Étude des propriétés antidiabétiques de Nigella sativa : sites d’action cellulaires et moléculaires

Nigella sativa ou cumin noir est une plante et un condiment populaires. Les graines de N. sativa sont très utilisées en médecine traditionnelle des pays nord africains pour le traitement du diabète. Cependant, les mécanismes d'actions cellulaires et moléculaires via lesquels cette plante exerce son effet euglycémiant restent encore mal compris. Le but de notre étude est d'examiner l’effet de N. sativa sur la sécrétion d’insuline, le transport de glucose et sur les voies de signalisation impliquées dans l’homéostasie et le métabolisme de glucose, en utilisant des essais biologiques sur des cultures cellulaires murines (cellules β pancréatiques βTC, myoblastes C2C12, hépatocytes H4IIE et adipocytes 3T3-L1) et des études in vivo chez le rat normoglycémique et le Meriones shawi (rongeur) diabétique. Chez les cellules β pancréatiques, N. sativa a augmenté leur prolifération ainsi que la sécrétion basale et gluco-stimulée de l’insuline. N. sativa a augmenté aussi la prise de glucose de 50% chez les cellules musculaires alors que chez les cellules graisseuses, la prise de glucose est augmentée jusqu’au 400%. Les expériences d’immunobuvardage de type western ont montré que N. sativa stimule les voies de signalisation de l’insuline (Akt et ERKs) et aussi celle insulino-indépendante (AMPK) chez les cellules C2C12. Par contre, chez les 3T3-L1, l’augmentation de transport de glucose est plutôt reliée à une activation de la voie de peroxisome proliferator activated receptor γ (PPARγ). Chez les hépatocytes, N. sativa augmente la stimulation des protéines intracellulaires Akt et 5' adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK). Cette activation de l’AMPK est associée à un effet découpleur de la plante au niveau de la phosphorylation oxydative mitochondriale. Par ailleurs, chez les Meriones shawi diabétiques, N. sativa diminue graduellement la glycémie à jeun ainsi que la réponse glycémique (AUC) à une charge orale en glucose (OGTT) pour atteindre des valeurs semblables aux animaux témoins après quatre semaines de traitement. Une amélioration du profile lipidique est observée autant chez les Meriones shawi diabétiques que chez les rats normaux. Au niveau moléculaire, N. sativa augmente le contenu musculaire en glucose transporter 4 Glut4 et la phosphorylation de l’acetyl-coenzyme A carboxylase ACC dans le muscle soléaire et le foie chez les Mériones shawi diabétiques. Par contre, chez le rat normal, on assiste à une stimulation des voies de signalisation de l’insuline (Akt et ERK) au niveau hépatique. En conclusion, nous avons confirmé l’action insulinotropique de N. sativa au niveau des cellules β pancréatiques et mis en évidence un effet proliférateur pouvant potentiellement s’avérer utile pour contrecarrer la perte de masse cellulaire observée chez les diabétiques. Notre étude a également mis en évidence pour la première fois que N. sativa exerce son activité antidiabétique par une combinaison d’effets insulino-mimétiques et insulino-sensibilisateurs directs permettant ainsi d’augmenter le transport de glucose des tissus périphériques. Cette action de N. sativa est liée à une stimulation des voies de signalisation intracellulaires insulinodépendantes et -indépendantes (AMPK) chez le muscle squelettique et le foie alors qu’elle passe par la voie des PPARγ au niveau du tissu adipeux. Finalement, l’étude in vivo vient confirmer l’effet antidiabétique de N. sativa. Notre apport novateur se situe au niveau de la démonstration que l’activité antidiabétique de N. sativa chez le Meriones shawi diabétique est la résultante des mêmes activités que celles déterminées au niveau de l’étude in vitro. En effet, N. sativa active la voie de l’AMPK, améliore la sensibilité à l’insuline et augmente l’insulinémie. Notre étude montre aussi que N. sativa possède une activité antilipidémiante. Ces résultats confirment le bien-fondé de l'utilisation ethnopharmacologique de N. sativa comme traitement du diabète et des perturbations du métabolisme lipidique qui y sont associées. De plus, les actions pléiotropiques de N. sativa en font un traitement alternatif ou complémentaire du diabète très prometteur qui encouragent à présent la tenue d’études cliniques de bonne qualité.

Polysaccharide-based Polyion Complex Micelles as New Delivery Systems for Hydrophilic Cationic Drugs

