Japanese Encephalitis Virus Utilizes the Canonical Pathway To Activate NF-kappa B but It Utilizes the Type I Interferon Pathway To Induce Major Histocompatibility Complex Class I Expression in Mouse Embryonic Fibroblasts

Flaviviruses have been shown to induce cell surface expression of major histocompatibility complex class I (MHC-I) through the activation of NF-kappa B. Using IKK1(-/-), IKK2(-/-), NEMO-/-, and IKK1-/- IKK2-/- double mutant as well as p50(-/-) RelA(-/-) cRel(-/-) triple mutant mouse embryonic fibroblasts infected with Japanese encephalitis virus (JEV), we show that this flavivirus utilizes the canonical pathway to activate NF-kappa B in an IKK2- and NEMO-, but not IKK1-, dependent manner. NF-kappa B DNA binding activity induced upon virus infection was shown to be composed of RelA: p50 dimers in these fibroblasts. Type I interferon (IFN) production was significantly decreased but not completely abolished upon virus infection in cells defective in NF-kappa B activation. In contrast, induction of classical MHC-I (class 1a) genes and their cell surface expression remained unaffected in these NF-kappa B-defective cells. However, MHC-I induction was impaired in IFNAR(-/-) cells that lack the alpha/beta IFN receptor, indicating a dominant role of type I IFNs but not NF-kappa B for the induction of MHC-I molecules by Japanese encephalitis virus. Our further analysis revealed that the residual type I IFN signaling in NF-kappa B-deficient cells is sufficient to drive MHC-I gene expression upon virus infection in mouse embryonic fibroblasts. However, NF-kappa B could indirectly regulate MHC-I expression, since JEV-induced type I IFN expression was found to be critically dependent on it.

Mapping of B-cell epitopes of hemagglutinin protein of rinderpest virus

Monoclonal antibodies (mAbs) against secreted hemagglutinin (H) protein of rinderpest virus (RPV) expressed by a recombinant baculovirus were generated to characterize the antigenic sites on H protein and regions of functional significance. Three of the mAbs displayed hemagglutination inhibition activity and these mAbs were unable to neutralize virus infectivity. Western immunoblot analysis of overlapping deletion mutants indicated that three mAbs recognize antigenic regions at the extreme carboxy terminus (between amino acids 569 and 609) and the fourth mAb between amino acids 512 and 568. Using synthetic peptides, aa 569-577 and 575-583 were identified as the epitopes for E2G4 and D2F4, respectively. The epitopic domains of A12A9 and E2B6 mAbs were mapped to regions encompassing aa 527-554 and 588-609. Two epitopes spanning the extreme carboxy terminal region of aa 573 to 587 and 588 to 609 were shown to be immunodominant employing a competitive ELISA with polyclonal sera form vaccinated cattle. The D2F4 mAb which recognizes a unique epitope on RPV-H is not present on the closely related peste des petits ruminant virus FIN protein and this mAb could serve as a tool in the seromonitoring program after rinderpest vaccination. (C) 2002 Elsevier Science (USA).

Estrategia para bloquear la entrada del virus de la Hepatitis C (HCV) en hepatocitos primarios

En esta memoria se presenta una propuesta para desarrollar un proyecto de investigación que permita establecer la eficacia de una estrategia original para evitar la entrada del virus de la hepatitis C (HCV) en las células hepáticas. Se propone la utilización combinada de dos anticuerpos contra dos factores esenciales para la entrada HCV en las células hepáticas, como son las moléculas CD81 y SR-BI. La eficacia para reducir la capacidad infectiva del HCV de bloquear individualmente cada una de estas moléculas ha sido previamente demostrada, así que en este proyecto proponemos que un uso combinado de moléculas que bloqueen ambos receptores permitiría avanzar en la búsqueda de vacunas que eviten eficazmente la infección del HCV.

