La construction de discours d’appartenance identitaire dans la littérature judéenne et chrétienne aux Ier et IIe siècles

Au cours des dernières décennies, la recherche scientifique, toutes disciplines confondues, s’est particulièrement intéressée aux phénomènes et questionnements identitaires, notamment en ce qui concerne les groupes et les mouvements minoritaires ou marginaux, mais également en ce qui concerne la question des identités nationales dont se délectent à leur tour politiciens et médias. Véritable reflet d’un des enjeux majeurs de nos sociétés contemporaines, cet intérêt des chercheurs pour les phénomènes identitaires a particulièrement porté sur l’étude des processus de construction et d’affirmation des identités individuelles et collectives, c’est-à-dire sur les modes et les modalités à partir desquels les identités se construisent, se structurent et sont affirmées dans un rapport comparatif, compétitif et dialogique entre le Soi et l’Autre. Si notre compréhension des phénomènes identitaires s’est considérablement précisée et nuancée depuis la publication dans les années 1950, voire antérieurement, des études fondamentales et fondatrices, il n’en demeure pas moins que le concept d’identité, peu importe les multiples terminologies qu’il peut prendre selon les disciplines, pose actuellement de nombreux problèmes et s’avère abondamment galvaudé par certaines recherches récentes qui en font usage sans nécessairement le définir, voire pire, le maîtriser, comme un champ d’études à la mode qu’il convient d’investir afin d’alimenter un lectorat avide de ces questions et problèmes identitaires. Il est vrai que les travaux scientifiques sur les identités paraissent à un rythme soutenu, voire insoutenable tant cette production est abondante et diversifiée. Tour à tour, les identités ethniques, nationales, provinciales, régionales, politiques, culturelles, religieuses, de genre, des groupes ou mouvements minoritaires et marginaux, pour ne nommer que certains des principaux champs d’investigation, ont été interrogées. Loin de se limiter aux sociétés, aux individus et aux collectivités modernes, les identités du passé, toutes périodes confondues, ont également été revisitées à la lumière des outils d’interprétation développés, entre autres, par la sociologie, par l’anthropologie culturelle et par la psychologie sociale. Bien évidemment, les spécialistes de l’Antiquité n’ont pas échappé à cette tendance, partant à leur tour à la conquête de l’identité (ou des identités) grecque(s), romaine(s), barbare(s), judéenne(s) et chrétienne(s). Leur intérêt s’est également porté sur les identités propres aux diverses catégories ou collectivités sociales, politiques, juridiques, religieuses et professionnelles. Toutefois, aborder la question des identités dans l’Antiquité oblige à délaisser les définitions et compréhensions modernes au profit d’un tout autre mode raisonnement identitaire et d’appartenance propre aux sociétés et collectivités anciennes en prenant en considération les dimensions « – emic » et « – etic » que requiert l’utilisation de cette notion afin d’en avoir recours comme une catégorie d’analyse adéquate pour cette période particulière, une approche double et complémentaire trop souvent négligée par une majorité de recherches dont les résultats aboutissent inévitablement à une compréhension anachronique et « distorsionnée » des réalités anciennes, ce qui est d’autant plus le cas en histoire des religions et des communautés socioreligieuses de l’Antiquité en raison de nombreux présupposés idéologiques et théologiques qui dominent encore tout un pan de l’historiographie actuelle. Bien que le concept même d’identité n’existe pas dans l’Antiquité, le terme « identitas » renvoyant à une tout autre réalité, cela ne signifie pas pour autant que les Anciens n’avaient aucune conscience de leur(s) identité(s) et qu’il est impossible pour nous modernes d’étudier les phénomènes et les discours identitaires antiques. Toutefois, cela impose d’aborder ces phénomènes avec une très grande prudence et beaucoup de nuances en évitant les généralisations hâtives et en circonscrivant bien les contextes d’énonciation dans lesquels ces identités se sont construites et ont été affirmées, car, déterminées par les appartenances, la définition de ces identités s’est constamment élaborée et réélaborée sur un rapport Soi / Autre, inclusion / exclusion et a reposé sur des stratégies discursives qui ont varié selon les époques, les lieux, les auteurs et les contextes d’énonciation. L’enjeu principal est alors de comprendre les stratégies et les mécanismes mis en œuvre par les auteurs anciens dans les processus discursifs de construction identitaire de leur groupe d’appartenance. Produit d’une rhétorique, l’étude des identités anciennes oblige donc de distinguer, ce qui est certes complexe, discours et réalités sociales, du moins cela oblige, encore une fois, à une extrême prudence et beaucoup de nuances afin de ne pas confondre discours et réalités. Si les discours ont effectivement pour effet d’ériger des frontières identitaires fixes et imperméables entre les différents groupes et collectivités, l’étude de la réalité vécue par les acteurs sociaux montre que ces frontières étaient plutôt fluides et perméables. Pour étudier la question des identités dans l’Antiquité, plusieurs postes d’observation peuvent êtres sollicités en