Les micelles polyioniques ont émergé comme des systèmes prometteurs de relargage de médicaments hydrophiles ioniques. Le but de cette étude était le développement des micelles polyioniques à base de dextrane pour la relargage de médicaments hydrophiles cationiques utilisant une nouvelle famille de copolymères bloc carboxymethyldextran-poly(éthylène glycol) (CMD-PEG). Quatre copolymères CMD-PEG ont été préparés dont deux copolymères identiques en termes de longueurs des blocs de CMD et de PEG mais différent en termes de densité de charges du bloc CMD; et deux autres copolymères dans lesquels les blocs chargés sont les mêmes mais dont les blocs de PEG sont différents. Les propriétés d’encapsulation des micelles CMD-PEG ont été évaluées avec différentes molécules cationiques: le diminazène (DIM), un médicament cationique modèle, le chlorhydrate de minocycline (MH), un analogue semi-synthétique de la tétracycline avec des propriétés neuro-protectives prometteuses et différents antibiotiques aminoglycosidiques. La cytotoxicité des copolymères CMD-PEG a été évaluée sur différentes lignées cellulaires en utilisant le test MTT et le test du Bleu Alamar. La formation de micelles des copolymères de CMD-PEG a été caractérisée par différentes techniques telles que la spectroscopie RMN 1H, la diffusion de la lumière dynamique (DLS) et la titration calorimétrique isotherme (ITC). Le taux de relargage des médicaments et l’activité pharmacologique des micelles contenant des médicaments ont aussi été évalués. Les copolymères CMD-PEG n'ont induit aucune cytotoxicité dans les hépatocytes humains et dans les cellules microgliales murines (N9) après 24 h incubation pour des concentrations allant jusqu’à 15 mg/mL. Les interactions électrostatiques entre les copolymères de CMD-PEG et les différentes drogues cationiques ont amorcé la formation de micelles polyioniques avec un coeur composé du complexe CMD-médicaments cationiques et une couronne composée de PEG. Les propriétés des micelles DIM/CMDPEG ont été fortement dépendantes du degré de carboxyméthylation du bloc CMD. Les micelles de CMD-PEG de degré de carboxyméthylation du bloc CMD ≥ 60 %, ont incorporé jusqu'à 64 % en poids de DIM et ont résisté à la désintégration induite par les sels et ceci jusqu'à 400 mM NaCl. Par contre, les micelles de CMD-PEG de degré de carboxyméthylation ~ 30% avaient une plus faible teneur en médicament (~ 40 % en poids de DIM) et se désagrégeaient à des concentrations en sel inférieures (∼ 100 mM NaCl). Le copolymère de CMD-PEG qui a montré les propriétés micellaires les plus satisfaisantes a été sélectionné comme système de livraison potentiel de chlorhydrate de minocycline (MH) et d’antibiotiques aminoglycosidiques. Les micelles CMD-PEG encapsulantes de MH ou d’aminoglycosides ont une petite taille (< 200 nm de diamètre), une forte capacité de chargement (≥ 50% en poids de médicaments) et une plus longue période de relargage de médicament. Ces micelles furent stables en solution aqueuse pendant un mois; après lyophilisation et en présence d'albumine sérique bovine. De plus, les micelles ont protégé MH contre sa dégradation en solutions aqueuses. Les micelles encapsulant les drogues ont maintenu les activités pharmacologiques de ces dernières. En outre, les micelles MH réduisent l’inflammation induite par les lipopolysaccharides dans les cellules microgliales murines (N9). Les micelles aminoglycosides ont été quant à elles capable de tuer une culture bactérienne test. Toutefois les micelles aminoglycosides/CMDPEG furent instables dans les conditions physiologiques. Les propriétés des micelles ont été considérablement améliorées par des modifications hydrophobiques de CMD-PEG. Ainsi, les micelles aminoglycosides/dodecyl-CMD-PEG ont montré une taille plus petite et une meilleure stabilité aux conditions physiologiques. Les résultats obtenus dans le cadre de cette étude montrent que CMD-PEG copolymères sont des systèmes prometteurs de relargage de médicaments cationiques.

Modulation du cytochrome P450 par l’insuffisance rénale chronique dans un modèle murin transgénique

L’insuffisance rénale chronique (IRC) est associée à une diminution de la clairance métabolique des médicaments résultant en partie de l’inhibition des cytochromes P450 (CYP450) et des enzymes de phase II, notamment la N-acétyltransférase 2 (NAT2), tel que démontré chez le rat. Nous avons précédemment démontré le rôle de l'hormone parathyroïdienne (PTH) dans la diminution des CYP450 hépatiques chez le rat souffrant d’IRC. Toutefois, l’étude des mécanismes sous-jacents pouvant être facilitée par l’utilisation de souris transgéniques, l’objectif de cette étude consiste à confirmer ces résultats dans un modèle murin. D’abord, afin de valider ce modèle expérimental, une IRC a été induite par néphrectomie subtotale 3/4 chez des souris C57BL/6, puis l’expression protéique et génique des CYP450 et de la Nat2 hépatiques a été étudiée. Les résultats indiquent que l’IRC induit effectivement une diminution d’expression de ces enzymes dans un modèle murin. Ensuite, des souris mutantes pour le gène codant la PTH (PTH-/-) et les souris correspondantes de type sauvage (PTH+/+) ont été néphrectomisées, puis l’expression protéique et génique des CYP450 hépatiques a été analysée. Si la PTH est responsable de la diminution du CYP450 en situation d’IRC, les souris PTH-/- atteintes d’IRC ne devraient présenter aucune baisse d’expression. Les résultats obtenus pour les souris PTH-/- ne peuvent être interprétés, puisque chez les souris PTH+/+ atteintes d'IRC, le CYP450 hépatique est inchangé par rapport aux souris PTH+/+ témoins. Des expériences supplémentaires seront requises afin de déterminer si la régulation à la baisse du CYP450 précédemment observée est contrecarrée par l’absence de PTH.

