an efficient in vitro protocol is described, than we demonstrate how the decrease in myc transcript remarkably affects the ribosome biogenesis through the study of Polysome gradients, rRNA content and qPCR. In vivo we identified two optimal drivers for the conditional silencing of myc, once the flies are fed with RU486: the first one is throughout the whole body (Tubulin), while the second is a head fat body driver (S32). With these results we present a very efficient model to study the role of myc in multiple aspects of translation. In the third and last part, the focus is on human derived lung fibroblasts (hLF-1), mouse tail fibroblasts and mouse tissues. We developed an efficient assay to quantify the total protein content of the nucleus on a single cell level via fluorescence. We coupled the protocol with classical immunofluorescence so to have at the same time general and particular information, demonstrating that during senescence nuclear proteins increase by 1.8 fold either in human cells, mouse cells and mouse tissues.
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Apolipoprotein J (ApoJ) ist ein heterodimeres sekretiertes Glycoprotein, welchem sowohl antiapoptotische als auch antiinflammatorische Eigenschaften zugeschrieben werden. Es wird unter vielen pathophysiologischen Zuständen verstärkt exprimiert. Dazu zählen viele Krankheiten wie z.B. Krebs, M. Alzheimer, Creuzfeldt Jakob und Atherosklerose. Die vorliegende Arbeit befasst sich zum Einen mit der Funktion von ApoJ bei Atherosklerose und zum Anderen mit der Regulation von ApoJ durch in atherosklerotischen Läsionen vorkommende Bestandteile. Für die Untersuchungen der Funktion von ApoJ bei der Atherosklerose wurde die „Mainzer Hypothese“ zugrunde gelegt, die davon ausgeht, dass enzymatisch verdautes LDL (high density lipoprotein) (E-LDL) ursächlich für die Entstehung von atherosklerotischen Läsionen ist. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass ApoJ zwar an E-LDL bindet, nicht aber an natives LDL und dass durch diese Bindung die zytotoxische Wirkung von E-LDL auf glatte Muskelzellen der Ratte unterdrückt wird. Mittels Annexinfärbung und Caspase-Messung konnte gezeigt werden, dass ApoJ in diesem Fall eine antiapoptotische Funktion aufweist. Durch immunhistochemische Untersuchungen an humanen Gewebsschnitten aus frühen atherosklerotischen Läsionen konnte eine Kolokalisation von ApoJ und E-LDL nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse unterstreichen die Mainzer Hypothese. Durch eine Behandlung von glatten Muskelzellen der Ratte mit den Lipoproteinen LDL/E-LDL und nekrotischen Zellen sollte die Regulation von ApoJ durch in atherosklerotischen Läsionen vorhandenen Stimuli untersucht werden. Frühere Arbeiten unserer Arbeitsgruppe konnten bereits zeigen, dass eine Behandlung mit nekrotischen Zellen zu einer vermehrten Expression der ApoJ-mRNA führt und dass diese Regulation in Korrelation mit der Expression von Toll-like Rezeptoren (TLR) der verschiedenen Zellen steht. In dieser Arbeit konnte RNA aus nekrotischen Zellen als ApoJ-induzierende Komponente identifiziert werden. Durch Inhibition der TLR3-Signalwege konnten erste Hinweise darüber gewonnen werden, über welche Signaltransduktionswege die ApoJ Regulation erfolgt. Eine Behandlung der Zellen mit E LDL und LDL hingegen führte zu einer Repression der ApoJ-Sekretion. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass in atherosklerotischen Läsionen sowohl ApoJ induzierende wie auch repremierende Stimuli vorhanden sind.