s’intéressant, notamment, à la formation des identités, à l’identité en auto-définition, à l’identité dans le miroir de l’Autre, à l’impact des interactions entre le Soi et l’Autre sur les définitions identitaires, aux frontières identitaires et à leurs transgresseurs, aux marqueurs identitaires, etc. Ces différentes approches, notamment lorsqu’elles sont combinées les unes aux autres, contribuent à mettre en évidence la complexité des processus de construction des identités dans l’Antiquité dont on reconnaît désormais le caractère fluide, dynamique et discursif, malgré les idéologies de stabilité sur lesquelles elles se sont élaborées et polémiquées. Loin de susciter de vains débats, les études sur les identités dans l’Antiquité permettent d’aborder sous un angle novateur certains acquis de la recherche et de leur apporter de riches nuances. Cependant, interpréter les phénomènes identitaires anciens à partir de paradigmes, de terminologies et de catégories erronés ou anachroniques a également pour conséquence indéniable de parvenir à une relecture « distorsionnée », si ce n’est orientée, du passé, en lui imposant des catégories de définition et d’auto-définition identitaires qui n’existaient pas dans l’Antiquité. C’est pourquoi il importe également, lorsqu’on tente d’aborder ces phénomènes identitaires, de réfléchir sur les paradigmes, les terminologies et les catégories qui sont invoqués par en parler et ne pas hésiter à les remettre en question en refusant d’adhérer, de manière consciente ou inconsciente, à un quelconque modèle préétabli. S’inscrivant dans ce courant réflexif majeur de l’historiographique actuelle sur l’étude des phénomènes de construction identitaire dans l’Antiquité, notre recherche s’intéresse plus particulièrement aux processus de construction de discours d’appartenance dans la littérature judéenne et chrétienne aux Ier et IIe siècles. Sans avoir cherché à circonscrire une définition unique et unilatérale des identités judéennes et chrétiennes de cette période – définition qui s’avère, selon nous, plus utopique que réaliste en raison de la pluralité des mouvements qui composent le « judaïsme » et le « christianisme » anciens et des auteurs qui ont tenté, par leurs discours, de définir et présenter ces identités – ou tenter d’établir une liste de critères à respecter pour délimiter ce qu’est l’identité judéenne ou chrétienne – et, par conséquent, ceux qui peuvent ou non se réclamer d’être Judéens ou chrétiens –, la perspective que nous adoptons dans cette recherche est plutôt de réfléchir à la manière dont il convient d’aborder les identités anciennes et les processus de construction identitaire dans l’Antiquité. Notre réflexion se veut donc d’abord et avant tout une réflexion méthodologique, épistémologique, terminologique et historiographique des questions et phénomènes identitaires dans l’Antiquité, notamment en ce qui concerne les identités judéennes et chrétiennes des Ier et IIe siècles qui sont abordées à partir de divers postes d’observation et dans une perspective socio-historique qui adopte une démarche « – emic » et « – etic ». Notre recherche est divisée en trois parties. La première sera consacrée aux discussions d’ordre « – etic », c’est-à-dire aux réflexions et aux remarques méthodologiques, épistémologiques, terminologiques et historiographies sur l’approche des phénomènes identitaires et de l’identité chrétienne dans l’Antiquité. Le chapitre I présentera des remarques historiographiques sur les travaux récents en histoire du « christianisme » ancien. Dans le chapitre II, nous discuterons des concepts modernes d’« identité », de « race » et d’« ethnie ». Le chapitre III présentera quelques réflexions épistémologiques et méthodologiques sur l’application des théories et concepts modernes aux réalités antiques dans l’approche des phénomènes identitaires. Finalement, le chapitre IV reviendra sur les différents paradigmes interprétatifs qui ont été utilisés dans le débat moderne sur la question du Parting of the Ways. La deuxième partie sera consacrée à la présentation des cadres contextuels du « judaïsme » et du « christianisme » anciens. Le chapitre V dressera un portrait général de la pluralité qui caractérise le « judaïsme » ancien à la période romaine (Ier – IIe siècles) et des principaux marqueurs identitaires des communautés judéennes de cette époque. Dans le chapitre VI, il sera question de l’origine et de l’expansion du « judaïsme chrétien » dans l’Empire romain (Ier – IIe siècles) de même que de la pluralité des courants chrétiens. La troisième partie abordera la dimension « – emic » de notre recherche en s’intéressant aux processus discursifs de construction de l’identité chrétienne à partir de différents postes d’observation. Le chapitre VII analysera la présentation que l’auteur des Actes des apôtres fait des conditions d’entrée et des premières règles de vie dans la communauté chrétienne. Le chapitre VIII s’intéressera aux enjeux liés à la perception et à la représentation du Soi et de l’Autre en tentant de comprendre comment le mouvement chrétien a tenté de s’auto-définir et comment il a été défini par l’Altérité. Finalement, le chapitre IX analysera la manière dont les auteurs chrétiens se sont approprié le terme « γένος » et comment ils l’ont redéfini sur la base de critères cultuels ou religieux afin de présenter l’originalité distinctive du mouvement chrétien.