Évaluation de la toxicité du béryllium en fonction de la forme chimique et de la taille des particules

Le béryllium (Be) est un métal dont les propriétés physiques et mécaniques sont très recherchées, notamment dans les secteurs spatial, énergétique et électronique. Les principaux effets associés à l’exposition au Be sont la sensibilisation et la bérylliose chronique. La prévalence des effets associés au Be suggère que les risques sont, entre autres, fonction de sa spéciation. Par ailleurs, il semble que les particules fines constituent la fraction d’intérêt pour l’occurrence de tels effets. Dans cette étude nous avons vérifié l’hypothèse que la forme chimique et la taille des particules du Be jouent un rôle majeur au niveau de la toxicité et de l’apparition d’effets spécifiques à une exposition au Be. Les effets spécifiques se traduisent, entre autres, par la formation de granulomes inflammatoires pulmonaire, par la prolifération de lymphocytes TCD4+ et la production de cytokines de type Th1. Pour chacune des trois formes chimiques visées par la présente étude (le Be métallique ou Be, l’oxyde de Be ou BeO et l’alliage Be aluminium ou BeAl), la toxicité a été évaluée à la suite d’une exposition subchronique par inhalation oro-nasale à des particules fines (F) et totales (T). À cette fin, un modèle animal (souris) a été utilisé. Au total, 245 souris ont été utilisées. Elles ont été subdivisées en sept groupes de 35 souris. Un groupe a servi de contrôle, alors que chacun des six autres a été exposé soit à des particules fines soit à des particules totales, pour chacune des trois formes chimiques de Be (Be-F, Be-T, BeO-F, BeO-T, BeAl-F, BeAl-T). La durée d’exposition pour chacun des groupes s’est étendue sur 3 semaines, 5 jours par semaine, 6 heures par jour. Le niveau d’exposition des souris était de 250 µg/m3. L‘urine des souris a été recueillie avant et durant l’exposition. Au moment du sacrifice, plusieurs tissus (poumon, rate, foie et reins) ainsi que des échantillons de sang ont été prélevés puis immédiatement congelés jusqu’à leur analyse pour la détermination de leur teneur en Be. De plus, certains poumons et rates ont été analysés pour l’évaluation de la sensibilité immunologique et de l'inflammation pulmonaire. Cette étude d’exposition subchronique est la première étude murine qui étudie les effets toxiques de différentes tailles particulaires sur les changements pathologique et immunologique similaires à ceux observés chez l’humain. Cette étude a permis de constater qu’il existait des différences importantes au niveau de la toxicité du Be d’après les différentes tailles particulaires à l’étude. Ces différences seraient reliées au dépôt des particules de Be dans les voies respiratoires et également à la capacité des voies respiratoires à les éliminer totalement ou partiellement. La clairance respiratoire est fonction, notamment, du site de déposition et du caractère soluble ou non des particules. Cette recherche aura également permis de démontrer que les souris C3H/HeJ représentent un bon modèle pour l’étude des effets toxicologiques et immunologiques d’une exposition au Be. De plus, nos résultats démontrent que la sévérité des lésions pulmonaires causées par le Be, tel que l’infiltration interstitielle de lymphocytes et la formation de granulomes non-caséeux, augmente avec le temps de résidence pulmonaire des particules de Be. Combinés à d’autres résultats, nos résultats contribueront à guider les actions de prévention relativement à l’exposition au Be, incluant éventuellement la révision de la valeur limite de l’exposition et possiblement l’établissement de valeurs limites en fonction de la forme chimique et de la taille des particules.

Altérations métaboliques et nature des acides gras : implication dans la différenciation des cellules régénératives du tissu adipeux

Par la sécrétion d’adipokines, le tissu adipeux blanc viscéral présent chez des patients souffrant d’obésité promeut l’installation d’altérations métaboliques telles que l’intolérance au glucose, la résistance à l’insuline et le diabète de type 2. Les complications cardiovasculaires, en particulier l’athérosclérose, sont les principales causes de mortalité chez les patients atteints de diabète de type 2. Il a été démontré que la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux est composée de cellules régénératives dérivées du tissu adipeux (CRTA) et que ces cellules possèdent des caractéristiques des cellules progénitrices stromales (CPS). L’impact de l’intolérance au glucose et du diabète de type 2 sur les adipocytes sont assez bien documentés. Par contre, les conséquences de ces pathologies sur le comportement des CRTA n’ont pas été mesurées d’une façon approfondie. Plus particulièrement, l’impact de ces altérations métaboliques sur le potentiel de différenciation des CRTA en adipocytes et en cellules endothéliales n’a pas été étudié. Ce projet a pour but d’évaluer, dans un modèle murin, l’effet de ces altérations métaboliques sur l’équilibre de la différenciation in vitro des CRTA en adipocytes ou en cellules endothéliales. L’intolérance au glucose et le diabète de type 2 ont été induit chez les souris par la prise de deux diètes riches en acides gras de provenance végétale (DV) ou animale (DA). L’impact de l’origine des acides gras sur la différenciation des CRTA a également été étudié. Pour ce faire, une mise au point de la culture cellulaire des CRTA s’est avérée nécessaire et compte pour une partie de ces travaux de maîtrise. Nos travaux ont démontré en premier lieu, que le DMSO est un agent qui conserve la viabilité et les propriétés progénitrices des CRTA suite à leur congélation. De plus, parmi les matrices testées, le collagène s’est avéré être celle qui conserve le mieux les caractéristiques des progéniteurs et même, qui enrichie la population cellulaire ensemencée en cellules progénitrices. La densité cellulaire des cellules non-adipeuses du tissu adipeux s’avère être significativement plus élevée chez les souris du groupe de la DV comparativement aux souris contrôles. De plus, l’évaluation in vitro de la différenciation adipogénique démontre un potentiel de différenciation plus important pour les CRTA provenant des souris de la DV par rapport au groupe contrôle et à la DA. Cependant, la différenciation en cellules endothéliales est inhibée chez les CRTA de la DV, comparativement à un retard de ce processus pour la DA. Nos travaux suggèrent que le potentiel de différenciation adipogénique et endothéliale des CRTA est affecté par le statut métabolique des souris ainsi que par la nature de la diète. Ces résultats mettent en lumière pour la première fois l’importance d’évaluer le comportement des CRTA en fonction du statut métabolique du donneur, un paramètre pouvant avoir un impact majeur dans l’utilisation des CRTA autologues en thérapie cellulaire pour la réparation de tissus vasculaires chez des patients diabétiques.

