Avaliação do efeito do inibidor de histona deacetilase Panobinostat (LBH589) no metabolismo energético de células derivadas de câncer de pulmão

Os mecanismos de ação citotóxica do inibidor de histona deacetilase LBH589 foram investigados em associação com o quimioterápico cisplatina (CDDP) em duas linhagens derivadas de câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC). Os resultados foram analisados em relação ao tipo de morte celular associada às alterações em enzimas relacionadas ao metabolismo energético e a via glicolítica. Para realização do trabalho, foram utilizadas as linhagens tumorais A549 (selvagem para o gene de p53) e Calu-1 (nulo para o gene de p53) tratadas com LBH589 em combinação ou não com CDDP. Foram realizadas curvas de tempo e dose-resposta com as drogas isoladamente pelo ensaio de viabilidade celular (MTT) nas duas linhagens para a escolha das melhores condições para o nosso estudo. As condições dos tratamentos isolados com redução da viabilida celular menores que o IC50 de cada fármaco foram selecionados para realização dos tratamentos combinados. As avaliações de apoptose foram realizadas por citometria de fluxo pelo ensaio de Anexina V/PI, e com a marcação de proteínas por Western Blotting. As proteínas relacionadas a via glicolítica foram avaliadas por Western Blotting e a expressão de RNAm por qPCR. Os resultados demonstraram que o LBH589 combinado a CDDP foi capaz de induzir apoptose em 70% das células (Calu-1) e 54,9% (A549) no tempo de 24 horas, e 90% (calu-1) e 62,1% (A549) em 48 horas, independendo, portanto, do status da p53. Os níveis de expressão de enzimas relacionadas com o metabolismos energético também sofreram alterações nos tratamentos estudados. O LBH589 induziu aumento de cerca de 4x dos níveis de RNAm de HK isoformas I e II em ambas as linhagens. Houve também um aumento na expressão proteica das isoformas de HK I e II. Outras enzimas relacionadas a via glicolítica como PFKP, PKM2 e LDHA foram analisadas e apresentaram redução da expressão proteica, principalmente na presença do LBH589. A combinação da CDDP com LBH589 parece ser promissora para o tratamento de CPNPC induzindo apoptose através de alterações no metabolismo energético tumoral.

Avaliação da ação antitumoral in vitro da pterocarpanoquinona LQB 118 e estudo de alguns mecanismos de ação

Tem sido descrito que o acúmulo de mutações em proto-oncogenes e genes supressores de tumor contribui para o direcionamento da célula à carcinogênese. Na maioria dos casos de câncer, as células apresentam proliferação descontrolada devido a alterações na expressão e/ou mutações de ciclinas, quinases dependentes de ciclinas e/ou inibidores do ciclo celular. Os tumores sólidos figuram entre o tipo de câncer mais incidente no mundo, sendo a quimioterapia e/ou hormônio-terapia, radioterapia e cirurgia os tratamentos mais indicados para estes tipos de tumores. Entretanto, o tratamento quimioterápico apresenta diversos efeitos colaterais e muitas vezes é ineficaz. Portanto, a busca por novas moléculas capazes de conter a proliferação destas células e com baixa toxicidade para o organismo se faz necessário. Este trabalho teve por objetivo avaliar a ação antitumoral in vitro de um novo composto sintético, a pterocarpanoquinona LQB118, sobre algumas linhagens tumorais humanas de alta prevalência e estudar alguns dos seus mecanismos de ação. As linhagens tumorais estudadas neste trabalho foram os adenocarcinomas de mama (MCF7) e próstata (PC-3), e carcinoma de pulmão (A549). A citotoxicidade foi avaliada pelo ensaio do MTT e a proliferação celular pela contagem de células vivas (exclusão do corante azul de tripan) e análise do ciclo celular (citometria de fluxo). A expressão gênica foi avaliada por RT-PCR e a apoptose foi avaliada por condensação da cromatina (microscopia de fluorescência-DAPI), fragmentação de DNA (eletroforese) e marcação com anexina V (citometria de fluxo). Das linhagens tumorais testadas, a de próstata (PC3) foi a que se mostrou mais sensível ao LQB 118, e em função deste resultado, os demais experimentos foram realizados com esta linhagem tumoral. O efeito citotóxico do LQB 118 se mostrou tempo e concentração dependente. Esta substância inibiu a proliferação celular e prejudicou a progressão do ciclo celular, acumulando células nas fases S e G2/M. Buscando esclarecer os mecanismos desta ação antitumoral, demonstrou-se que o LQB 118 inibe a expressão do mRNA do fator de transcrição c-Myc e das ciclinas D1 e B1, e induz a apoptose de tais células tumorais. Em suma, o LQB 118 é capaz de inibir a proliferação das células tumorais de próstata, alterando a expressão do mRNA de alguns genes reguladores do ciclo celular, resultando em interrupção do ciclo celular e indução de apoptose, indicando este composto como um potencial candidato a futuro medicamento no tratamento do câncer de próstata.