Phenotypic heterogeneity of antigen-specific CD4 cells under different conditions of antigen persistence and antigen load

RESUME Nous n'avons pas de connaissance précise des facteurs à l'origine de l'hétérogénéité phénotypique des cellules T CD4 mémoires. Une troisième population phénotypique des cellules T CD4 mémoires, caractérisée par les marqueurs CD45RA+CCR7- a été identifiée dans cette étude. Cette population présente un état de différentiation avancée, comme en témoigne son histoire de réplication, ainsi que sa capacité de prolifération homéostatique. Les réponses des cellules T CD4 mémoires à différentes conditions de persistance et charge antigénique ont trois patterns phénotypiques différents, caractérisés par les marqueurs CD45RA et CCR7. La réponse CD4 mono -phénotypique CD45RA-CCR7+ ou CD45RA- CCR7- est associée à des conditions d'élimination de l'antigène (telle la réponse CD4 tétanos spécifique) ou à des conditions de persistance antigénique et de virémie élevée (telle la réponse HIV chronique ou la primo-infection CMV) respectivement. D'autre part, les réponses T CD4 multi -phénotypiques CD45RA-CCR7+ sont associées à des conditions d'exposition antigénique prolongée et de faible virémie (telles les infections CMV, EBV et HSV ou les infections HIV chez les long term non progressons). La réponse mono -phénotypique CD45RA- CCR7+ est propre aux cellules T CD4 secrétant de IL2, définies également comme centrales mémoires, la réponse CD45RA- CCR7- aux cellules T CD4 secrétant de l'IFNγ et finalement la réponse mufti-phénotypique aux cellules T CD4 secrétant à la fois de l'IL2 et de l' IFNγ. En conclusion, ces résultats témoignent d'une régulation de l'hétérogénéité phénotypique par l'exposition et la charge antigénique. ABSTRACT The factors responsible for the phenotypic heterogeneity of memory CD4 T cells are unclear. In the present study, we have identified a third population of memory CD4 T cells characterized as CD45RA+CCRT that, based on its replication history and the homeostatic proliferative capacity, was at an advanced stage of differentiation. Three different phenotypic patterns of memory CD4 T cell responses were delineated under different conditions of antigen (Ag) persistence and load using CD45RA and CCR7 as markers of memory T cells. Mono-phenotypic CD45RA'CCR7+ or CD45RA'CCR7' CD4 T cell responses were associated with conditions of Ag clearance (tetanus toxoid-specific CD4 T cell response) or Ag persistence and high load (chronic HIV-1 and primary CMV infections), respectively. Multi-phenotypic CD45RA CCR7+, CD45RA'CCRT and CD45RA+CCRT CD4 T cell responses were associated with protracted Ag exposure and low load (chronic CMV, EBV and HSV infections and HIV-1 infection in long-term nonprogressors). The mono-phenotypic CD45RA'CCR7+ response was typical of central memory (TCM) IL-2-secreting CD4 T cells, the mono-phenotypic CD45RA CCRT response of effector memory (TEM) IFN-γ -secreting CD4 T cells and the multi-phenotypic response of both IL-2- and IFN-γ -secreting cells. The present results indicate that the heterogeneity of different Ag-specific CD4 T cell responses is regulated by Ag exposure and Ag load.

Development of a bifunctional CD1d-anti-HER2 scFv fusion molecule to redirect the iNKT cell-mediated immune response to the tumor site

Abstract : Invariant natural killer T lymphocytes (iNKT) are a unique subpopulation of T lymphocytes recognizing glycolipid antigens in the context of the MHC class I-like molecule CD1d. Upon activation with the high affinity ligand α-galactosylceramide (αGalCer), iNKT cells rapidly produce large amounts of the pro-inflammatory cytokine interferon gamma (IFN-γ) and potently activate cells of the innate and adaptive immune response, such as dendritic cells (DCs), NK and T cells. In this context, iNKT cells have been shown to efficiently mediate antitumor activity, and recent research has focused on the manipulation of these cells for antitumor therapies. However, a major drawback of αGalCer as a free drug is that a single injection of this ligand leads to a short-lived iNKT cell activation followed by a long-term anergy, limiting its therapeutic use. In contrast, we demonstrate here that when αGalCer is loaded on a recombinant soluble CD1d molecule (αGalCer/sCD1d), repeated injections lead to a sustained iNKT and NK cell activation associated with IFN-γ secretion as well as with DC maturation. Most importantly, when the αGalCer/sCD1d is fused to an anti-HER2 scFv antibody fragment, potent inhibition of experimental lung metastasis and established subcutaneous tumors is obtained when systemic treatment is started two to seven days after the injection of HER2-expressing B16 melanoma cells, whereas at this time free αGalCer has no effect. The antitumor activity of the sCD1d-anti-HER2 fusion protein is associated with HER2-specific tumor localization and accumulation of iNKT, NK and T cells at the tumor site. Importantly, active T cell immunization combined with the sCD1d-anti-HER2 treatment leads to the accumulation of antigen-specific CD8 T cells exclusively in HER2-expressing tumors, resulting in potent tumor inhibition. In conclusion, sustained activation and tumor targeting of iNKT cells by recombinant αGalCer/sCD1d molecules thus may promote a combined innate and adaptive immune response at the tumor site that may prove to be effective in cancer immunotherapy. RESUME : Les lymphocytes «invariant Natural Killer T » (iNKT) forment une sous-population particulière de lymphocytes T reconnaissant des antigènes glycolipidiques présentés sur la molécule non-polymorphique CD1d, analogue aux protéines du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I. Après activation avec le ligand de haute affinité α-galactosylceramide (αGalCer), les cellules iNKT produisent des grandes quantités de la cytokine pro-inflammatoire interferon gamma (IFN-γ) et activent les cellules du système immunitaire inné et acquis, telles que les cellules dendritiques (DC), NK et T. En conséquence, on a montré que les cellules iNKT exercent des activités anti-tumorales et la recherche s'est intéressée à la manipulation de ces cellules pour développer des thérapies anti-tumorales. Néanmoins, le désavantage majeur de l'αGalCer, injecté seul, est qu'une seule dose de ce ligand aboutit à une activation des cellules iNKT de courte durée suivie par un état anergique prolongé, limitant l'utilisation thérapeutique de ce glycolipide. En revanche, l'étude présentée ici démontre que, si l'αGalCer est chargé sur des molécules récombinantes soluble CD1d (αGalCer/sCDld), des