Desenvolvimento de técnica de análise de imagens digitais para avaliação do estágio da fibrose em biópsias hepáticas de pacientes portadores de hepatite crônica por vírus da hepatite B e C

As hepatites crônicas por vírus são as mais frequentes, destacando-se os vírus das hepatites B (VHB) e C (VHC). O estudo anatomopatológico da biópsia hepática é considerado o padrão ouro para avaliar com precisão a distorção arquitetural e o grau de fibrose do parênquima do fígado, importantes fatores prognósticos para os pacientes portadores de hepatites crônicas virais. Na avaliação histopatológica atual, em adição aos relatos subjetivos das alterações histológicas, escores semiquantitativos que correlacionam achados morfológicos com graus numéricos são usados, tais como os reconhecidos escores de Ishak e METAVIR. Entretanto, em todos estes sistemas há a desvantagem da subjetividade do examinador e da incorporação de alterações categóricas, sem referências às mudanças quantitativas do colágeno hepático. Técnicas de análise de imagens digitais (AID) que fornecem quantificação objetiva dos graus de fibrose em amostras histológicas têm sido desenvolvidas. Todavia, o alto custo e dificuldade ao acesso das tecnologias descritas restringem seu uso a poucos centros especializados. Este estudo visa o desenvolvimento de uma técnica de custo acessível para a análise de imagens digitais da fibrose hepática em hepatites crônicas virais. Foram estudadas 304 biópsias de pacientes com hepatite crônica por vírus B e C, obtidas através de agulhas Menghini. Todas as amostras tinham pelo menos 15 mm de comprimento ou cinco espaços-porta completos e foram coradas pelo método Tricrômico de Masson. O estadiamento foi feito por um único hepatopatologista experiente, sem o conhecimento dos dados clínicos dos pacientes. Os escores de Ishak e METAVIR foram aplicados. As imagens microscópicas foram digitalizadas. Os índices de fibrose foram determinados de forma automatizada, em técnica desenvolvida no programa Adobe Photoshop. Para o escore de Ishak, observamos os seguintes índices de Fibrose (IF) médios: 0,8% 0,0 (estágio 0), 2.4% 0,6 (estágio 1), 4,7% 1,6 (estágio 2), 7,4% 1,4 (estágio 3), 14,9% 3,7 (estágio 4), 23,4% 2,9 (estágio 5) e 34,5% 1,5 (estágio 6). Para a classificação METAVIR: 0,8% 0,1 (estágio F0), 3,8% 1,8 (estágio F1), 7,4% 1,4 (estágio F2), 20,4% 5,2 (estágio F3) e 34,5% 1,5 (estágio F4). Observamos uma excelente correlação entre os índices de fibrose da AID e os escores de Ishak (r=0,94; p<0,001) e METAVIR (r=0,92; p<0,001). Em relação à indicação de tratamento antiviral, foi observado IF médio de 16,4%. Em relação ao diagnóstico de cirrose, foi observado IF médio de 26,9%, para o escore de Ishak, e 34,5% para a classificação METAVIR. A reprodutibilidade intra-observador foi excelente. Este novo método de análise de imagens digitais para a quantificação de fibrose hepática tem custo acessível e foi desenvolvido com tecnologia que está disponível em todo o mundo, permitindo identificar com precisão todos os estágios de fibrose, com excelente reprodutibilidade intra-observador.

Expressional induction of Paralichthys olivaceus cathepsin B gene in response to virus, poly I:C and lipopolysaccharide

Cathepsin B is a lysosomal cysteine protease of the papain-like enzyme family with multiple biological functions. In this study, Paralichthys olivaceus cathepsin B (PoCatB) cDNA was isolated from flounder embryonic cells (FEC) treated with UV-inactivated grass carp hemorrhage virus (GCHV) and subsequently identified as a vitally induced gene. The full length cDNA of PoCatB is 1801 bp encoding 330-amino acids. The deduced protein has high homology to all known cathepsin B proteins, containing an N-terminal signal peptide, cysteine protease active sites, the occluding loop segment and a glycosylation site, all of which are conserved in the cathepsin B family. PoCatB transcription of FEC cells could be induced by turbot (Scophthalmus maximus) rhabdovirus (SMRV), UV-inactivated SMRV, UV-inactivated GCHV, poly I:C or lipopolysaccharide (LPS), and SMRV or poly I:C was revealed to be most effective among the five inducers. In normal flounder, PoCatB mRNA was detectable in all examined tissues. Moreover, SMRV infection could result in significant upregulation of PoCatB mRNA, predominantly in spleen, head kidney, posterior kidney, intestine, gill and muscle with 18.2,10.9, 24.7,12, 31.5 and 18 fold increases at 72 h post-infection respectively. These results provided the first evidence for the transcriptional induction of cathepsin B in fish by virus and LPS, indicating existence of a novel function in viral defense. (C) 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Neutralization activity in a geographically diverse East London cohort of human immunodeficiency virus type 1-infected patients: clade C infection results in a stronger and broader humoral immune response than clade B infection.

