Efeitos de diferentes pressões de aspiração do tecido adiposo na obtenção de células-tronco mesenquimais

INTRODUÇÃO: O enxerto de gordura nos últimos anos voltou a ter destaque como aliado dos cirurgiões plásticos no preenchimento de partes moles, no rejuvenescimento facial volumétrico, nos refinamentos de reconstruções mamárias e por ser rica fonte de células-tronco de comportamento mesenquimal (células-tronco adipoderivadas). Considerando que essas células têm importante papel na angiogênese e na diferenciação adipogênica, com impacto direto na sobrevivência dos enxertos de gordura, determinar parâmetros que otimizem a sua obtenção é imperativo. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho é avaliar e comparar dois métodos de obtenção do tecido adiposo da região abdominal quanto ao número de células viáveis presentes na fração vásculo-estromal e analisar a expressão de marcadores de superfície. MÉTODO: Foram selecionadas 9 pacientes do sexo feminino submetidas a lipoaspiração. O tecido adiposo foi obtido da região abdominal infraumbilical. Da metade direita foram coletados 20 ml de gordura, empregando-se cânula acoplada a uma seringa, cujo êmbolo foi tracionado de 2 cc em 2 cc, gerando baixas pressões de aspiração (grupo manual). O mesmo processo foi repetido na metade esquerda, entretanto a cânula estava acoplada a um coletor intermediário estéril e esse a uma máquina de vácuo sob pressão negativa constante de 350 mmHg (grupo a vácuo). As amostras foram centrifugadas e a gordura da camada intermediária dos dois grupos foi submetida a contagem celular, estabelecimento de culturas e posterior imunofenotipagem. RESULTADOS: Este estudo demonstrou que, apesar de não haver diferença estatisticamente significativa, a obtenção da gordura da região abdominal empregando-se lipoaspirador com pressão negativa de 350 mmHg proporcionou maior número de células presentes na fração vásculo-estromal quando comparado à obtenção por meio de seringas de 10 ml, com baixas pressões de aspiração. CONCLUSÕES: O emprego de pressão negativa de 350 mmHg é seguro para a obtenção das células-tronco adipoderivadas e o rendimento celular entre os dois grupos não apresentou diferença estatisticamente significativa.

Contribuição das células-tronco mesenquimais para as propriedades tumorigênicas de células de glioblastoma humano

Células-tronco mesenquimais (CTM) apresentam tropismo a tumores, sendo importantes componentes do estroma tumoral. No cérebro, o nicho perivascular é uma importante fonte de CTM, as quais podem contribuir direta e/ou indiretamente para o desenvolvimento de tumores, embora os mecanismos envolvidos sejam pouco conhecidos. No presente trabalho, investigou-se a influência de CTM sobre a proliferação, capacidade invasiva e tumorigenicidade de células de Glioblastoma (GBM) humano. Sabe-se que CTM produzem TGFB1, uma citocina multifuncional envolvida em imunomodulação, proliferação, migração e transição epitelial-mesenquimal de células tumorais. Experimentos in vitro, realizados com meios condicionados de CTM de cordão umbilical humano com silenciamento permanente do gene TGFB1, demonstraram que o TGFB1 secretado por CTM é capaz de aumentar significativamente a proliferação e viabilidade de células de GBM humano da linhagem U87FP635. Esses resultados revelam uma importante ação parácrina dessa citocina regulatória, quando produzida por outros tipos celulares contidos no microambiente tumoral. Entretanto, sob condições experimentais que melhor mimetizam o microambiente tumoral, detectou-se que CTM também afetam o comportamento de células tumorais por um mecanismo alternativo, dependente de contato celular, mas independente dos níveis de TGFB1 secretados pelas CTM. Sob condições de cocultivo celular, envolvendo contato físico entre CTM e células de GBM U87FP635, detectou-se um aumento significativo na quantidade de células tumorais viáveis. Quando cultivadas na forma de esferoides tumorais, o contato com CTM aumentou a capacidade invasiva das células U87FP635. Finalmente, em modelo in vivo ectópico de GBM, células U87FP635 geraram tumores mais desenvolvidos quando coinjetadas com CTM. Esses efeitos pró-tumorigênicos foram observados tanto em contato com CTM controles, quanto com CTM contendo o gene TGFB1 permanentemente silenciado. Assim, esses achados indicam que CTM podem exercer efeitos pró-tumorigênicos por dois mecanismos alternativos e independentes: ação parácrina de TGFB1 secretado por CTM e ação mediada por contato célula-célula. Nas condições experimentais testadas, o mecanismo dependente de contato célula-célula demonstrou ser predominante. O estudo proteômico do secretoma dessas células identificou 126 proteínas diferencialmente expressas além de 10 proteínas exclusivamente detectadas em meios condicionados de cocultivos de CTM com células de GBM U87FP635. Cerca de 80% dessas proteínas exclusivamente secretadas pelo contato célula-célula são componentes de exossomos e estão envolvidas em proliferação celular e desenvolvimento tecidual. Esses resultados apontam uma interação dinâmica de comunicação entre CTM e células tumorais, e revelam algumas proteínas interessantes potencialmente envolvidas em uma ação pró-tumorigênica de CTM mediada por contato celular