injections répétées aboutissent à une activation prolongée des cellules iNKT et NK associée avec la sécrétion d'IFN-γ et la maturation des cellules DC. Plus important, si on fusionne la molécule αGalCer/sCD1d avec un fragment single-chain (scFv) de l'anticorps anti-HER2, on observe une importante inhibition de métastases expérimentales aux poumons et de tumeurs sous-cutanées même lorsque le traitement systémique est commencé 2 à 7 jours après la greffe des cellules de mélanome B16 transfectées avec l'antigène HER2. Dans les mêmes conditions le traitement avec l'αGalCer seul est inefficace. L'activité anti-tumorale de la protéine sCDld-anti-HER2 est associée à son accumulation spécifique dans des tumeurs exprimant le HER2 ainsi qu'avec une accumulation des cellules iNKT, NK et T à la tumeur. De plus, une immunisation active combinée avec le traitement sCD1d-anti-HER2 aboutit à une accumulation des lymphocytes T CD8 spécifiques de l'antigène d'immunisation, ceci exclusivement dans des tumeurs qui expriment l'antigène HER2. Cette combinaison résulte dans une activité anti-tumeur accrue. En conclusion, l'activation prolongée des cellules iNKT redirigées à la tumeur par des molécules recombinantes αGalCer/sCDld conduit à l'activation de la réponse innée et adaptative au site tumoral, offrant une nouvelle stratégie prometteuse d'immunothérapie contre le cancer. RESUME POUR UN LARGE PUBLIC : Le cancer est une cause majeure de décès dans le monde. Sur un total de 58 millions de décès enregistrés au niveau mondial en 2005, 7,6 millions (soit 13%) étaient dus au cancer. Les principaux traitements de nombreux cancers sont la chirurgie, en association avec la radiothérapie et la chimiothérapie. Néanmoins, ces traitements nuisent aussi aux cellules normales de notre corps et parfois, ils ne suffisent pas pour éliminer définitivement une tumeur. L'immunothérapie est l'une des nouvelles approches pour la lutte contre le cancer et elle vise à exploiter la spécificité du système immunitaire qui peut distinguer des cellules normales et tumorales. Une cellule exprimant un marqueur tumoral (antigène) peut être reconnue par le système immunitaire humoral (anticorps) et/ou cellulaire, induisant une réponse spécifique contre la tumeur. L'immunothérapie peut s'appuyer alors sur la perfusion d'anticorps monoclonaux dirigés contre des antigènes tumoraux, par exemple les anticorps dirigés contre les protéines oncogéniques Her-2/neu dans le cancer du sein. Ces anticorps ont le grand avantage de spécifiquement se localiser à la tumeur et d'induire la lyse ou d'inhiber la prolifération des cellules tumorales exprimant l'antigène. Aujourd'hui, six anticorps monoclonaux non-conjugés sont approuvés en clinique. Cependant l'efficacité de ces anticorps contre des tumeurs solides reste limitée et les traitements sont souvent combinés avec de la chimiothérapie. L'immunothérapie spécifique peut également être cellulaire et exploiter par immunisation active le développement de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) capables de détruire spécifiquement les cellules malignes. De telles «vaccinations »sont actuellement testées en clinique, mais jusqu'à présent elles n'ont pas abouti aux résultats satisfaisants. Pour obtenir une réponse lymphocytaire T cytotoxique antitumorale, la cellule T doit reconnaître un antigène associé à la tumeur, présenté sous forme de peptide dans un complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CHM I). Cependant les cellules tumorales sont peu efficace dans la présentation d'antigène, car souvent elles se caractérisent par une diminution ou une absence d'expression des molécules d'histocompatibilité de classe I, et expriment peu ou pas de molécules d'adhésion et de cytokines costimulatrices. C'est en partie pourquoi, malgré l'induction de fortes réponses CTL spécifiquement dirigés contre des antigènes tumoraux, les régressions tumorales obtenus grâce à ces vaccinations sont relativement rares. Les lymphocytes «invariant Natural Killer T » (iNKT) forment une sous-population particulière de lymphocytes T reconnaissant des antigènes glycolipidiques présentés sur la molécule non-polymorphique CD1d, analogue aux protéines CMH I. Après activation avec le ligand de haute affinité α-galactosylceramide (αGalCer), les cellules iNKT produisent des grandes quantités de la cytokine pro-inflammatoire interferon gamma (IFN-γ) et activent les cellules du système immunitaire inné et acquis, telles que les cellules dendritiques (DC), NK et T. En conséquence, on a montré que les cellules iNKT exercent des activités anti-tumorales et la recherche s'est intéressée à la manipulation de ces cellules pour développer des thérapies anti-tumorales. Néanmoins, le désavantage majeur de l'αGalCer, injecté seul, est qu'une seule dose de ce ligand aboutit à une activation des cellules iNKT de courte durée suivie par un état anergique prolongé, limitant l'utilisation thérapeutique de ce glycolipide. Notre groupe de recherche a donc eu l'idée de développer une nouvelle approche thérapeutique où la réponse immunitaire des cellules iNKT serait prolongée et redirigée vers la tumeur par des anticorps monoclonaux. Concrètement, nous avons produit des molécules récombinantes soluble CD1d (sCD1d) qui, si elles sont chargés avec l'αGalCer (αGalCer/sCDld), aboutissent à une activation prolongée des cellules iNKT et NK associée avec la sécrétion d'IFN-γ et la maturation des cellules DC. Plus important, si la molécule αGalCer/sCD1d est fusionnée avec un fragment single-chain (scFv) de l'anticorps anti-HER2, la réponse immunitaire est redirigée à la tumeur pour autant que les cellules cancéreuses expriment l'antigène HER2. Les molécules αGalCer/sCDld ainsi présentées activent les lymphocytes iNKT. Avec cette stratégie, on observe une importante inhibition de métastases expérimentales aux poumons et de tumeurs sous-cutanées, même lorsque le traitement systémique est commencé 2 à 7 jours après la greffe des cellules de mélanome B16 transfectées avec l'antigène HER2. Dans les mêmes conditions le traitement avec l'αGalCer seul est inefficace. L'activité anti-tumorale de la protéine sCDld-anti-HER2 est associée à son accumulation spécifique dans des tumeurs exprimant le HER2 ainsi qu'avec une accumulation des cellules iNKT, NK et T à la tumeur. En conclusion, l'activation prolongée des cellules iNKT redirigées à la tumeur par des molécules récombinantes αGalCer/sCD1d conduit à l'activation de la réponse innée et adaptative au site tumoral, offrant une nouvelle stratégie prometteuse d'immunothérapie contre le cancer.