α/β值与肿瘤细胞辐射敏感性及肿瘤细胞分次照射生物学效应研究

为考察恶性肿瘤细胞的分次照射效应,选取5种具有高辐射抗性的恶性肿瘤细胞系分别进行单次和分次的γ射线照射,比较它们的剂量存活曲线的α/β值及D50、D10值。结果表明,D50的分次照射效应的高-低排列次序为:SMMC-7721、HeLa、A549、HT29和PC3细胞,D10的分次照射效应的高-低排列次序为:SMMC-7721、HeLa、PC3细胞、A549和HT29细胞。5种肿瘤细胞的α/β值的低-高排列次序为:SMMC-7721、PC3、HeLa、A549和HT29细胞;除PC3细胞外,其余四种细胞的辐射敏感性和分次效应均与α/β值相关,α/β值越小,细胞越不敏感且分次效应越明显。不同组织来源的肿瘤细胞的辐射敏感性差异较大,其修复功能和分次照射的生物学效应也有相应的差异,部分肿瘤细胞的辐射敏感性和分次照射的生物学效应与其修复能力相关,单次照射剂量存活曲线的参数α/β值可作为检测肿瘤细胞的辐射敏感性和分次照射的生物学效应的标准。

Effect of p53 on lung carcinoma cells irradiated by carbon ions or X-rays

The study is to investigate the feasibility and advantages of heavy ion beams on radiotherapy. The cellular cycle and apoptosis, cell reproductive death and p53 expression evaluated with flow cytometry, clonogenic survival assays and Western blot analysis were examined in lung carcinoma cells after exposure to 89.63 MeV/u carbon ion and 6 MV X-ray irradiations, respectively. The results showed that the number colonyforming assay of A549 was higher than that of H1299 cells in two radiation groups; A549 cellular cycle was arrested in G(2)/M in 12 It and the percentage of apoptosis ascended at each time point of carbon ion radiation with doses, the expression of p53 upregulated with doses exposed to X-ray or carbon ion. The cell number in G(2)/M of H1299 and apoptosis were increasing at all time points with doses in C-12(6+) ion irradiation group. The results suggested that the effects of carbon ions or X rays irradiation on lung carcinoma cells were different, C-12(6+) ion irradiation could have more effect on upregulating the expression of p53 than X-ray, and the upregulated expression of p53 might produce the cellular cycle G(2)/M arrested, apoptosis increasing; and p53 gene might affect the lung cancer cells radiosensitivity.

低剂量12C6+辐射对小鼠免疫系统损伤和抗氧化剂氮乙酰半胱氨酸的保护作用研究

实验目的：随着科技的发展，人类活动范围已经逐渐向外太空扩展，对于人类太空探索的最大威胁是太空中的各种粒子辐射。这些辐射包括太阳辐射（质子和电子）和银河辐射（质子占85%，氦离子占14%，重离子占1%）。众所周知，重离子与常规X和γ射线相比有较高的传能线密度（linear energy transfer, LET）和相对生物学效应（relative biological effectiveness, RBE），对机体组织和器官有较强的影响。放射治疗是肿瘤治疗的重要手段之一，由于肿瘤细胞的异质性，其对放、化疗的反应相差悬殊。本研究的目的是： 1评估辐射对健康机体产生的生物学风险； 2研究抗氧化剂氮乙酰半胱氨酸（NAC）对机体辐射损伤的保护作用 3不同肿瘤细胞辐射敏感性的差异。实验方法： 1 X射线或12C6+离子对小鼠进行不同剂量的全身辐射。NAC处理组小鼠在照射前1小时腹腔注射200mg/kg的NAC，对照组注射等体积的生理盐水。照射后不同时间点取样，利用流式细胞仪检测小鼠免疫细胞周期和凋亡情况，单细胞电泳检测淋巴细胞DNA损伤，MTT法（3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide）检测脾脏NK（natural killer，NK）细胞活性，微核法检测淋巴细胞染色体损伤情况，小鼠体内干扰素－γ（Interferon-γ，IFN-γ）由ELISA方法得到，小鼠血清中超氧化物岐化酶(Surperoxide dismutase SOD）由分光光度法测定，并观察胸腺和脾脏指数变化。 2 不同剂量X射线和12C6+离子辐射人肺腺癌细胞H1299和A549，用细胞克隆法检测照射后细胞存活曲线，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡，Western-blot 检测A549 细胞P53蛋白表达。 结果： 1小鼠外周血淋巴细胞、胸腺细胞和脾脏淋巴细胞周期随着X射线照射剂量的增大而被阻滞在了G0/G1期，相同剂量的12C6+离子辐射时外周血淋巴细胞周期被阻滞在S期，分次连续X射线照射时，外周血淋巴细胞周期随着累积剂量的增加被阻滞在G2/M期；细胞凋亡比例随着照射剂量的增加而增加。小鼠血清中IFN-γ水平和脾脏中NK细胞活性在重离子照射剂量为0.05Gy时有显著增加，脾脏NK细胞活性随着照射剂量的增加而减弱。 2重离子照射后，小鼠淋巴细胞DNA和染色体的损伤随辐射剂量和照射后时间的延长而加剧。脾脏NK细胞活性在照射后各个时间点减弱，血清中IFN-γ水平和SOD酶活性随着重离子照射剂量的增加而降低。预防性给予NAC，12C6+离子辐射对淋巴细胞DNA和染色体所致损伤，胸腺细胞周期和凋亡，脾脏NK细胞活性，血清中IFN-γ的水平和SOD酶的活性的损伤与盐水组比较均有显著改善。 3 X射线照射对肺腺癌H1299细胞周期和凋亡率未产生明显影响，重离子照射后随着照射剂量的增加细胞周期被阻滞在G2/M期，细胞凋亡率也呈剂量依赖性；X射线和12C6+离子照射A549细胞后，细胞周期均被阻滞在G2/M期，凋亡率剂量依赖性增加。A549细胞P53蛋白的表达水平随着重离子照射剂量的增加而增加。结论： 1重离子辐射造成细胞DNA和染色体损伤随着照射剂量的增加和照射后时间的延长而增加，比X射线辐射损伤复杂和难以修复，产生这种现象的机理为辐射导致活性氧分子簇的产生，细胞因子和与细胞氧化反应有关的酶活性的变化，同时这种损伤对胸腺细胞周期、凋亡和胸腺、脾脏指数以及机体免疫系统都有影响；低剂量重离子辐射（0.05Gy）对小鼠机体的免疫力有刺激作用，机体免疫能力随着照射剂量增加和照射后时间的推移而减弱，不同的免疫器官对辐射的敏感性也不同； 2 200mg/kg 的NAC对辐射所致小鼠免疫系统损伤有很好的保护作用； 3 肺腺癌细胞H1299比同系A549具有较强的辐射敏感性，A549细胞凋亡的增加与P53蛋白表达水平升高有关