The array of human immunodeficiency virus (HIV) subtypes encountered in East London, an area long associated with migration, is unusually heterogeneous, reflecting the diverse geographical origins of the population. In this study it was shown that viral subtypes or clades infecting a sample of HIV type 1 (HIV-1)-positive individuals in East London reflect the global pandemic. The authors studied the humoral response in 210 treatment-naïve chronically HIV-1-infected (>1 year) adult subjects against a panel of 12 viruses from six different clades. Plasmas from individuals infected with clade C, but also plasmas from clade A, and to a lesser degree clade CRF02_AG and CRF01_AE, were significantly more potent at neutralizing the tested viruses compared with plasmas from individuals infected with clade B. The difference in humoral robustness between clade C- and B-infected patients was confirmed in titration studies with an extended panel of clade B and C viruses. These results support the approach to develop an HIV-1 vaccine that includes clade C or A envelope protein (Env) immunogens for the induction of a potent neutralizing humoral response.

Preactivation of B lymphocytes does not enhance mouse mammary tumor virus infection.

We investigated whether mouse mammary tumor virus (MMTV) favors preactivated or naive B cells as targets for efficient infection. We have demonstrated previously that MMTV activates B cells upon infection. Here, we show that polyclonal activation of B cells leads instead to lower infection levels and attenuated superantigen-specific T-cell responses in vivo. This indicates that naive small resting B cells are the major targets of MMTV infection and that the activation induced by MMTV is sufficient to allow efficient infection.

Mécanismes de défense immunitaire innée impliqués dans l’hépatite aiguë induite par le virus de l’hépatite murine de type 3

Le virus de l’hépatite murine de type 3 (MHV3) est un excellent modèle animal pour l’étude des différents désordres immunologiques lors d’infections virales. L’hépatite aiguë fulminante induite par ce virus chez la souris susceptible C57BL/6 se caractérise par la présence de plusieurs foyers nécrotiques et inflammatoires dans le foie associée à une immunodéficience en lymphocytes B et T, tuant les souris entre 3 et 5 jours post-infection. L’évolution rapide de cette maladie virale suggère un débalancement dans les mécanismes de l’immunité naturelle sous le contrôle des cellules NK et NK-T et un bris de l’équilibre entre la tolérance hépatique et la réponse inflammatoire. Afin d’élucider les rôles respectifs des différents mécanismes de la défense innée impliqués dans le développement de l’hépatite aiguë, des infections in vivo ont été réalisées chez des souris C57BL/6 avec la souche pathogène L2-MHV3 ou avec des variants du virus MHV3. Ces derniers possèdent des tropismes différents pour les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques et les cellules de Kupffer, tels que les virus faiblement atténué 51.6-MHV3, fortement atténué CL12-MHV3 et non pathogène YAC-MHV3. Ces études in vivo ont montré une diminution des cellules NK spléniques et myéloïdes suite à une infection avec le virus MHV3. Cette chute en cellules NK spléniques reflète un recrutement de ces cellules au niveau du foie. Par contre, les cellules NK se sont avérées permissives à la réplication virale entraînant un processus d’apoptose suite à la formation de syncétia induits par le virus. Les niveaux de recrutement et d’apoptose des cellules NK et NK-T dans le foie reflètent la pathogénicité des variants MHV3 durant les trois premiers jours de l’infection virale bien que les cellules NK recrutées au niveau du foie maintiennent leur activité cytotoxique. L’ajout des IL-12 et IL-18, qui sont normalement diminués lors de l’hépatite aiguë, provoque une production synergique d’IFN-g par les cellules NK, résultant d’une interaction entre l’activation de la voie p38 MAPK et la réplication virale. Par ailleurs, le récepteur viral CEACAM1a (carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 1a) serait essentiel à cette synergie, mais exercerait aussi une action inhibitrice dans la production de l’IFN-g. D’autre part, les niveaux de production des cytokines immunosuppressives IL-10, TGF-b et PGE2, impliquées dans la tolérance hépatique et particulièrement produites par les cellules de Kupffer et les cellules endothéliales sinusoïdales, sont en relation inverse avec le degré de pathogénicité des variants du virus MHV3. Finalement, le virus pathogène L2-MHV3 déclenche la production de cytokines inflammatoires par les macrophages, tels que l’IL-6 et le TNF-a. L’induction de ces cytokines par les macrophages serait indépendante de la présence de la molécule CEACAM1a. Cette stimulation est plutôt reliée à la fixation des particules virales sur des récepteurs TLR2, en association avec les régions riches en héparanes sulfates. Tous ces résultats mettent en évidence de nouveaux mécanismes par lesquels le virus MHV3 peut diminuer l’efficacité des mécanismes de l’immunité naturelle sous le contrôle des cellules NK et NK-T intrahépatiques, suite à une stimulation de l’inflammation résultant du bris de la tolérance hépatique.