HARNESSING iNKT CELLS WITH RECOMBINANT CD1d FUSION PROTEINS TO REDIRECT INNATE AND ADAPTIVE IMMUNITY TO THE TUMOR

Les thérapies du cancer, comme la radiothérapie et la chimiothérapie, sont couramment utilisées mais ont de nombreux effets secondaires. Ces thérapies invasives pour le patient nécessitent d'être améliorées et de nombreuses avancées ont été faites afin d'adapter et de personnaliser le traitement du cancer. L'immunothérapie a pour but de renforcer le système immunitaire du patient et de le rediriger de manière spécifique contre la tumeur. Dans notre projet, nous activons les lymphocytes Invariant Natural Killer T (iNKT) afin de mettre en place une immunothérapie innovatrice contre le cancer. Les cellules iNKT sont une unique sous-population de lymphocytes T qui ont la particularité de réunir les propriétés de l'immunité innée ainsi qu'adaptative. En effet, les cellules iNKT expriment à leur surface des molécules présentes aussi sur les cellules tueuses NK, caractéristique de l'immunité innée, ainsi qu'un récepteur de cellules T (TCR) qui représente l'immunité adaptative. Les cellules iNKT reconnaissent avec leur TCR des antigènes présentés par la molécule CD1d. Les antigènes sont des protéines, des polysaccharides ou des lipides reconnus par les cellules du système immunitaire ou les anticorps pour engendrer une réponse immunitaire. Dans le cas des cellules iNKT, l'alpha-galactosylceramide (αGC) est un antigène lipidique fréquemment utilisé dans les études cliniques comme puissant activateur. Après l'activation des cellules iNKT avec l'αGC, celles-ci produisent abondamment et rapidement des cytokines. Ces cytokines sont des molécules agissant comme des signaux activateurs d'autres cellules du système immunitaire telles que les cellules NK et les lymphocytes T. Cependant, les cellules iNKT deviennent anergiques après un seul traitement avec l'αGC c'est à dire qu'elles ne peuvent plus être réactivées, ce qui limite leur utilisation dans l'immunothérapie du cancer. Dans notre groupe, Stirnemann et al ont publié une molécule recombinante innovante, composée de la molécule CD1d soluble et chargée avec le ligand αGC (αGC/sCD1d). Cette protéine est capable d'activer les cellules iNKT tout en évitant l'anergie. Dans le système immunitaire, les anticorps sont indispensables pour combattre une infection bactérienne ou virale. En effet, les anticorps ont la capacité de reconnaître et lier spécifiquement un antigène et permettent l'élimination de la cellule qui exprime cet antigène. Dans le domaine de l'immunothérapie, les anticorps sont utilisés afin de cibler des antigènes présentés seulement par la tumeur. Ce procédé permet de réduire efficacement les effets secondaires lors du traitement du cancer. Nous avons donc fusionné la protéine recombinante αGC/CD1d à un fragment d'anticorps qui reconnaît un antigène spécifique des cellules tumorales. Dans une étude préclinique, nous avons démontré que la protéine αGC/sCD1d avec un fragment d'anticorps dirigé contre la tumeur engendre une meilleure activation des cellules iNKT et entraîne un effet anti-tumeur prolongé. Cet effet anti-tumeur est augmenté comparé à une protéine αGC/CD1d qui ne cible pas la tumeur. Nous avons aussi montré que l'activation des cellules iNKT avec la protéine αGC/sCD1d-anti-tumeur améliore l'effet anti- tumoral d'un vaccin pour le cancer. Lors d'expériences in vitro, la protéine αGC/sCD1d-anti- tumeur permet aussi d'activer les cellules humaines iNKT et ainsi tuer spécifiquement les cellules tumorales humaines. La protéine αGC/sCD1d-anti-tumeur représente une alternative thérapeutique prometteuse dans l'immunothérapie du cancer. - Les cellules Invariant Natural Killer T (iNKT), dont les effets anti-tumoraux ont été démontrés, sont de puissants activateurs des cellules Natural Killer (NK), des cellules dendritiques (DC) et des lymphocytes T. Cependant, une seule injection du ligand de haute affinité alpha-galactosylceramide (αGC) n'induit une forte activation des cellules iNKT que durant une courte période. Celle-ci est alors suivie d'une longue phase d'anergie, limitant ainsi leur utilisation pour la thérapie. Comme alternative prometteuse, nous avons montré que des injections répétées d'αGC chargé sur une protéine recombinante de CD1d soluble (αGC/sCD1d) chez la souris entraînent une activation prolongée des cellules iNKT, associée à une production continue de cytokine. De plus, le maintien de la réactivité des cellules iNKT permet de prolonger l'activité anti-tumorale lorsque la protéine αGC/sCD1d est fusionnée à un fragment d'anticorps (scFv) dirigé contre la tumeur. L'inhibition de la croissance tumorale n'est optimale que lorsque les souris sont traitées avec la protéine αGC/sCD1d-scFv ciblant la tumeur, la protéine αGC/sCD1d-scFv non-appropriée étant moins efficace. Dans le système humain, les protéines recombinantes αGC/sCD1d-anti-HER2 et anti-CEA sont capables d'activer et de faire proliférer des cellules iNKT à partir de PBMCs issues de donneurs sains. De