三株肺癌细胞株的分子细胞遗传学研究

本课题采用流式细胞分选和双向及多色的染色体涂色等技术，详细地分析了三株非小细胞肺癌细胞系（YTMLC-90、GLC-82和A549）核型的异同，以揭示其核型特点，并希望能够找到三株细胞系共有的染色体断裂位点和可能发生的基因重组。染色体涂色技术揭示了三株细胞复杂的染色体数目和结构畸变。引人注目的是YTMLC-90和GLC-82具有相似且保守的核型，其中GLC-82的核型与其刚建立时的核型相比几乎没有发生改变。这与A549 的核型特点差别迥异。YTMLC-90 和GLC-82都有23 条异常染色体，除了i (5p) 有3个拷贝外，其余均为单拷贝；A549 有13条衍生染色体。在这三株细胞中，含有两个共有的断裂位点：HSA12q13 和 8q24.1。通过对NCBI的CancerChromosome数据库进行数据挖掘，发现8个可能的肿瘤相关基因位于这两个位点，其中3个已经被证实是肿瘤相关基因，其它5个基因可能是潜在的肿瘤抑制基因，需要进一步的实验来验证。

Laurendecumallenes A-B and laurendecumenynes A-B, halogenated nonterpenoid C-15-Acetogenins from the marine red alga Laurencia decumbens

Four new halogenated nonterpenoid C-15-acetogenins, 4:7,6:13-bisepoxy-9,10-diol-1,12-dibromopentadeca-1,2-diene (1, laurendecumallene A), 4:7,6:12-bisepoxy-9,10-diol-1,13-dibromopentadeca-1,2-diene (2, laurendecumallene 13), (3Z)-6:10,7:13-bisepoxy-12-bromo-9-hydroperoxylpentadeca-3-en-1-yne (3, laurendecumenyne A), and (3Z)-6:10,9:13-bisepoxy-12-bromo-7-chloropentadeca-3-en-1-yne (4, laurendecumenyne 13), together with one known halogenated C-15-acetogenin elatenyne (5) were isolated and identified from the organic extract of the marine red alga Laurencia decumbens. Their structures and relative stereochemistry were established by means of spectroscopic analysis including UV, IR, high-resolution electrospray ionization mass spectrometry (HRESIMS), and ID and 2D NMR techniques. All these metabolites were submitted for the cytotoxic assay against tumor cell line A549 (human lung adenocarcinoma), but all of them were found inactive (IC50 > 10 mu g/mL).