Étude des voies d’internalisation de l’entérotoxine STb d’Escherichia coli dans des lignées cellulaires

L’entérotoxine stable à la chaleur STb est produite par les Escherichia coli entérotoxinogènes (ETEC). Son rôle dans la diarrhée post-sevrage porcine est établi. L’internalisation de STb a été observée dans des cellules épithéliales intestinales humaines et de rat. Cependant, le mécanisme d’internalisation n’est pas totalement compris, particulièrement dans le jéjunum porcin, la cible in vivo de STb. Par la cytométrie en flux, nous avons examiné l’internalisation de STb couplée à un marqueur fluorescent dans les cellules épithéliales intestinales porcines IPEC-J2 et les fibroblastes murins NIH3T3. Nos résultats révèlent que l’internalisation de STb est températureindépendante dans les IPEC-J2 tandis qu’elle est température-dépendante dans les NIH3T3, où la réorganisation de l’actine est aussi nécessaire. Toutefois, les niveaux de sulfatide, le récepteur de STb, sont semblables à la surface des deux lignées. Le sulfatide est internalisé à 37°C de façon similaire entre les deux types cellulaires. La rupture des lipid rafts, les microdomaines membranaires contenant le sulfatide, par la méthyl-βcyclodextrine ou la génistéine, n’affecte pas l’internalisation de STb dans les deux lignées. Notre étude indique que le mécanisme d’internalisation de STb est dépendant du type cellulaire. L’activité de la cellule hôte peut être requise ou non. Le récepteur de STb, le sulfatide, n’est pas directement impliqué dans ces mécanismes. L’internalisation activité cellulaire-dépendante suggère une endocytose, nécessitant la réorganisation de l’actine mais pas les lipid rafts. L’internalisation de STb est donc un processus complexe dépendant du type cellulaire, qu’il apparait plus relevant d’étudier dans des modèles cellulaires représentatifs des conditions in vivo.

Impact de HOXB4 sur les cellules B

La greffe de cellules souches hématopoïétiques autologue est une thérapie de plus en plus utilisée. Cependant, les traitements de chimiothérapie ou de radiothérapie intensifs peuvent affecter les cellules souches et diminuer le nombre de ces cellules pouvant être mobilisées à des fins de transplantation. Il serait donc très utile de pouvoir expandre ces cellules souches afin de s’assurer qu’elles soient en quantité suffisante pour procéder à la greffe. Or, il a été démontré que la protéine HOXB4 a la capacité d’expandre les cellules souches hématopoïétiques humaines et murines. Lors d’une greffe autologue, la moelle osseuse est cependant colonisée par des cellules malignes. Notre objectif était donc de s’assurer que la protéine HOXB4 expand les cellules souches hématopoïétiques normales mais n’expand pas les cellules « souches » leucémiques. De plus, comme des expériences précédentes ont démontré que chez des souris transplantées avec des cellules souches surexprimant HOXB4, la reconstitution du système hématopoïétique pouvait favoriser les cellules myéloïdes aux dépends des cellules lymphoïdes, nous avons aussi voulu déterminer l’impact de HOXB4 sur la différenciation des cellules progénitrices lymphoïdes normales. Pour ce faire, nous avons exposé des cellules humaines et murines à la protéine HOXB4 afin de comparer la prolifération des cellules B malignes à celle des cellules B normales. De plus, nous avons évalué l’impact de HOXB4 sur les cellules B à leurs différents stades de différenciation. Nos résultats démontrent que HOXB4 ne favorise pas l’expansion des cellules leucémiques. De plus, nous avons observé que les cellules lymphoïdes surexprimant la protéine HOXB4 ont un ralentissement dans leur processus de différenciation. Aussi, la surexpression de HOXB4 entraîne une diminution de la fréquence et du nombre de progéniteurs lymphoïdes normaux. Ces résultats démontrent donc que la protéine HOXB4 ne produit pas d’expansion des cellules malignes. De plus, elle confère un désavantage prolifératif aux cellules lymphoïdes.