Evaluación del efecto del óxido nítrico (No) en la regulación negativa de la expresión del Virus de la hepatitis C (Vhc) inducida por ácido acetil salicílico (Aas).

Tesis (Doctor en Ciencias con Orientación Terminal en Biología Molecular e Ingeniería Genética) UANL, 2011.

Étude du dysfonctionnement du compartiment des cellules B chez des patients à différents stades d’infection par le virus d’immunodéficience humaine (VIH)

Les anomalies phénotypiques et fonctionnelles des lymphocytes B (LB) sont typiques d'une infection au VIH et se traduisent principalement par une activation polyclonale, une perte de la mémoire immunitaire ainsi qu'une réponse humorale déficiente et des phénomènes auto-immunitaires souvent précurseurs de lymphomes B. Ces anomalies se retrouvent principalement chez les patients lors de la phase chronique de la maladie et semblent être reliées en partie au niveau de la charge virale ainsi qu'à un compartiment de lymphocytes T CD4+ altéré. Cependant, quoique controversé, des éléments d’activation polyclonale ont également été observés chez les non-progresseurs à long terme (LTNPs) qui présentent une charge virale faible et un compartiment T CD4+ semblable aux individus séronégatifs. Ainsi, les objectifs principaux de cette étude sont 1) d’établir une chronologie des anomalies du compartiment des cellules B chez des individus infectés par le VIH qui ont une progression différente de la maladie (PHI normaux, rapides, sains et LTNP). 2) corréler les niveaux sériques du stimulateur de lymphocytes B (BLyS), un facteur de croissance des cellules B, avec les phénotypes observés chez ces mêmes patients. L’hyperglobulinémie, les niveaux sériques de BLyS et d’auto-anticorps ont été mesuré longitudinalement chez une cohorte d’individus en primo-infection (PHI) avec des progressions différentes de la maladie (rapides et normaux), LTNP et sujets sains. Nos résultats démontrent que l’activation polyclonale des LB survient indépendamment de la vitesse de progression et persiste chez les LTNP ou malgré une thérapie antirétrovirale efficace chez les progresseurs rapides. Des niveaux élevés de BLyS dans le sérum des progresseurs rapides corrèlent avec des fréquences altérées de monocytes et cellules dendritiques, suggérant un rôle de celles-ci dans l’atteinte du compartiment des cellules B.

Estudio de la participación de la superóxido dismutasa (SOD) en la regulación de la replicación del virus de la hepatitis C (VHC).

Tesis (Doctor en Ciencias con orientación en Biología Molecular e Ingeniería Genética) UANL, 2014.