Dioxopiperazine Alkaloids Produced by the Marine Mangrove Derived Endophytic Fungus Eurotium rubrum

Cultivation of the fungal strain Eurotium rubrum, an endophytic fungus that was isolated from the inner tissue of stems of the mangrove plant Hibiscus tiliaceus, resulted in the isolation of two new dioxopiperazine derivatives, namely, dehydrovariecolorin L (1) and dehydroechinulin (2), together with eight known dioxopiperazine compounds including variecolorin L (3), echinulin (4), isoechinulin A (5), dihydroxyisoechinulin A (6), preechinulin (7), neoechinulin A (8), neoechinulin E (9), and cryptoechinuline D (10). The structures of the isolated compounds were determined by extensive analysis of their spectroscopic data as well as by comparison with literature. Compounds 1, 2, 9, and 10 were investigated for their a,a-diphenyl-beta-picrylhydrazyl (DPPH) radical-scavenging activity. In addition, the new compounds, 1 and 2, were evaluated for their cytotoxic activity against the P-388, HL-60, and A549 cell lines.

三种红藻活性物质的发现及松节藻醇提物抗糖尿病药理研究

海藻是海洋生物中的一大类群，由于其特殊的生活环境，能够代谢产生大量结构独特多变和活性特殊多样的代谢产物，是化学和生物活性多样性研究的重要对象之一。我国海域辽阔，海藻资源丰富，为寻找结构新颖、生理活性独特的先导化合物，加强对海藻资源的开发利用，本论文对中国沿海的三种海洋红藻进行了化学成分和生物活性研究，同时对山东青岛海域生物量丰富的一种海洋红藻松节藻进行了动物体内抗糖尿病活性研究。 利用正相硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱以及反相HPLC和重结晶等现代分离手段，对山东青岛沿海的红藻扇形叉枝藻（Gymnogongrus flabelliformis）进行了系统的化学成分研究，从中得到单体化合物26个，通过波谱学方法（IR、MS、NMR等）鉴定了他们的结构，分别为(3R,6R,7E)-(+)-3-O-phenylacetyl- 4,7-megastigmadiene-9-one（1），(3R,7E)-(-)-3-O-phenylacetyl-5,7-megastigmadiene -9-one（2），(3S,6R,7E)-(+)-3-hydroxyl-4,7-megastigmadien-9-one（3），(3S,5R,6S,7E)- (-)-3-hydroxy-5,6-epoxy-7-megastigmene-9-one（4），(3S,5S,6R,7E)-(+)-3-hydroxy- 5,6-epoxy-7-megastigmene-9-one（5），Dehydrovomifoliol（6），(3R)-(-)-4-[(2R,4S)-4- acetoxy-2-hydroxy-2,6,6-trimethylcyclohexylidene]-3-buten-2-one（7），2,3,3′-三溴-4,4′,5,5′-四羟基-1′-乙氧甲基双苯基甲烷（8），2,2′,3,3′-四溴-4,4′,5,5′-四羟基双苯基甲烷（9），3-溴-4,5-二羟基苯甲醛（10），2,3-二溴-4,5-二羟基苯甲基甲醚（11），2,3-二溴-4,5-二羟基苯甲醇（12），N, N-二甲基酪胺（13），4-羟基苯甲酸乙酯（14），4-羟基苯甲基乙醚（15），4-羟基苯乙基乙酯（16），4-羟基苯乙酸甲酯（17），4-羟基苯甲醛（18），豆甾-4-烯-3-酮（19），胆甾-4-烯-3-酮（20），胆甾醇（21），尿嘧啶（22），尿嘧啶核苷（23），腺嘌呤核苷（24），丁二酸（25），5-羟基-4-甲基-5-戊基-2,5-二氢呋喃-2-酮（26）。其中化合物1、2为新化合物，化合物3为新天然产物，所有化合物均为首次从该属海藻中分离得到。通过 MTT 法对部分单体化合物进行了肿瘤细胞毒活性筛选, 结果表明，化合物8、9、10、12对筛选的所有细胞株均有较强细胞毒活性，化合物11对人肺癌细胞株（A549）、人肝癌细胞株（Bel 7402）、人结肠癌细胞株（HCT-8）有一定细胞毒活性。通过研究单体化合物对小鼠腹腔巨噬细胞TNF-分泌的影响，对其进行抗炎活性筛选，结果表明，化合物8、9、11、13、17、23、24、25对小鼠腹腔巨噬细胞TNF-分泌表现出明显的抑制作用。 从采自山东荣成镆铘岛的红藻小珊瑚藻（Corallina pilulifera）的乙酸乙酯萃取物中分离得到16个单体化合物，通过波谱学方法鉴定化合物结构14个（另外2个正在鉴定中），分别为2α-乙氧酰基-2β-羟基-A-降胆甾-5-烯-4-酮（27），胆甾-4-烯-3-酮（28），胆甾醇（29），3β-羟基-胆甾-5,24(28)-二烯-7-酮（30），2α-羟基-胆甾-4-烯-3-酮（31），6α-羟基-胆甾-4-烯-3-酮（32），3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮（33），(E)-phytol epoxide（34），Phytenal（35），3,7,11,15- tetramethyl-hexadec-2-en-1-oll（Phytol）（36），Loloilide（37），(3S,5R,6S,7E)-(-)-3-hydroxy-5,6-epoxy-7- megastigmene-9-one（38），Dehydrovomifoliol（39），4-羟基苯甲醛（40）。其中，化合物 31为新天然产物，化合物27为首次从植物中分离得到，所有化合物均为首次从该种海藻中分离得到。通过 MTT 法对分离得到的单体化合物进行了肿瘤细胞毒活性筛选,化合物27和化合物32对筛选的所有肿瘤细胞株均有细胞毒活性，且化合物27对人胃癌细胞株（BGC-823）、人结肠癌细胞株（HCT-8）和人卵巢癌细胞株（A2780）具有中等强度抑制活性。化合物28、化合物31和化合物33对人肝癌细胞株（Bel 7402）、人结肠癌细胞株（HCT-8）和人卵巢癌细胞株（A2780）有一定细胞毒活性。 从采自广西北海涠洲岛的多管藻Polysiphonia sp.的乙酸乙酯萃取物中分离得到6个单体化合物，通过波谱学方法鉴定化合物结构5个（另外1个仍在鉴定），分别为胆甾醇（41），3,7,11,15-tetramethyl-hexadec-2-en-1-ol（Phytol）（42），3-吲哚甲醛（43），4-羟基苯甲醛（44），4-羟基苯甲酸（45）。 对山东青岛沿海的松节藻 (Rhodomela confervoides) 乙醇提取物进行了初步的体内抗糖尿病活性研究，采用链脲佐菌素诱导的2型糖尿病（STZ-DM）大鼠模型对其进行体内降糖实验，结果发现，松节藻乙醇提取物在糖尿病大鼠体内不仅具有显著的降血糖作用，且呈现良好的量–效关系，而且能够纠正糖尿病引发的物质代谢紊乱，增加体重，提高试验动物的成活率，因此具有良好的应用开发前景。