Reprogramação de células-tronco mesenquimais em neurônios utilizando genes pró-neurais

A possibilidade de repor células perdidas em doenças neurodegenerativas através de transplantes com células-troncos das mais diversas fontes vem sendo amplamente estudada. As células-tronco adultas (CTA) podem ser facilmente isoladas e sua utilização na pesquisa não envolve questões éticas e religiosas. Além disso, estas células são menos propícias à transformação tumoral do que células-tronco embrionárias, outra importante fonte de células para terapias celulares. No entanto, as CTA são, em estados fisiológicos, restritas a geração de células dos seus tecidos de origem, o que poderia limitar a sua utilização. Porém, nos últimos anos, uma série de técnicas vem sendo descritas com o objetivo de reverter tais limitações. Neste trabalho, nós investigamos a capacidade das células-tronco mesenquimais adultas, isoladas de camundongos ou do cordão umbilical humano, serem induzidas a adquirir um fenótipo neuronal de forma direta, sem passar por um estágio de célula progenitora ou pluripotente, através da reprogramação genética com genes pró-neurais. Nossos resultados indicam que tanto células-tronco mesenquimais adultas murinas quanto humanas podem ser reprogramadas em neurônios após a expressão combinada de Sox2 e Ascl1 ou Sox2 e Neurog2. As células reprogramadas exibem morfologias compatíveis com o fenótipo neuronal, expressam proteínas típicas de neurônios maduros, apresentam a capacidade de gerar potenciais de ação repetitivos e formam conexões sinápticas com outros neurônios presentes no cultivo. Portanto, nosso trabalho apresenta a primeira evidência de reprogramação direta de células-tronco mesenquimais humanas em neurônios funcionais.

Análise da estabilidade genética de células-tronco mesenquimais humanas

Human multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs), also known as mesenchymal stem cells, have become an important and attractive therapeutic tool since they are easily isolated and cultured, have in vitro expansion potential, substantial plasticity and secrete bioactive molecules that exert trophic effects. The human umbilical cord as a cell source for cell therapy will help to avoid several ethical, political, religious and technical issues. One of the main issues with SC lines from different sources, mainly those of embryonic origin, is the possibility of chromosomal alterations and genomic instability during in vitro expansion. Cells isolated from one umbilical cord exhibited a rare balanced paracentric inversion, likely a cytogenetic constitutional alteration, karyotype: 46,XY,inv(3)(p13p25~26). Important genes related to cancer predisposition and others involved in DNA repair are located in 3p25~26. Titanium is an excellent biomaterial for bone-implant integration; however, the use can result in the generation of particulate debris that can accumulate in the tissues adjacent to the prosthesis, in the local bone marrow, in the lymph nodes, liver and spleen. Subsequently may elicit important biological responses that aren´t well studied. In this work, we have studied the genetic stability of MSC isolated from the umbilical cord vein during in vitro expansion, after the cryopreservation, and under different concentrations and time of exposition to titanium microparticles. Cells were isolated, in vitro expanded, demonstrated capacity for osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation and were evaluated using flow cytometry, so they met the minimum requirements for characterization as MSCs. The cells were expanded under different concentrations and time of exposition to titanium microparticles. The genetic stability of MSCs was assessed by cytogenetic analysis, fluorescence in situ hybridization (FISH) and analysis of micronucleus and other nuclear alterations (CBMN). The cells were able to internalize the titanium microparticles, but MSCs preserve their morphology, differentiation capacity and surface marker expression profiles. Furthermore, there was an increase in the genomic instability after long time of in vitro expansion, and this instability was greater when cells were exposed to high doses of titanium microparticles that induced oxidative stress. It is necessary always assess the risks/ benefits of using titanium in tissue therapy involving MSCs, considering the biosafety of the use of bone regeneration using titanium and MSCs. Even without using titanium, it is important that the therapeutic use of such cells is based on analyzes that ensure quality, security and cellular stability, with the standardization of quality control programs appropriate. In conclusion, it is suggested that cytogenetic analysis, FISH analysis and the micronucleus and other nuclear alterations are carried out in CTMH before implanting in a patient