plus, la protéine αGC/sCD1d-scFv a la capacité d'activer directement des clones iNKT humains en l'absence de cellules présentatrices d'antigènes (CPA), contrairement au ligand αGC libre. Mais surtout, la lyse des cellules tumorales par les iNKT humaines n'est obtenue que lorsqu'elles sont incubées avec la protéine αGC/sCD1d-scFv anti- tumeur. En outre, la redirection de la cytotoxicité des cellules iNKT vers la tumeur est supérieure à celle obtenue avec une stimulation par des CPA chargées avec l'αGC. Afin d'augmenter les effets anti-tumoraux, nous avons exploité la capacité des cellules iNKT à activer l'immunité adaptive. Pour ce faire, nous avons combiné l'immunothérapie NKT/CD1d avec un vaccin anti-tumoral composé d'un peptide OVA. Des effets synergiques ont été obtenus lorsque les traitements avec la protéine αGC/sCD1d-anti-HER2 étaient associés avec le CpG ODN comme adjuvant pour la vaccination avec le peptide OVA. Ces effets ont été observés à travers l'activation de nombreux lymphocytes T CD8+ spécifique de la tumeur, ainsi que par la forte expansion des cellules NK. Les réponses, innée et adaptive, élevées après le traitement avec la protéine αGC/sCD1d-anti-HER2 combinée au vaccin OVA/CpG ODN étaient associées à un fort ralentissement de la croissance des tumeurs B16- OVA-HER2. Cet effet anti-tumoral corrèle avec l'enrichissement des lymphocytes T CD8+ spécifiques observé à la tumeur. Afin d'étendre l'application des protéines αGC/sCD1d et d'améliorer leur efficacité, nous avons développé des fusions CD1d alternatives. Premièrement, une protéine αGC/sCD1d dimérique, qui permet d'augmenter l'avidité de la molécule CD1d pour les cellules iNKT. Dans un deuxième temps, nous avons fusionné la protéine αGC/sCD1d avec un scFv dirigé contre le récepteur 3 du facteur de croissance pour l'endothélium vasculaire (VEGFR-3), afin de cibler l'environnement de la tumeur. Dans l'ensemble, ces résultats démontrent que la thérapie médiée par la protéine recombinante αGC/sCD1d-scFv est une approche prometteuse pour rediriger l'immunité innée et adaptive vers le site tumoral. - Invariant Natural Killer T cells (iNKT) are potent activators of Natural Killer (NK), dendritic cells (DC) and T lymphocytes, and their anti-tumor activities have been well demonstrated. However, a single injection of the high affinity CD1d ligand alpha-galactosylceramide (αGC) leads to a strong but short-lived iNKT cell activation followed by a phase of long-term anergy, limiting the therapeutic use of this ligand. As a promising alternative, we have demonstrated that when αGC is loaded on recombinant soluble CD1d molecules (αGC/sCD1d), repeated injections in mice led to the sustained iNKT cell activation associated with continued cytokine secretion. Importantly, the retained reactivity of iNKT cell led to prolonged antitumor activity when the αGC/sCD1d was fused to an anti-tumor scFv fragments. Optimal inhibition of tumor growth was obtained only when mice were treated with the tumor-targeted αGC/CD1d-scFv fusion, whereas the irrelevant αGC/CD1d-scFv fusion was less efficient. When tested in a human system, the recombinant αGC/sCD1d-anti-HER2 and -anti-CEA fusion proteins were able to expand iNKT cells from PBMCs of healthy donors. Furthermore, the αGC/sCD1d-scFv fusion had the capacity to directly activate human iNKT cells clones without the presence of antigen-presenting cells (APCs), in contrast to the free αGC ligand. Most importantly, tumor cell killing by human iNKT cells was obtained only when co- incubated with the tumor targeted sCD1d-antitumor scFv, and their direct tumor cytotoxicity was superior to the bystander killing obtained with αGC-loaded APCs stimulation. To further enhance the anti-tumor effects, we exploited the ability of iNKT cells to transactivate the adaptive immunity, by combining the NKT/CD1d immunotherapy with a peptide cancer vaccine. Interestingly, synergistic effects were obtained when the αGC/sCD1d- anti-HER2 fusion treatment was combined with CpG ODN as adjuvant for the OVA peptide vaccine, as seen by higher numbers of activated antigen-specific CD8 T cells and NK cells, as compared to each regimen alone. The increased innate and adaptive immune responses upon combined tumor targeted sCD1d-scFv treatment and OVA/CpG vaccine were associated with a strong delay in B16-OVA-HER2 melanoma tumor growth, which correlated with an enrichment of antigen-specific CD8 cells at the tumor site. In order to extend the application of the CD1d fusion, we designed alternative CD1d fusion proteins. First, a dimeric αGC/sCD1d-Fc fusion, which permits to augment the avidity of the CD1d for iNKT cells and second, an αGC/sCD1d fused to an anti vascular endothelial growth factor receptor-3 (VEGFR-3) scFv, in order to target tumor stroma environment. Altogether, these results demonstrate that the iNKT-mediated immunotherapy via recombinant αGC/sCD1d-scFv fusion is a promising approach to redirect the innate and adaptive antitumor immune response to the tumor site.