两种海藻提取物的化学成分和生物活性的研究及其应用

本论文的研究工作由两部分组成，第一部分研究了海带（Laminaria japonica）水提取物中的活性物质，并研究了提取物对蔬菜促生长的影响及其作用机制。第二部分对三列凹顶藻(Laurencia tristicha)乙醇提取物的乙酸乙酯相进行了活性筛选和化学成分研究，并对其中分离得到的单体化合物进行了生物活性筛选。 第一部分主要以中国人工养殖的海带为原料，使用与海藻多糖生产相结合的提取技术并浓缩其中的有效成分。对浓缩提取物进行了蔬菜的农田效果实验，并对作物抗旱性能的增加、作物硝酸盐积累的减少、作物品质的改善、以及作物抵抗病毒病的能力等影响进行了作用机制方面的研究。海藻浓缩提取物进行的农田效果实验表明：作物抗旱型相对含水量RWC值在92%~94%之间；病毒病的防治效果最高可达到91%；作物的品质有明显的改善，最重要的是首次发现海藻提取物有降低蔬菜中硝酸盐的含量（硝酸盐的含量是与有机蔬菜区别的重要指标之一）的作用。该部分研究工作的创新性主要体现在：（1）首次在国内外提出和采用与海藻多糖生产相结合的提取技术。该技术的应用不但减少了提取成本，使工业化生产成为可能,更重要的是使我国的海藻工业生产可能实现高值化和开辟综合利用的新途径。（2）首次发现海藻中的小分子海藻多糖具有和细胞激动素、甜菜碱、植物生长素等活性物质同样的生物活性。 第二部分的研究是在查阅了大量的近20年来国内外有关红藻凹顶藻中化学成分研究的相关文献的基础上，对凹顶藻中的次生代谢产物进行了综述。该论文主要是通过对红藻三列凹顶藻的95%乙醇提取物的乙酸乙酯相进行化学成分分析和生物活性筛选以期能够发现具有药用前景的活性先导化合物。 为了寻找具有生物活性的化合物，我们对采自我国南海硇洲岛海域的红藻三列凹顶藻的95%乙醇提取物的乙酸乙酯相进行了活性筛选。采用MTT法对其在KB细胞株、Bel-7402细胞株、PC-3M细胞株、MCF-7细胞株、Ketr-3细胞株模型上进行了细胞毒活性测试；采用酶模型对其进行了Na+,K+-ATPase的抑制活性测试；采用MTT法对其在犬主动脉血管模型上进行了血管平滑肌细胞增殖抑制活性测试；结果表明，三列凹顶藻的95%乙醇提取物的乙酸乙酯相对Na+,K+-ATPase和犬血管平滑肌细胞增殖具有一定的抑制活性。 利用正相和反相色谱、Sephadex LH-20色谱以及反相HPLC等手段进行分离纯化，从我国南海海域的红藻三列凹顶藻中分离得到33种化学成分，通过波谱学方法（IR、MS、NMR）以及X-ray单晶衍射试验对其化学结构进行了确证，其中化合物L1~L8为新结构化合物，化合物L5为具有新骨架的全新结构化合物，化合物L9~L13为新天然产物，化合物L18和L22系首次从海洋生物中获得，所有化合物均为首次从该属海藻中得到。新化合物L1~L8均为倍半萜类化合物，命名分别为：(1R,3R)-(-)-3-(3-hydroxy-4-methylphenyl)- 1,3-dimethyl–2-methylidene cyclopentanol (L1), (1R,3R)-(-)-3-(4-methylphenyl)-1,3-dimethyl-2-methylidenecyclopentanol (L2)， (1R, 3R)-(-)-3-(2-hydroxy-4-methylphenyl)-1,3-dimethyl–2–methylidenecyclopentanol (L3)，(+)-(1S,2R)–2-(3–hydroxy–4–methylphenyl)-1,2-[3.1.0]bicy-clohexane (L4)，()-(1S,2R) -5-hydroxy–6–methyl-spiro-dihydrobenzofuran-2(3H),2-{1-methyl-[3.1.0]bicyclohexane} (L5), (+)-6-methyl-2-(p-tolyl)hept-4-en-2,6-diol (L6)，(3R,3aS,8bS)-(-)-2,3,3a,8b–tetrahydro–7-bromo – 3 a– hydroxymethyl - 3, 6, 8b - trimethyl-1H- cyclopenta[b] benzofuran (L7 )，(3R, 3aS, 8bS) - (-) - 2,3,3a,8b–tetrahydro–3 a–hydroxymethyl-3,6,8b -trimethyl -1H – cyclopenta [b] benzofuran (L8)。25个已知结构化合物确定为：(+)-(1R,2R)-4-bromo-1,5, 9–trimethyl–12– methylidene–8–oxa-tricyclo[7.2.1.02]dodeca-2,4,6-triene (L9)，(3S,3aR,8bS)-(-)-2,3,3a, 8b– tetra -hydro–7-bromo–3–hydroxy-3,3a,6,8b-tetramethyl-1H-cyclopenta[b]benzofu- ran (L10 )，(3R, 3aR, 8bS) - (-) - 2, 3, 3a, 8b – tetrahydro – 7 - bromo – 3 – hydroxy - 3,3a,6,8b - tetramethyl - 1H - cyclopenta [b] benzofuran (L11 )，(3S,3aR,8bS) - (-) - 2, 3, 3a, 8b – tetrahydro –3–hydroxy -3, 3a, 6, 8b - tetramethyl-1H-cyclopenta[b]benzofuran (L12 )， ( 3aR, 8bS) - (-) - 3a,8b –dihydro–7 - bromo – 3, 3a, 6, 8b - tetramethyl - 1H - cyclopenta[b]benzofuran (L13 )，aplysinol (L14 ) ，aplysin (L15)，laurebiphenyl (L16)，johnstonol (L17)，gossonorol (L18)，7,10-epoxy-ar- bisabol-11-ol (L19)，10-epi-7,10-epoxyarbisabol-11-ol (L20) 3β-hydroxy- 5α, 6α-epoxy- β- ionone (L21 )，3β-hydroxy-5β,6β-epoxy-β-ionone (L22 )，胆甾醇 (L23 )，胆甾-5-烯-3β,7α二醇胆甾-5-烯-3β,7α二醇 (L24)，β-谷甾醇 (L25)，叶绿醇 (L26 )，玉米黄素 (L27 )，对羟基苯甲醛 (L28 )，3-吲哚甲醛 (L29 )，1-O-十六烷酰基-3-O-β-D-吡喃半乳糖基-丙三醇(L30 )，1-O-十八烷酰基-3-O-β-D-吡喃半乳糖基-丙三醇 (L31 )，丙三醇-1-软脂酸单酯 (L32 )，正十六碳酸 (L33 )。 采用MTT法对其中23个单体化合物在Bel-7402细胞株、BGC-823细胞株、A549细胞株、A2780细胞株、HCT-8细胞株和HELL细胞株模型上进行了细胞毒活性测试；采用MTT法对其中13个单体化合物在犬主动脉血管模型上进行了血管平滑肌细胞增殖抑制活性测试；结果表明，部分单体化合物显示出一定的生物活性。