Transcriptoma diferencial entre células-tronco mesenquimais humanas jovens e senescentes

Human mesenchymal stem cells (MSC) are powerful sources for cell therapy in regenerative medicine. The long time cultivation can result in replicative senescence or can be related to the emergence of chromosomal alterations responsible for the acquisition of tumorigenesis features in vitro. In this study, for the first time, the expression profile of MSC with a paracentric chromosomal inversion (MSC/inv) was compared to normal karyotype (MSC/n) in early and late passages. Furthermore, we compared the transcriptome of each MSC in early passages with late passages. MSC used in this study were obtained from the umbilical vein of three donors, two MSC/n and one MSC/inv. After their cryopreservation, they have been expanded in vitro until reached senescence. Total RNA was extracted using the RNeasy mini kit (Qiagen) and marked with the GeneChip ® 3 IVT Express Kit (Affymetrix Inc.). Subsequently, the fragmented aRNA was hybridized on the microarranjo Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 arrays (Affymetrix Inc.). The statistical analysis of differential gene expression was performed between groups MSC by the Partek Genomic Suite software, version 6.4 (Partek Inc.). Was considered statistically significant differences in expression to p-value Bonferroni correction ˂.01. Only signals with fold change ˃ 3.0 were included in the list of differentially expressed. Differences in gene expression data obtained from microarrays were confirmed by Real Time RT-PCR. For the interpretation of biological expression data were used: IPA (Ingenuity Systems) for analysis enrichment functions, the STRING 9.0 for construction of network interactions; Cytoscape 2.8 to the network visualization and analysis bottlenecks with the aid of the GraphPad Prism 5.0 software. BiNGO Cytoscape pluggin was used to access overrepresentation of Gene Ontology categories in Biological Networks. The comparison between senescent and young at each group of MSC has shown that there is a difference in the expression parttern, being higher in the senescent MSC/inv group. The results also showed difference in expression profiles between the MSC/inv versus MSC/n, being greater when they are senescent. New networks were identified for genes related to the response of two of MSC over cultivation time. Were also identified genes that can coordinate functional categories over represented at networks, such as CXCL12, SFRP1, xvi EGF, SPP1, MMP1 e THBS1. The biological interpretation of these data suggests that the population of MSC/inv has different constitutional characteristics, related to their potential for differentiation, proliferation and response to stimuli, responsible for a distinct process of replicative senescence in MSC/inv compared to MSC/n. The genes identified in this study are candidates for biomarkers of cellular senescence in MSC, but their functional relevance in this process should be evaluated in additional in vitro and/or in vivo assays

Isolamento, caracterização e diferenciação de células tronco embrionárias e mesenquimais de equinos

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Identificação do nicho de progenitores mesenquimais no fígado de embriões e fetos caninos: uma fonte de células-tronco para terapia celular

As células-tronco (CT) derivadas dos tecidos fetais (TF) foram as mais recentes descobertas entre as CT, e ultimamente tem demonstrado amplo potencial terapêutico, dentre os TF o fígado fetal (FF) apresenta grande potencial terapêutico. Este órgão durante o período fetal em mamíferos é um nicho hematopoético transitório, sendo o principal órgão responsável pela hematopoese no feto, além de contribuir com a formação do nicho definitivo na medula óssea adulta, portanto pode ser considerado um nicho de células-tronco mesenquimais (CTM) e progenitores. No entanto, pouco se sabe sobre a localização destas células no FF, desta forma o presente estudo visa identificar o nicho de CTM e progenitores em FF de cães, a fim de contribuir com as técnicas de isolamento e extração celular. Em conjunto foi realizada a verificação da expressão do fator de transcrição Oct-3/4 e da proteína delta polimerase do DNA (PCNA). Para a análise foram utilizados cinco embriões e 11 fetos caninos com idades gestacionais variando de 25-60 dias. Os resultados elucidaram a partir de 25 dias de gestação o FF apresentou-se volumoso e composto por todas as estruturas típicas, dentre elas a tríade portal, ductos biliares e ramos das artérias hepáticas. Com 30 dias de gestação foram identificados os primeiros sitos de progenitores mesenquimais (PM) enquanto que aos 60 dias os nichos estavam completamente formados com localização semelhante ao fígado adulto (FA). No entanto, células imunopositivas para Oct-3/4 não foram identificadas; sendo assim, destacamos que o FF é uma fonte de PM, apresentando-se como uma alternativa para a utilização terapêutica, bem como para os estudos da biologia do desenvolvimento das CTM e progenitores.