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Die grundlegenden Prinzipien und Möglichkeiten der Oberflächencharakterisierung mittels ToF-SIMS (Flugzeit-Sekundärionen Massenspektrometrie) werden an ausgewählten Beispielen aus einem aktuell laufenden und vom BMBF geförderten Verbundforschungsprojekt (Fkz: 03N8022A) zum Thema Nanofunktionalisierung von Grenzflächen vorgestellt. Ein Schwerpunkt innerhalb des Projekts stellen die nichtgeschlossenen Schichtsysteme dar, die entweder über Domänenstrukturen oder einer definierten Einzelfunktionalisierung neuartige funktionelle Oberflächen bereitstellen. Mithilfe der sehr oberflächensensitiven ToF-SIMS Methode sowie der Möglichkeit einer graphischen Darstellung lateraler Molekülionenverteilungen auf funktionalisierten Oberflächen können Informationen über Struktur und Belegungsdichte der Funktionsschicht gewonnen werden. Die Kombination des ToF-SIMS Experimentes und eines multivariaten Algorithmus (partial least squares, PLS) liefert eine interessante Möglichkeit zur quantitativen und simultanen Bestimmung von Oberflächeneigenschaften (Element- und molekulare Konzentrationen sowie Kontaktwinkelwerte). Da das ToF-SIMS Spektrum einer plasmafunktionalisierten Oberfläche im Allgemeinen eine Vielzahl unterschiedlicher Fragmentsignale enthält, lässt eine einfache eindimensionale Korrelation (z.B. CF3 - Fragmentintensität ßà CF3-Konzentration) den größten Teil der im Spektrum prinzipiell enthaltenen Information unberücksichtigt. Aufgrund der großen Anzahl von atomaren und molekularen Signalen, die repräsentativ für die chemische Struktur der analysierten Oberflächen sind, ist es sinnvoll, diese Fülle von Informationen zur Quantifizierung der Oberflächeneigenschaften (Elementkonzentrationen, Kontaktwinkel etc.) zu verwenden. Zusätzlich ermöglicht diese Methode eine quantitative Bestimmung der Oberflächeneigenschaften auf nur µm-großen Bereichen. Das ist vorteilhaft für Untersuchungen chemisch strukturierter Oberflächen, da die Größe der Strukturierung für viele Anwendungen in einem Bereich von mehreren µm liegt. Anhand eines Beispieles aus dem biologisch-medizinischen Fachgebiet, soll der erfolgreiche Einsatz multivariater Modelle aufgezeigt werden. In diesem Experiment wurden menschlichen Bindegewebs- (Fibroblasten) und Pankreaszellen auf plasmafunktionalisiserten Oberflächen kultiviert, um die Beeinflussung der Funktionalisierung auf das Zellwachstum zu untersuchen. Die plasmabehandelten Oberflächen wurden durch die Verwendung von TEM-Gittern mit µm-großen Öffnungen chemisch strukturiert und das Wachstumsverhalten der Zellen beobachtet. Jedem dieser µm-großen Bereiche können mithilfe der multivariaten Modelle quantitative Größen zugeordnet werden (Konzentrationen und Kontaktwinkelwerte), die zur Interpretation des Wachstumsverhaltens der Zellen beitragen.
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Die Untersuchungen der murinen Cytomegalovirus (mCMV) Infektion im BALB/c Mausmodell konzentrierten sich bislang auf die Lunge, da diese einen Hauptort der mCMV Latenz darstellt. Da latentes CMV auch häufig durch Lebertransplantationen übertragen wird, wurde in dieser Arbeit die Leber als ein weiteres medizinisch relevantes Organ der CMV Latenz und Reaktivierung untersucht. Um zunächst die zellulären Orte der mCMV Latenz in der Leber zu ermitteln, wurden verschiedengeschlechtliche Knochenmarktransplantationen (KMT) mit männlichen tdy-positiven Spendern und weiblichen, tdy-negativen Empfängern, mit anschließender mCMV Infektion durchgeführt, um latent infizierte Mäuse mit geschlechtschromosomalem Chimärismus zu generieren. Diese Chimären erlaubten eine Unterscheidung zwischen tdy-positiven Zellen hämatopoetischen Ursprungs und tdy-negativen stromalen und parenchymalen Gewebszellen. Die Separation von Leberzellen der Chimären mittels zentrifugaler Elutriation und anschließender DNA Quantifizierung viraler und zellulärer Genome durch eine quantitative real-time PCR ergab einen ersten Hinweis, dass Endothelzellen ein zellulärer Ort der mCMV Latenz sind. Die darauf folgende immunomagnetische Zelltrennung lokalisierte latente virale DNA in der CD31-positiven Zellfraktion. Die Koexpression von CD31 mit dem endothelzellspezifischen Oberflächenmarker ME-9F1 identifizierte die sinusoidalen Endothelzellen der Leber (LSEC) als die Zellen, die latente virale DNA beherbergen. In den zytofluorometrisch aufgereinigten CD31+/ME-9F1+ LSEC waren bei gleichzeitigem Rückgang der männlichen tdy Markergene virale Genome angereichert, was darauf hinwies, dass Zellen, die virale DNA enthalten, vom Knochenmark-Empfänger stammen. Durch zytofluorometrische