Multiple paternity and its consequences in the white campion " Silene latifolia "

Summary Several studies have demonstrated that the number of pollen donors siring seeds of individual fruits is frequently greater than one and, consequently, that plants have multiple mates. Multiple paternity can have important consequences at the population level. It influences the genetic variability of a population, the reproductive success of males and the fitness of females and future generations. It also influences male-male interactions for fertilization and it is fundamental in providing opportunity of female choice. I investigated the occurrence and the importance of multiple paternity within fruits in natural populations of the dioecious Silene latifolia using microsatellite DNA markers, especially developed for this study. I found that multiple paternity occurs in all populations investigated in the European range of the species, varying from one to nine sires per fruit with a mean of three, suggesting that multiple paternity is highly prevalent in natural populations. In the presence of multiple paternity I investigated if there was a female genotype influence on siring success of the males. I used the same pollen mixture from two males and applied it to three replicate females of different relatedness (two full sisters and one unrelated). I found female genotype influence in one of the two populations investigated, which might reflect different population history. Since these results suggested some degree of female choice, we investigated whether the occurrence of multiple paternity and post-pollination selection could provide opportunity for inbreeding avoidance. First, I measured inbreeding depression at different life-cycle stages for offspring obtained by single-donor crosses with brothers or unrelated males replicated on distinct flowers on the same female plant. To address inbreeding avoidance, I determined paternity in crosses using mixed pollen loads of the two males. I found significant inbreeding depression in the studied population, even under benign experimental conditions, and although the unrelated male did not sire significantly more offspring, there was an effect of genetic dissimilarity on paternity. This suggests that paternity is affected by relatedness among mates, but maybe additionally affected by other factors such as pollen competitive ability or male-female interactions. Using inbred and outbred crosses, I further investigated sex ratio bias inheritance in this species, and found that sex ratio bias of the parental generation was significantly correlated to pollen germination success of the F2 generation, which suggests that sex ratio bias in this species results from the specific X/Y combination and not only on Y performance. An effect of X and Y is consistent with sex chromosome meiotic drive. In conclusion, I found multiple paternity to be widespread in the study species and that females of similar genotype produce similar paternity shares. I found that inbreeding depression is substantial, therefore receiving pollen from several donors might lead to fewer inbred offspring, I also found an effect of genetic dissimilarity on paternity shares, which indicates that there is some ability to discriminate against related pollen, although this seems not to be the only determinant of paternity outcome. Finally I found sex ratio bias to be dependent on both X and Y chromosomes as predicted by sex chromosome meiotic drive. Résumé Plusieurs études ont démontré qu'il n'était pas rare que les graines contenues dans un même fruit soient issues de la fécondation par plusieurs pollens provenant de mâles différents, ce qui sous-entend que les plantes peuvent avoir plusieurs partenaires sexuels. La paternité multiple peut avoir d'importantes conséquences au niveau populationnel dans la mesure où elle peut influencer le degré de variabilité génétique de la population, le succès reproducteur des mâles, la fitness des femelles et des futures générations. La paternité multiple peut également avoir un impact sur les interactions mâle-mâle lors de la fertilisation et peut être considérée comme fondamentale vis-à-vis de la femelle, qui y trouve alors une opportunité de choisir son ou ses partenaires. Dans le cadre de ce travail de thèse j'ai cherché à déterminer si la paternité multiple était un phénomène observable et important dans les populations naturelles de l'espèce dioïque, Silene latifolia. Pour ce faire, j'ai utilisé des marqueurs microsatellites, spécialement développés pour cette étude. J'ai observé des phénomènes de paternité multiple dans toutes les populations de l'étude, réparties dans l'aire de distribution européenne de l'espèce. Le nombre de pères par fruit varie de un à neuf, avec un nombre moyen de trois, ce qui signifie que la paternité multiple est très répandue dans les populations naturelles. En raison de ces résultats, je me suis demandée si le génotype de la femelle influence le succès de paternité des mâles. J'ai alors réalisé des pollinisations manuelles sur la base d'un mélange de pollens issus de deux mâles, que j'ai appliqué sur trois femelles (réplicats) présentant différents degrés d'apparentement (deux soeurs. et une femelle étrangère). Il ressort de cette expérience que le génotype de la femelle peut influencer la paternité dans l'une des deux populations étudiées, ce qui pourrait refléter des différences en terme d'histoire des populations. Dans la mesure où ces résultats suggèrent un certain degré de choix chez la femelle, j'ai cherché à savoir si la paternité multiple et la sélection post-pollinisation pouvaient être des moyens d'éviter les croisements consanguins. Dans un premier temps, j'ai évalué la dépression de consanguinité à différentes étapes du cycle de vie chez des descendants issus de croisements à un seul donneur, celui-ci étant alternativement un frère ou un étranger, répliqués sur plusieurs fleurs d'une même plante femelle. Afin d'estimer l'évitement de croisements consanguins, j'ai effectué des croisements dont le pollen était un mélange des deux mâles (frère et étranger), puis j'ai déterminé la paternité dans les fruits obtenus. J'ai pu mettre en évidence un effet de dépression de consanguinité- significatif dans les populations étudiées, même dans des conditions expérimentales moins rudes qu'à l'extérieur. Bien que le mâle étranger n'ait pas engendré un nombre significativement plus important de graines, il y avait un effet de dissimilarité génétique sur la paternité. Ceci suggère que la paternité est affectée par le degré d'apparentement entre les partenaires, mais qu'elle peut aussi être affectée par d'autres facteurs tels que la compétitivité du pollen ou encore par les interactions mâles-femelles. L'utilisation de croisements consanguins et hybrides m'a également permis d'étudier l'héritabilité du biais de sex ratio chez cette espèce. Il s'est avéré que le biais de sex ratio de la génération parentale était significativement corrélé au succès de germination du pollen de la génération F2, ce qui signifie que, chez cette espèce, le biais de sex ratio résulte d'une combinaison spécifique de X/Y et non uniquement de la performance de Y. Un effet de X et Y est compatible avec l'hypothèse de distorsion de ségrégation méiotique des chromosomes sexuels. En conclusion, il ressort de mes résultats que la paternité multiple est un phénomène largement répandu chez S. latifolia et la paternité accomplie par un mâle est plus similaire entre soeurs qu'avec une femelle étrangère J'ai également mis en évidence que la dépression de consanguinité a un impact considérable; aussi, recevoir du pollen de plusieurs donneurs différents pourrait permettre à la femelle de produire moins de descendants consanguins. J'ai aussi trouvé un effet de la dissimilarité génétique sur le partage de paternité, ce qui indique que la discrimination contre le pollen d'apparentés est possible, bien que cela ne semble pas être le seul facteur déterminant dans le résultat de la paternité. Enfin, j'ai trouvé que le biais de sex ratio est dépendant des deux chromosomes X et Y, conformément à la théorie de distorsion de ségrégation méiotique des chromosomes sexuels.