Análise citogenética de células-tronco derivadas do subendotélio da veia umbilical humana

Mesenchymal stem cells (MSCs) are known as a population of multi-potential cells able to proliferate and differentiate into multiple mesodermal tissues including bone, cartilage, muscle, ligament, tendon, fat and stroma. Several applications of the study of EC can be emphasized the therapeutic techniques such as guided bone regeneration by implantation of EC in the affected site, without the need for bone grafts, using titanium as a vehicle. The process of cryopreservation is essential for the maintenance of cell cultures, since the cell line is frozen, it can be maintained in liquid nitrogen for an indefinite period and then thawed for therapeutic or experimental purposes. The aim of this study was to isolate a population of MSCs derived from the subendothelium of the umbilical vein human (MSCs-SUVH) to assess cytogenetic analysis by the possibility of appearance of chromosomal changes in two different situations: MSCs-SUVH regarding the process of cryopreservation and MSCs-SUVH grown on the surface of titanium. Flow cytometry analysis revealed that, this cell population was positive for the markers CD29, CD73 and CD90, but there was no expression of hematopoietic lineage markers, such as CD14, CD34 and CD45 and demonstrated capacity for osteogenic differentiation. The chromosomes obtained from the primary culture of MSCs-SUVH were analyzed by GTW banding technique, and results are described as guidelines to ISCN 2005. There was not the emergence of clonal chromosomal changes in the MSCs-SUVH in different situations analyzed. However one of the strings presented a balanced paracentric inversion, probably a cytogenetic constitutional alterations, which was present before and after the experimental situations that the MSCs-SUVH was submitted

Estruturação ex-vivo de vasos sanguíneos a partir da diferenciação de células tronco de coelhos

Pós-graduação em Pesquisa e Desenvolvimento (Biotecnologia Médica) - FMB

Contribuição da terapia celular com células tronco em fibrose em ratos

Pós-graduação em Pesquisa e Desenvolvimento (Biotecnologia Médica) - FMB

Produção de anticorpos monoclonais murinos dirigidos contra antígenos de células-tronco adulta de origem humana e de coelho

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Avaliação de novas propostas em arcabouços tridimencionais (3D) para cultura de células-tronco mesenquinas e condogênese

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Implantes de matrizes de colágeno isoladas ou associadas às células estromais mesenquimais multipotentes autólogas na reparação tendínea em ovinos

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Co-cultivo de embriões bovinos com células-tronco adultas derivadas de tecido adiposo

A produção in vitro de embriões (PIV) é uma biotecnologia utilizada para aumentar o potencial reprodutivo de animais geneticamente superiores, os embriões produzidos in vitro são de qualidade inferior aos produzidos in vivo, por isso técnicas tentam melhorar os índices de embriões produzidos in vitro. Uma técnica é o sistema de co-cultivo com células somáticas que removem metabólitos tóxicos e protegem contra o stress oxidativo. As células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo (CTA) são células multipotentes que segregam fatores de crescimento e citocinas. As células-tronco foram utilizadas em co-cultivo in vitro de embriões bovinos em diferentes concentrações com o objetivo de melhorar o protocolo de PIVE. CTAs foram submetidas à diferenciação em três linhagens mesenquimais, e foi realizada a imunofenotipagem de marcadores específicos de membrana das CTMs. A taxa de clivagem foi avaliada no segundo dia após a fertilização e taxa de blastocistos no sétimo dia, quando foram armazenados para contagem do número total de células e expressão gênica. Os resultados foram analisados por ANOVA, Teste-t e pós-teste de Fisher, adotando um nível de significância de 5%. O tratamento do co-cultivo com CTAs influenciou significativamente a formação de blastocisto, o número total de células de embriões e a expressão gênica correlacionada a pluripotência e metabolismo de carboidratos. Estes resultados mostraram aumento da taxa de produção e qualidade dos embriões produzidos in vitro em co-cultivo com CTAs em relação ao co-cultivo com células da granulosa. Os resultados deste trabalho indicam também que a presença constante de CTAs em co-cultivo é superior ao condicionamento com CTAs. Os efeitos verificados das CTAs podem ocorrer através de fatores solúveis ou via exossomos secretados pelas CTAs. Estudos futuros são necessários para esclarecer a possível via causadora dos efeitos positivos verificados neste trabalho pelas CTAs em co-cultivo.

Reparo de nervo periférico utilizando a veia jugular como tubo assoaciado à cultura de células-tronco extraídas de tecido adiposo. Estudo no rato

Pós-graduação em Bases Gerais da Cirurgia - FMB