Évaluation des désordres cardiovasculaires chez des souris bêta-thalassémiques

L’hémoglobine est une protéine contenue dans les globules rouges dont la principale fonction est le transport de l’oxygène. Chaque molécule d’hémoglobine est un tétramère constitué de deux paires de globines identiques de type α et β. La β-thalassémie est une maladie génétique hématopoïétique provenant de mutations du gène encodant l'hémoglobine. Ce désordre se caractérise par une diminution ou une absence totale de la synthèse de la chaîne β-globine résultant principalement en une anémie hémolytique sévère ainsi que des complications multisystémiques, telles que la splénomégalie, des déformations osseuses et une dysfonction hépatique et rénale. Actuellement, les transfusions sanguines chroniques représentent le traitement standard des patients β-thalassémiques. Cette thérapie nécessite l’administration conjointe d’un traitement chélateur de fer puisqu’elle entraîne une accumulation pathologique du fer, considéré à ce jour comme la source principale des complications cardiovasculaires de la β-thalassémie. Néanmoins, malgré le traitement efficace de la surcharge de fer transfusionnelle, l’insuffisance cardiaque demeure encore la principale cause de mortalité chez les patients atteints de β-thalassémie. Cette observation indique possiblement la présence d’un mécanisme complémentaire dans le développement de la physiopathologie cardiaque β-thalassémique. L’objectif du présent projet consistait donc à étudier les altérations cardiovasculaires de la β-thalassémie indépendamment de la surcharge de fer transfusionnelle. En utilisant un modèle murin non-transfusé de la β-thalassémie majeure, nous avons d’abord évalué in vivo, par méthode d’imagerie novatrice échographique à haute fréquence, les propriétés hémodynamiques vasculaires. Nos résultats d’index de Pourcelot ainsi que de résistance vasculaire périphérique totale ont démontré une perturbation de l’écoulement microcirculatoire chez les souris β-thalassémiques non-transfusées. Subséquemment, nous avons étudié la fonction endothéliale de régulation du tonus vasculaire de vaisseaux mésentériques isolés. Nos résultats ont révélé un dysfonctionnement de la réponse vasodilatatrice dépendante de l’endothélium chez les souris β-thalassémiques malgré une augmentation de l’expression de l’enzyme de synthèse du monoxyde d’azote ainsi qu’un remodelage de la carotide commune caractérisé par un épaississement de la paroi vasculaire. Finalement, notre étude échocardiographique de la fonction et la morphologie cardiaque a montré, chez les souris β-thalassémiques, le développement d’une hypertrophie et une dysfonction ventriculaire gauche en l’absence de transfusions sanguines chroniques ou de dépôts directs de fer dans le myocarde. L’ensemble des résultats présentés dans le cadre de cette thèse indique la présence d’une pathologie cardiovasculaire chez les souris β-thalassémiques non-transfusés. Nos travaux permettent de proposer un mécanisme de la pathophysiologie cardiovasculaire β-thalassémique, indépendant de la charge de fer transfusionnelle, impliquant les effets compensatoires d’une anémie chronique combinés à une vasculopathie complexe initiée par les érythrocytes endommagés et l’hémolyse intravasculaire.

Characterization of the mammalian homologs of the Drosophila Melanogaster Endocytic protein lethal (2) giant discs 1

Endocytose joue un rôle dans l'activation du récepteur Notch. Des mutations dans le gène drosophilien lethal giant discs (lgd), provoque une prolifération cellulaire en perturbant l'endocytose de Notch. Les orthologues murins mlgd1 et 2 peuvent sauver ce phénotype, démontrant une fonction conservée. Cependant, des publications récentes suggèrent que les orthologs humains de lgd (hgd1/2) sont nucléaires. Dans cette étude, il est démontré que chez la Drosophile, le mutant dlgd(08) provoque l'accumulation de Notch dans des vésicules et une surprolifération de neuroblastes . Ceci suggère que Notch est activé a l'intérieur des endosomes dans les neuroblastes. L'immunohistochimie de cellules Hela indique que hlgd1 et 2 ne sont pas nucléaires, mais associés à des strctures endosomales. Enfin, la baisse d'expression par shRNA des gènes murins mlgd1 et mlgd2 provoque une différenciation accélérée des cellules souches hématopoïétiques dans la lignée lymphopoïèse T et bloque la transition DN3 / CD4+CD8+, suggérant une suractivation de Notch.

Modulation des réactions alloimmunitaires par les cytokines maîtresses IFN-γ et TGF-β

L’injection de cellules immunologiquement compétentes à un hôte histo-incompatible amène une réaction qui peut se traduire par la maladie du greffon-contre-l’hôte (GVHD). La GVHD demeure une barrière importante à une utilisation plus répandue de la greffe allogénique de cellules hématopoïétiques (AHCT), pourtant un traitement efficace pour traiter de nombreuses maladies. Une meilleure compréhension des mécanismes qui sous-tendent cette pathologie pourrait en faciliter le traitement et la prévention. L’Interféron-gamma (IFN-γ) et le Transforming Growth Factor-béta (TGF-β) sont deux cytokines maîtresses de l’immunité impliquées dans la fonction et l’homéostasie des cellules greffées. Nous démontrons chez la souris que l’IFN-γ limite la reconstitution lympho-hématopoïétique de façon dose-dépendante en mobilisant des mécanismes d’apoptose et en inhibant la prolifération cellulaire. Le TGF-β est quant à lui généralement connu comme un immunosuppresseur qui contrôle l’immunité en utilisant plusieurs voies de signalisation. Le rôle relatif de ces voies en AHCT est inconnu. Nous avons étudié une de ces voies en greffant des cellules provenant de donneurs déficients pour le gène SMAD3 (SMAD3-KO), un médiateur central de la voie canonique du TGF-β, à des souris histo-incompatibles. Bien que l’absence de SMAD3 ne cause aucune maladie chez nos souris donneuses, l’injection de cellules SMAD3-KO amène une GVHD du colon sévère chez le receveur. Cette atteinte est caractérisée par une différenciation Th1 et une infiltration massive de granulocytes témoignant d’un rôle central de SMAD3 dans la physiologie des lymphocytes T CD4 et des cellules myéloïdes. Nous avons focalisé ensuite nos efforts sur le rôle de SMAD3 chez les lymphocytes T CD4 en sachant que SMAD3 était actif chez les lymphocytes T CD4 tolérants. Nous avons découvert que SMAD3 était rapidement inactivé après une activation des cellules T, suggérant que l’inactivation de SMAD3 était fonctionnellement importante pour briser l’état de tolérance. Des études de micro-puces d’ADNc nous ont montré que SMAD3 contrôlait en effet l’expression de nombreux transcrits de gènes connus comme étant reliés à la tolérance et/ou à des processus biologiques dont les rôles dans le maintien de la tolérance sont plausibles.