海洋放线菌来源的化合物卡拉霉素(kalamycin)的抗肿瘤作用和机制研究

海洋生态环境的特殊性决定了海洋中往往含有结构奇特、新颖的化学物质， 海洋药物具有药理特异性、高活性和多样性，已成为药物研发热点领域，海洋抗肿瘤药物也是其中之一。卡拉霉素（kalamycin）来源于海洋放线菌M097的聚酮类化合物，我们实验室用体外增殖抑制试验发现了卡拉霉素（kalamycin）的抗肿瘤作用。有报道其类似物lactoquinomycin和frenolicin B是肿瘤靶点AKT抑制剂，并由此推断吡喃萘醌骨架在AKT抑制过程中发挥主要作用，我们发现虽然卡拉霉素（kalamycin）含有吡喃萘醌骨架，但是并不抑制AKT及其下游信号系统；继而对卡拉霉素（kalamycin）的体外抗肿瘤作用及其机理进行了系统的分析。 采用磺酰罗丹明B（SRB）法检测卡拉霉素（kalamycin）对10株肿瘤细胞株的体外增殖抑制作用，结果表明，卡拉霉素（kalamycin）能明显抑制各种组织来源的肿瘤细胞生长，具有广泛的细胞增殖抑制作用，除对一株肺癌细胞A549抑制作用不明显外，对9株肿瘤细胞株的IC50平均值为2.5μM，并且对各个细胞株生长抑制曲线形态基本一致。采用流式细胞术证实，卡拉霉素（kalamycin）能剂量依赖地诱导结肠癌细胞HCT-116和肝癌细胞SMMC-7721发生G2/M期周期阻滞，可以诱导黑色素瘤A375细胞发生凋亡。 基于前人的报道，我们用Western blot方法检测卡拉霉素（kalamycin）对AKT信号系统的影响，用量从1μM增加到16μM，AKT、mTOR和磷酸化AKT、mTOR、GSK3β的总量都没有变化；因此我们判断卡拉霉素（kalamycin）不是通过AKT系统发挥作用，而是有另外的机制。细胞凋亡和周期阻滞的很多过程是和P53相关的，我们用卡拉霉素（kalamycin）对P53野生和缺失的HCT-116细胞的增殖抑制和凋亡诱导来分析该抑制作用是否和P53相关，结果显示卡拉霉素（kalamycin）对两种细胞的生长抑制和诱导凋亡作用无明显差异，其作用和P53途径是不相关的。 卡拉霉素（kalamycin）细胞增殖抑制作用的非选择性，表明该化合物是一个广谱的细胞增殖抑制剂。我们用体外酶反应实验分析了卡拉霉素（kalamycin）对拓扑酶的抑制作用，结果显示卡拉霉素（kalamycin）对Topo I没有抑制作用，在20μM时几乎完全抑制Topo II，呈现出显著的浓度依赖效应，抑制作用大约比VP16强十倍。用DNA伸展实验和Topo II 介导的负超螺旋 pBR322 切割实验，证实卡拉霉素（kalamycin）不是DNA嵌入剂和Topo II毒剂，而是一个催化抑制剂。在体外模拟Topo II的催化反应步骤，把整个过程分解，发现卡拉霉素（kalamycin）可以抑制Topo II介导的DNA的切割，但是对再连接没有作用；卡拉霉素（kalamycin）能抑制ATP水解的作用，但是在较高剂量时抑制作用要比阳性对照弱得多。因此，卡拉霉素（kalamycin）可能主要通过抑制Topo II介导的DNA的切割发挥作用。 肿瘤新血管生成是原发性肿瘤赖以发生、生长和转移的物质基础。我们用了多个新生血管生成模型对卡拉霉素（kalamycin）的抗新生血管生成作用进行了检测，发现卡拉霉素（kalamycin） 对内皮细胞管腔形有抑制作用，其作用效果呈现明显的剂量依赖性。卡拉霉素（kalamycin）在对内皮细胞HMEC-1在12小时内的IC50是4.39μM ，在没有显著增殖抑制作用的剂量下，对HMEC-1管腔形成依然具有抑制作用，提示卡拉霉素（kalamycin）的抗新生血管生成作用并非完全来源于其增殖抑制作用。通过体外酶反应、western blot和双荧光素酶报告基因系统分析卡拉霉素（kalamycin）抑制肿瘤新血管生成的信号途径，结果发现这种抑制作用不是依赖于酪氨酸激酶和HIF-lα途径的。 综上所述，卡拉霉素（kalamycin）不是一个AKT抑制剂，它通过专一性的抑制Topo II使肿瘤细胞发生周期阻滞和细胞凋亡，主要抑制Topo II介导的DNA的切割和ATP水解作用。同时卡拉霉素（kalamycin）可以抑制肿瘤血管管腔形成，抑制作用不依赖酪氨酸激酶和HIF-lα途径。