Analysen isolierter LSEC konnte eine vom Spender abstammende Subpopulation MHCII+/CD11b+ LSEC identifiziert werden. Anschließende Quantifizierungen viraler DNA aus latent infizierten Mäusen detektierten eine Abnahme viraler Genome mit zunehmender Menge an tdy-positiven Zellen, was beweist, dass MHCII+/CD11b+ LSEC keinen Ort der mCMV Latenz darstellen. Die limiting dilution Untersuchungen der isolierten latent infizierten LSEC ergaben eine Frequenz von einer latent infizierten Zelle unter ~1,9x104 LSEC und eine Anzahl von 7 bis 19 viralen Genomen pro latent infizierter Zelle. Nach 24 Stunden Kultivierung der LSEC konnte mittels quantitativer real-time RT-PCR mit Gesamt-RNA aus LSEC ein Anstieg der Genexpression der immediate early Gene ie1 und ie3 sowie eine Induktion des early Gens e1 gezeigt werden. Eine Erhöhung der transkriptionellen Reaktivierung durch die Inkubation der LSEC mit unterschiedlichen HDAC Inhibitoren konnte allerdings nicht erzielt werden, da sowohl die Menge der isolierten RNA aus behandelten Kulturen, als auch die Anzahl viraler Transkripte im Vergleich zu den unbehandelten Kulturen erniedrigt war. Aufgrund der kurzen Lebensdauer isolierter LSEC in vitro konnte durch Kokultivierungen latent infizierter LSEC zusammen mit murinen embryonalen Fibroblasten keine Virusreaktivierung induziert werden. Im Gegensatz dazu wurden durch den Transfer gereinigter ME-9F1+/CD31+ LSEC aus latent infizierten Spendern in immunsupprimierte Empfänger virale Rekurrenzen in Lungenexplantatkulturen des Rezipienten detektiert. Damit konnten LSEC eindeutig als zellulärer Ort von mCMV Latenz und Reaktivierung in der Leber identifiziert werden.
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Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) sind ubiquitäre Verschmutzungen der Umwelt und entstehen während der unvollständigen Verbrennung organischen Materials wie Holz, Kohle und Erdöl. Werden diese chemisch nicht reaktiven PAK in den Körper aufgenommen, durchlaufen sie eine Reihe von enzymatischen Umsetzungen, die unter der Bezeichnung Fremdstoffmetabolismus zusammengefasst werden. Die chemische Umsetzung des PAK und Prokarzinogens Benzo[a]pyren (B[a]P) führt u.a. zur Bildung des reaktiven Metaboliten B[a]P-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxid (BPDE). BPDE ist stark elektrophil und kann auf Grund dieser Eigenschaft an nukleophile Makromoleküle wie Proteine und DNA binden. Die Bildung von BPDE-DNA-Addukten resultiert in der Entstehung von Mutationen und kann zur Tumorbildung führen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte die Wirkung von BPDE als Modellsubstanz für gentoxische Agenzien auf intrazelluläre Signalkaskaden und die Konsequenzen der BPDE-Exposition bezüglich der Zellaktivität untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass BPDE-Behandlung von Mausfibroblasten eine intrazelluläre Signalkaskade induziert, welche zur Aktivierung der Stressaktivierten Proteinkinasen (SAPK) JNK und p38 führt. An dieser Signalkaskade sind Src-ähnliche Kinasen beteiligt. BPDE-Behandlung führt in den untersuchten Mausfibroblasten zur Induktion von DNA-Einzelstrangbrüchen, deren Auftreten zeitlich mit der SAPK-Aktivierung korreliert. Die BPDEinduzierten DNA-Strangbrüche sind die Folge der Entfernung dieser Läsionen aus dem Genom durch die Nukleotidexzisionsreparatur (NER). Erkannt werden BPDE-DNA-Addukte durch die NERProteine XPA und XPC (Xeroderma Pigmentosum Komplementationsgruppe A und C). Nach der Erkennung von BPDE-DNA-Addukten kommt es zur Rekrutierung von Nukleasen, welche die vorliegende Läsion und umliegende Nukleotide aus dem Genom entfernen. In XPA- und XPCdefizienten Mausfibroblasten induziert BPDE daher keine DNA-Strangbrüche. Jedoch ist nur in XPCdefizienten Zellen, aber nicht in XPA-defizienten Zellen, die SAPK-Aktivierung drastisch reduziert. Behandlung von Mausfibroblasten mit Benzo[c]phenanthren-3,4-Diol-1,2-Epoxid, einem PAK, dessen DNA-Addukte schlecht durch NER-Faktoren erkannt und repariert werden, führt zu keiner SAPKAktivierung. Die Aktivierung von p38 und JNK scheint demnach abhängig zu sein von der Erkennung des primären DNA-Schadens. Die XPC-abhängige SAPK-Aktivierung schützt die Zellen vor BPDEabhängiger Toxizität, da sowohl XPC- als auch p38-defiziente Mausfibroblasten eine höhere Sensitivität gegenüber BPDE zeigen als korrespondierende Wildtypzellen. Zusamenfassend konnte in dieser Arbeit ein neuer Signalweg beschrieben werden, in dem DNASchäden, verursacht durch BPDE, über die XPC-abhängige DNA-Schadenserkennung, die Aktivierung der SAPK induziert. Diese Aktivierung der SAPK schützt vor BPDE-induzierter Toxizität.