Importance du stress oxydant dans le diabète secondaire à la fibrose kystique

Introduction : La fibrose kystique (FK) est une maladie génétique mortelle qui touche principalement les poumons et l’appareil digestif. Elle est causée par des mutations sur le gène codant la protéine du CFTR, un canal chlore exprimé à la surface des organes à sécrétions exocrines. Les fonctions principales du CFTR sont les suivantes: 1) la régulation de l’homéostasie ionique des sécrétions; 2) le maintien de la fluidité des sécrétions et; 3) le transport du glutathion. Le dysfonctionnement de la protéine du CFTR rend les sécrétions visqueuses et épaisses, avec des phénomènes obstructifs qui sont responsables de l’apparition de fibrose au sein des divers organes. Dans le poumon, l’accumulation du mucus épais rend difficile l’élimination des bactéries inhalées, ces dernières établissent alors des cycles d’infection qui endommagent les tissus pulmonaires à travers des processus inflammatoires. Dans le tube digestif, le mucus épais entrave l’absorption d’une quantité suffisante d’éléments nutritifs incluant les principaux antioxydants. L’infection et l’inflammation des poumons favorisent l’apparition d’un stress oxydant qui détruit davantage le tissu pulmonaire. Le déficit en glutathion, probablement lié au dysfonctionnement de la proteine du CFTR, et la malabsorption des antioxydants favorisent l’augmentation du stress oxydant. Une augmentation du stress oxydant a été démontrée au cours du diabète et les produits dérivés du stress oxydant ont été mis en évidence dans la pathogenèse des complications associées au diabète. Une augmentation du stress oxydant a également été montrée durant la FK, mais sans pour autant expliquer la survenue du diabète secondaire à la FK dont la prévalence augmente sans cesse. Objectifs : Notre étude consiste à évaluer l’impact du stress oxydant dans les anomalies du métabolisme du glucose durant la FK, et à étudier son rôle dans les mécanismes de sécrétion d’insuline induite par le glucose. Pour ce faire, nous avons déterminé l’impact de la peroxydation lipidique sur la tolérance au glucose et la défense antioxydante globale, in vivo, chez des patients FK présentant une altération du métabolisme du glucose. De plus, nous avons évalué le rôle du stress oxydatif sur la synthèse et la sécrétion d’insuline, in vitro, dans les cellules pancréatiques βTC-tet. Résultats : Dans l’étude in vivo, nous avons démontré que l’intolérance au glucose et le diabète étaient associés à une augmentation de la peroxydation lipidique, traduite par la hausse des niveaux sanguins de 4-hydroxynonenal lié aux protéines (HNE-P). La défense antioxydante évaluée par la mesure du glutathion sanguin démontre que les niveaux de glutathion oxydé restent également élevés avec l’intolérance au glucose. Dans l’étude in vitro, nos résultats ont mis en évidence que l’exposition de la cellule βTC-tet au stress oxydant: 1) induit un processus de peroxydation lipidique; 2) augmente la sécrétion basale d’insuline; 3) diminue la réponse de la sécrétion d’insuline induite par le glucose; et 4) n’affecte que légèrement la synthèse de novo de l’insuline. Nous avons aussi démontré que les cellules pancréatiques βTC-tet résistaient au stress oxydant en augmentant leur synthèse en glutathion tandis que la présence d’un antioxydant exogène pouvait restaurer la fonction sécrétoire de ces cellules. Conclusion : Le stress oxydant affecte le fonctionnement de la cellule pancréatique β de plusieurs manières : 1) il inhibe le métabolisme du glucose dont les dérivés sont nécessaires à la sécrétion d’insuline; 2) il active la voie de signalisation impliquant les gènes pro-inflammatoires et; 3) il affecte l’intégrité membranaire en induisant le processus de peroxydation lipidique.