两株海藻内生真菌次生代谢产物及其生物活性研究

海洋微生物拥有丰富多样的次生代谢途径，其中海洋生物内生真菌次生代谢产物研究日益受到天然产物化学界的重视。本论文以菌丝体生物量、发酵产物重量、抗菌与细胞毒活性、薄层色谱分析结果以及高效液相色谱分析结果等为评价依据对采自青岛沿海的13株海藻内生真菌在四种液体培养基上的静置发酵产物进行了综合评价，并从中选择了黑曲霉Aspergillus niger EN-13（分离自褐藻囊藻Colpomenia sinuosa）和杂色曲霉A. versicolor EN-7（分离自褐藻鼠尾藻Sargassum thunbergii）两株真菌进行了30升规模发酵（分别采用GPYM培养基和PDB培养）和化学成分的研究，对分离得到的大部分化合物进行了初步的生物活性筛选。 发酵提取物采用常规的硅胶柱层析、反相硅胶柱层析，凝胶Sephadex LH-20柱层析、制备薄层层析、半制备高效液相色谱以及重结晶等分离手段，得到单体化合物。利用各种现代波谱技术(IR、UV、EI-MS、FAB-MS、HR-ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC等)并结合化学方法从两种菌株发酵提取物中鉴定了55个化合物的结构。其中从菌株A. niger EN-13分离鉴定了31个化合物，发现9个新化合物，包括2个鞘酯类化合物（AN-1~2）、3个萘并-γ-吡喃酮类化合物（AN-3~5）、3个苯乙基取代的α-吡喃酮类化合物（AN-17, AN-19~20）和1个甾体Diels-Alder加成产物（AN-21），另有1个新的天然环二肽（AN-27）被分离鉴定；从菌株A. versicolor EN-7分离鉴定了24个化合物，发现2个新化合物，为蒽醌AV-12与AV-17，另外，从前一菌株（A. niger EN-13）中鉴定的2个新鞘酯类化合物（AN-1~2）在A. versicolor EN-7中也被再次分离到。 对大部分单体化合物进行了抗菌活性、DPPH自由基清除活性和细胞毒活性测试。结果显示新化合物AN-1、AN-5和AN-20具有弱或中等强度的抑制白色念珠菌生长的活性，AN-4、AN-5、AN-21显示了弱或中等强度的抑制黑曲霉生长的活性，AV-12、AV-17显示了弱的抑制大肠杆菌生长的活性。在DPPH自由基清除活性筛选中，AN-5显示了中等强度的活性，其EC50为109.3 mM，与阳性对照BHT相近（EC50为81.8 mM）。其它部分已知化合物在抗菌和DPPH自由基清除活性的筛选中也显示了弱或中等强度的活性。在针对人肝癌细胞株SMMC-7721和人肺腺癌细胞株A549的体外细胞毒活性筛选中，所测样品均未显示显著活性。

Bromophenols coupled with methyl gamma-ureidobutyrate and bromophenol sulfates from the red alga Rhodomela confervoides

Four new bromophenols C-N coupled with methyl gamma-ureidobutyrate (1-4), a phenylethanol bromophenol (5), and three phenylethanol sulfate bromophenols (6-8) have been isolated from polar fractions of an ethanolic extract of the red alga Rhodomela confervoides. On the basis of spectroscopic evidence including HRMS and 2D NMR data, the structures of the new compounds were determined as methyl N'-(2,3-dibromo-4,5-dihydroxybenzyl)-gamma-ureidobutyrate (1), methyl N,N'-bis(2,3-dibromo-4,5-dihydroxybenzyl)-gamma-ureidobutyrate (2), methyl N'-[3-bromo-2-(2,3-dibromo-4,5-dihydroxybenzyl)-4,5-dihydroxybenzyl]-gamma-ureidobutyrate (3), methyl N'-(2,3-dibromo-4,5-dihydroxybenzyl)-A7-[3-bromo2-(2,3-dibromo-4,5-dihydroxybenzyl)-4,5-dihydroxybenzyl]-gamma-ureidobutyrate (4), 2,3-dibromo-4,5-dihydroxyphenylethanol (5), 2,3-dibromo-4,5-dihydroxyphenylethanol Sulfate (6), 3-bromo-4,5-dihydroxyphenylethanol sulfate (7), and 3-bromo2-(2,3-dibromo-4,5-dihydroxybenzyl)-4,5-dihydroxyphenylethanol sulfate (8). The cytotoxicity of all compounds was evaluated against several human cancer cell lines including human colon cancer (HCT-8), hepatoma (Bel7402), stomach cancer (BGC-823), lung adenocarcinoma (A549), and human ovarian cancer (A2780). Among them, the phenylethanol and the phenylethanol sulfate bromophenols (5-8) showed moderate cytotoxicity against all tested cell lines.

Cadinane Sesquiterpenes from the brown alga Dictyopteris divaricata

Seven new cadinane sesquiterpenes, (-)-(1R,6S,7S,10R)-1-hydroxycadinan-3-en-5-one (1), (+)-(1R,5S,6R,7S, 10R)-cadinan-3-ene-1,5-diol (2), (+)-(1R,5R,6R,7S,10R)-cadinan-3-ene-1,5-diol (3), (+)-(1R,5S,6R,7S,10R)-cadinan-4(11)-ene-1,5-diol (4), (+)-(1R,5R,6R,7R,10R)-cadinan-4(11)-ene-1,5,12-triol (5), (-)-(1R,4R,5S,6R,7S, 10R)-cadinan-1,4,5-triol (6), and (-)-(1R,6R,7S,10R)-11-oxocadinan-4-en-1-ol (7), together with nine known compounds were isolated from the brown alga Dictyopteris divaricata. The structures of the new natural products, as well as their absolute configuration, were established by means of spectroscopic data including IR, HRMS, 1D and 2D NMR, single-crystal X-ray diffraction, and CD. All compounds were inactive against several human cancer cell lines including lung adenocarcinoma (A549), stomach cancer (BGC-823), breast cancer (MCF-7), hepatoma (Bel7402), and colon cancer (HCT-8) cell lines.