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Das humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein fakultativ-pathogener Erreger, der bei Patienten mit geschwächter oder unausgereifter Immunabwehr schwerwiegende Erkrankungen hervorrufen kann. Wie alle Herpesviren zeigt das HCMV eine streng koordinierte Expression viraler Gene, die in eine „sehr frühe-“ (IE), „frühe “ (E) und „späte-“ (L) Phase unterteilt werden kann. Die Produkte der IE-Gene IE1 und IE2 sind für die Expression der frühen Gene und somit für die Initiation der viralen DNA-Replikation entscheidend. Sie greifen gleichzeitig in den zellulären Stoffwechsel ein und schaffen damit optimale Vorraussetzungen für die virale Vermehrung. Zu Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass HCMV in lytisch infizierten Zellen ein abundantes IE-Transkript von 5 kb (IE4-RNA) exprimierte, dessen Funktion bislang unklar war. Ältere Publikationen deuteten darauf hin, dass die IE4-Genregion an der Transformation eukaryonter Zellen beteiligt sein könnte. Neuere Arbeiten zeigten, dass es sich bei diesem IE4-Transkript um ein metabolisch stabiles Intron handelt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte zunächst geklärt werden, ob die IE4-Genregion ein Protein kodiert. In der Folge sollten mit viralen Deletionsmutanten Hinweise auf die biologische Funktion des IE4-Bereichs erarbeitet werden. Durch Northern Blot Analysen und cDNA-Klonierungsexperimente konnte eine Reihe neuer Spleiß-Varianten der IE4-RNA identifiziert werden. Durch Sequenzanalysen wurde gezeigt, dass diese Transkripte keine längeren offenen Leserahmen enthalten. Zusammen mit bereits publizierten Erkenntnissen, kann aus diesen Ergebnissen mit hoher Wahrscheinlichkeit geschlossen werden, dass die IE4 Region nicht für ein Protein kodiert. Zur Analyse der biologischen Funktion der IE4-Region wurde das DNA-Genom des HCMV gezielt mutagenisiert. Eine phänotypische Analyse der entsprechenden Viren mittels Reportergen-Tests und quantitativer RealTime RT-PCR zeigte, dass einige der Mutanten eine verringerte Expression früher Gene aufwiesen, die mit einer Beeinträchtigung ihrer Replikationsfähigkeit in Fibroblastenkulturen korrelierte. Dabei war die Ausbildung eines Phänotyps jedoch von dem genetischen Hintergrund des verwendeten viralen Ausgangsstammes abhängig. Auffällig war, dass phänotypische Veränderungen nur bei solchen Mutanten sichtbar wurden, die auf der Grundlage des Laborstammes Ad169 des HCMV generiert worden waren. Die nachfolgende Analyse der Ausgangsstämme ergab deutliche Unterschiede in der IE-Genexpression. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen somit, dass die IE4-RNA mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht für ein Protein kodiert, aber bei limitierender Expression der essentiellen Regulatoren IE1 und IE2 die frühe lytische Genexpression stimuliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit stellen die Grundlage für nachfolgende Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Funktion der IE4-RNA im Rahmen der lytischen Infektion des HCMV dar.