Ninjurin-1 est une molécule d'adhérence de la barrière hémato-encéphalique impliquée dans le recrutement de monocytes au sein du système nerveux central

La sclérose en plaques (SEP) est caractérisée par des infiltrations périvasculaires de cellules immunitaires et par de la démyélinisation au sein du système nerveux central (SNC). Ces deux paramètres de la maladie sont associés à la fragilisation de la barrière hémato-encéphalique (BHE). En ce sens, le recrutement des cellules présentatrices d’antigène (CPA) myéloïdes, telles que les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques, dans le SNC à travers la BHE, est une étape cruciale dans l’initiation et la persistance de l’inflammation cérébrale. Nerve injury-induced protein (Ninjurin)-1 est une nouvelle molécule d’adhérence qui médie une interaction de type homophilique et dont l’expression sur l’endothélium vasculaire de la BHE humaine fut identifiée grâce à une analyse protéomique des protéines associées à la BHE. Les résultats présentés dans ce mémoire montrent que l’expression de Ninjurin-1 augmente dans un contexte inflammatoire dans les cultures primaires de cellules endothéliales de la BHE (CE-BHE) et sur les CPA myéloïdes humaines ex vivo et générées in vitro. De plus, les CPA infiltrantes retrouvées dans les lésions cérébrales de patients atteints de SEP et dans le SNC des souris atteintes d’encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE), le modèle murin de la SEP, expriment de hauts niveaux de Ninjurin-1. À l’aide du modèle in vitro de la BHE, la neutralisation de Ninjurin-1 restreint spécifiquement la migration des monocytes à travers les CE-BHE sans affecter le recrutement des lymphocytes, ni la perméabilité des CE-BHE. Enfin, les souris atteintes d’EAE et traitées avec un peptide bloquant dirigé contre Ninjurin-1 présentent une maladie moins sévère ainsi qu’une diminution des CPA infiltrant le SNC et ce comparé au groupe contrôle. Ces résultats suggèrent que Ninjurin-1 est une molécule d’adhérence de la BHE impliquée dans le recrutement de CPA myéloïdes au sein du SNC et qu’elle peut être considérée comme une cible thérapeutique potentielle en SEP.

Mécanisme d’action du PBI-1402 impliqué dans l’expansion des progéniteurs érythroïdes humains et murins

Une des complications importantes d’un traitement intensif de chimio/radio-thérapie est l’aplasie de la moelle osseuse qui peut persister longtemps même après une greffe de cellules souches. Le PBI-1402 est un petit lipide qui a été associé à la diminution de l’apoptose des neutrophiles induite par des agents cytotoxiques. Nos travaux ont démontré que la culture in vitro de progéniteurs hématopoiétiques humains en présence de PBI-1402 induit une augmentation significative du nombre de progéniteurs érythroides (PEryth) (p<0,05). En évaluant la sensibilité des PEryth à l’érythropoietine (Epo), nous avons démontré que le PBI-1402 n’a pas d’effet sensibilisateur et que les cellules répondent de façon similaire aux cellules contrôles. De plus, la combinaison de l’Epo et du « stem cell factor » avec le PBI-1402 permet de prolonger et d’augmenter l’activation d’ERK1/2 (p<0,05), un important signal mitogène. Cet effet est associé à une inhibition de l’activation de la phosphatase MKP-1 dans les cellules exposées au PBI-1402. Nous démontrons aussi la capacité du PBI-1402 à amplifier la prolifération des PEryth et sa capacité à réduire la durée et l’intensité de l’anémie dans un modèle in vivo murin. Des souris ayant reçu une dose létale d’irradiation et subi une transplantation syngénique de moelle osseuse, ont été traitées oralement avec le PBI-1402 pendant 14 jours. Ces souris démontrent une réduction significative de l’anémie post-transplantation versus les souris contrôle (p<0,05). De plus, la moelle osseuse des souris traitées au PBI-1402 présente un nombre de BFU-E et CFU-E plus élevé comparativement au contrôle. Ces résultats démontrent donc le potentiel du PBI-1402 à réduire l’anémie post-transplantation et accélérer la reconstitution érythroïde.

Pathogenèse de l’hépatite autoimmune : influence des gènes, du sexe, de l’âge et de l’environnement

L’hépatite autoimmune (HAI) résulte d’une perte de tolérance du système immunitaire envers des antigènes de l’hépatocyte. Elle peut se présenter sous forme d’hépatite aiguë, parfois fulminante, ou comme une maladie chronique menant progressivement à une cirrhose hépatique. En absence de traitement, cette maladie est fatale. La pathogenèse de l’HAI et les mécanismes responsables de sa progression restent inconnus à ce jour. L’objectif global de ce projet est d’examiner les facteurs prédisposants et les mécanismes immunologiques responsables de l’apparition et de la progression de l’HAI. Pour permettre l’étude de la pathogenèse de l’HAI, nous avons développé un modèle murin expérimental d’hépatite autoimmune de type 2. Celui-ci est basé sur la xénoimmunisation de souris C57BL/6 avec les deux antigènes ciblés dans l’HAI de type 2 chez l’homme (CYP2D6 et FTCD). Par mimétisme moléculaire, le système immunitaire de ces souris réagit contre les protéines murines homologues et une HAI s’ensuit. Ce modèle expérimental présente la plupart des caractéristiques histologiques, biochimiques et sérologiques d’une HAI de type 2. Les souris développent une inflammation autoimmune chronique avec présence d’hépatite d’interface et d’infiltrations intralobulaires, un infiltrat composé majoritairement de lymphocytes T CD4+ mais aussi de lymphocytes T CD8+ et B, d’une élévation des ALT sériques, des niveaux d’immunoglobulines G circulantes augmentés ainsi que d’autoanticorps anti-LKM1 et anti-LC1. L’étude de l’influence du bagage génétique a permis de définir l’importance relative des gènes du CMH et des gènes non-CMH sur le développement d’une HAI. Les gènes du locus CMH sont essentiels mais insuffisants pour mener au développement d’une HAI et donc, la susceptibilité génétique à l’HAI est comme chez l’homme, multigénique. Les patients atteints d’HAI de type 2 sont généralement des jeunes filles. L’étude des influences de l’âge et du sexe dans ce modèle a permis de montrer que les souris femelles avant et au début de leur maturité sexuelle sont plus susceptibles au développement d’une HAI de type 2. De plus, les femelles ont un nombre réduit de lymphocytes T régulateurs, ce qui leur confère une susceptibilité accrue comparé aux mâles. L’ensemble de ces travaux nous a conduits à proposer un mécanisme où le développement d’une HAI chez les femelles d’un âge particulier résulterait de l’activation de cellules T CD4+ autoréactives ayant échappé aux mécanismes de tolérance centrale, via un mécanisme de mimétisme moléculaire avec un antigène exogène. En présence d’une tolérance périphérique réduite due à un faible nombre de cellules T régulatrices, les cellules T autoréactives proliféreraient et activeraient des cellules B autoréactives entraînant la sécrétion d’autoanticorps. L’activation subséquente de cellules T CD8+ cytotoxiques spécifiques amènerait la lyse des hépatocytes et la relâche d’autoantigènes permettant la perpétuation de l’autoimmunité.