L'impact des cellules dendritiques dans la dérégulation des cellules B dans un contexte d'infection au virus d'immunodéficience humaine

Les cellules dendritiques (DC) sont parmi les premières cellules à rencontrer le virus d’immunodéficience humaine (VIH) au niveau des muqueuses. De plus, le fait que les DC sont, de manière directe ou indirecte par le virus et ses composantes, altérées tant par leur nombre, leur phénotype et leur fonction suggère leur implication dans les dérégulations des cellules B. Selon cette hypothèse, des études longitudinales impliquant des individus infectés au VIH-1 présentant différents profils de progression clinique menées dans notre laboratoire ont démontré que les altérations des cellules B sont concomitantes à une augmentation de l’expression de BLyS/BAFF dans le sang ainsi que par les DC myéloïdes (mDC) sanguines. De plus, lors de travaux antérieurs utilisant le modèle murin VIH-transgénique, les altérations des cellules B ont démontré une implication des DC et d’un excès de BLyS/BAFF, et ce, dépendamment du facteur négatif du VIH (Nef). Dans cette optique, nous investiguons dans cette présente étude l’implication de Nef dans la modulation du phénotype des DC ainsi que dans les dérégulations des cellules B. Chez tous les patients virémiques infectés au VIH-1, nous avons détecté la présence de Nef dans le plasma ainsi qu’au niveau des mDC et de leurs précurseurs d’origine monocytaire, tout au long du suivi de la progression clinique et au-delà de la thérapie antirétrovirale (ART). La surexpression de BLyS/BAFF est associée à la présence de Nef au niveau des mDC et de leur précurseur.. Des essais in vitro ont permis de démontrer l’induction d’un phénotype proinflammatoire par des mDC dérivés de monocytes lorsqu’en présence de Nef soluble, via l’augmentation de l’expression de BLyS/BAFF et de TNF-α, et où cet effet est bloqué par l’ajout de l’acide rétinoïque. Nos résultats suggèrent donc que Nef est impliquée dans le déclenchement et la persistance des dérégulations des cellules B retrouvées chez les individus infectés au VIH-1. Basé sur nos observations, une thérapie adjointe impliquant le blocage de BLyS/BAFF et/ou Nef pourrait contribuer au contrôle de l’inflammation et des altérations des cellules B. De plus, la quantification de Nef post-ART pourrait s’avérer utile dans l’évaluation du statut des réservoirs. Précédemment, nous avons démontré que les dérégulations des cellules B sanguines de ces mêmes individus présentant un profil de progression rapide et classique sont accompagnées par l’augmentation de la fréquence d’une population partageant des caractéristiques des cellules B transitionnelles immatures (TI) et des cellules B de la zone marginale (ZM), que nous avons nommé les cellules B précurseur de la ZM. Toutefois, cette population est préservée chez les contrôleurs élites, chez qui nous avons trouvé une diminution significative de la fréquence des cellules B de la ZM présentant des marqueurs phénotypiques plus matures. Récemment, ces cellules ont été associées à un potentiel de fonction régulatrice (Breg), motivant ainsi notre poursuite, dans cette étude, de la caractérisation de ces cellules B. Comme pour les individus non infectés au VIH-1, nous avons démontré que les cellules B matures de la ZM contrôlent leur capacité de production d’IL-10 chez les contrôleurs élites, contrairement à une augmentation chez les progresseurs rapides et classiques. Aussi, les cellules B précurseur de la ZM des contrôleurs élites fournissent une expression importante de LT-α lorsque comparés aux individus non infectés au VIH-1, alors que cet apport de LT-α est attribué aux cellules B TI chez les progresseurs. Le contrôle de la progression clinique semble associé à un ratio en faveur de LT-α vs IL-10 au niveau des cellules B précurseur de la ZM. Nos résultats suggèrent qu’un maintien de l’intégrité du potentiel régulateur ainsi qu’une expression augmentée de LT-α par les cellules B de première ligne, telles les populations de la ZM, sont impliqués dans le contrôle de la progression clinique du VIH-1, possiblement par leur contribution à la modulation et l’homéostasie immunitaire. De telles populations doivent être considérées lors de l’élaboration de vaccins, ces derniers cherchant à générer une réponse protectrice de première ligne et adaptative.