Une nouvelle stratégie de traitement de la maladie cœliaque basée sur les polymères séquestrants

La maladie cœliaque ou sprue cœliaque est une intolérance au gluten. Il s’agit d’une maladie inflammatoire de l’intestin liée à l’ingestion de gluten chez des personnes génétiquement susceptibles. Ce désordre présente une forte prévalence puisqu’il touche 1 % de la population mondiale. En l’état actuel des choses, il n’existe aucun outil pharmacologique pour traiter ou pallier à cette maladie. Cependant, grâce aux avancées dans la compréhension de sa pathogenèse, de nouvelles cibles thérapeutiques ont été identifiées. À l’heure actuelle, le seul traitement efficace consiste à suspendre la consommation de l’agent pathogène, à savoir le gluten. Le gluten est un ensemble de protéines de stockage des céréales contenu dans le blé, l’orge et le seigle. Le gluten du blé se subdivise en gluténines et gliadines. Ce sont ces dernières qui semblent les plus impliquées dans la maladie cœliaque. Les gliadines et ses protéines apparentées (i.e. sécalines et hordéines, respectivement dans le seigle et l’orge) sont riches en prolines et en glutamines, les rendant résistantes à la dégradation par les enzymes digestives et celles de la bordure en brosse. Les peptides résultant de cette digestion incomplète peuvent induire des réponses immunitaires acquises et innées. L’objectif principal de cette thèse était de tester un nouveau traitement d’appoint de la maladie cœliaque utile lors de voyages ou d’évènements ponctuels. Dans les années 80, une observation italienne montra l’inhibition de certains effets induits par des gliadines digérées sur des cultures cellulaires grâce à la co-incubation en présence de mannane: un polyoside naturel composé de mannoses. Malheureusement, ce traitement n’était pas applicable in vivo à cause de la dégradation par les enzymes du tractus gastro-intestinales du polymère, de par sa nature osidique. Les polymères de synthèse, grâce à la diversité et au contrôle de leurs propriétés physico-chimiques, se révèlent être une alternative attrayante à ce polymère naturel. L’objectif de cette recherche était d’obtenir un polymère liant la gliadine, capable d’interférer dans la genèse de la maladie au niveau du tube digestif, afin d’abolir les effets délétères induits par la protéine. Tout d’abord, des copolymères de type poly (hydroxyéthylméthacrylate)-co-(styrène sulfonate) (P(HEMA-co-SS)) ont été synthétisés par polymérisation radicalaire contrôlée par transfert d’atome (ATRP). Une petite bibliothèque de polymères a été préparée en faisant varier la masse molaire, ainsi que les proportions de chacun des monomères. Ces polymères ont ensuite été testés quant à leur capacité de complexer la gliadine aux pH stomacal et intestinal et les meilleurs candidats ont été retenus pour des essais cellulaires. Les travaux ont permis de montrer que le copolymère P(HEMA-co-SS) (45:55 mol%, 40 kDa) permettait une séquestration sélective de la gliadine et qu’il abolissait les effets induits par la gliadine sur différents types cellulaires. De plus, ce composé interférait avec la digestion de la gliadine, suggérant une diminution de peptides immunogènes impliqués dans la maladie. Ce candidat a été testé in vivo, sur un modèle murin sensible au gluten, quant à son efficacité vis-à-vis de la gliadine pure et d’un mélange contenant du gluten avec d’autres composants alimentaires. Le P(HEMA-co-SS) a permis de diminuer les effets sur les paramètres de perméabilité et d’inflammation, ainsi que de moduler la réponse immunitaire engendrée par l’administration de gliadine et celle du gluten. Des études de toxicité et de biodistribution en administration aigüe et chronique ont été réalisées afin de démontrer que ce dernier était bien toléré et peu absorbé suite à son administration par la voie orale. Enfin des études sur des échantillons de tissus de patients souffrants de maladie cœliaque ont montré un bénéfice therapeutique du polymère. L’ensemble des travaux présentés dans cette thèse a permis de mettre en évidence le potentiel thérapeutique du P(HEMA-co-SS) pour prévenir les désordres reliés à l’ingestion de gluten, indiquant que ce type de polymère pourrait être exploité dans un avenir proche.