Imagerie par DXA: le couteau suisse multifonction [DXA imaging: the multifunction Swiss army knife?].

Les importants progrès dans la qualité et la résolution des images obtenues par «absorptiométrie biphotonique à rayons X» ou DXA ont amélioré certaines modalités existantes et favorisé le développement de nouvelles fonctions permettant d'affiner de manière significative la prise en charge de nos patients dans diverses pathologies. On peut par exemple améliorer la prédiction du risque fracturaire par l'analyse indirecte de la micro et de la macroarchitecture osseuse, rechercher les marqueurs de pathologies associées (recherche de fractures vertébrales ou de fractures fémorales atypiques), ou évaluer le statut métabolique par la mesure de la composition corporelle. Avec les appareils DXA les plus performants, on pourra bientôt déterminer l'âge osseux, estimer le risque cardiovasculaire (par la mesure de la calcification de l'aorte abdominale), ou prédire la progression de l'arthrose articulaire et son évolution après la prise en charge chirurgicale dans la routine clinique. The significant progress on the quality and resolution of the images obtained by "Dual X-ray Absorptiometry" or DXA has permitted on one hand to improve some existing features and on the other to develop new ones, significantly refining the care of our patients in various pathologies. For example, by improving the prediction of fracture risk by indirect analysis of micro- and macro-architecture of the bone, by looking for markers of associated bone diseases (research vertebral fractures or atypical femoral fractures), or by assessing the metabolic status by the measurement of body composition. With the best performing DXA devices we will soon be able, in clinical routine, to determine bone age, to estimate cardiovascular risk (by measuring the calcification of the abdominal aorta) or to predict the progression of joint osteoarthritis and its evolution after surgical management.

Vieillissement vasculaire chez des patients athérosclérotiques: Sénescence prématurée des cellules endothéliales?

La dysfonction de l’endothélium vasculaire, associée à une diminution de ses propriétés vasorelaxantes et anti-thrombogéniques, survient avec le vieillissement mais également chez de plus jeunes patients athérosclérotiques présentant plusieurs facteurs de risque cardiovasculaire. Au niveau cellulaire, le vieillissement des cellules endothéliales (CE) mène à un état irréversible de non division cellulaire appelé sénescence. Ces cellules sénescentes présentent des changements spécifiques au niveau de leur morphologie et de l’expression génique, menant à leur dysfonction. La sénescence dite réplicative est déclenchée par le raccourcissement des télomères survenant à chaque division cellulaire, mais peut également être induite prématurément par le stress oxydant (SIPS). L’objectif principal de cette étude est de caractériser la sénescence de CE vasculaires isolées à partir de patients athérosclérotiques, et d’observer l’impact des facteurs de risque sur cette sénescence. Afin de confirmer la contribution des deux principales voies de la sénescence, nous avons par la suite étudié conjointement ou séparément, l’impact d’un traitement chronique avec un antioxydant sur la sénescence de CE, et d’une surexpression de la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT), une enzyme responsable de l’allongement des télomères. Nous avons isolé et cultivé des CE provenant d’artères mammaires internes prélevées lors de pontages coronariens. Selon les études, les cellules ont été infectées ou non avec un lentivirus surexprimant la hTERT, et cultivées in vitro jusqu’à sénescence, en présence ou en absence de l’antioxydant N-acétyl-L-cystéine (NAC). Différents marqueurs des deux principales voies de la sénescence (réplicative ou SIPS) ont été quantifiés. La sénescence cellulaire se développe exponentiellement avec le temps et est associée à une réduction de la viabilité et de la prolifération cellulaires. Chez les patients athérosclérotiques, le vieillissement des CE passe par les deux principales voies de la sénescence : des télomères courts initialement en culture et la durée d’exposition in vivo aux facteurs de risque cardiovasculaire prédisent une apparition prématurée de la sénescence. Toutefois, chez les fumeurs, la sénescence est exclusivement du type SIPS. Ces facteurs de risque cardiovasculaire et principalement l’hypertension, semblent accélèrer le vieillissement biologique et favoriser la dysfonction des CE. Lorsque traitées chroniquement avec le NAC, les CE présentant initialement de moindres dommages cellulaires et moléculaires ainsi qu’une meilleure défense antioxydante développent une sénescence retardée. Lorsque le NAC est combiné à une surexpression de la hTERT, les deux voies de la sénescence sont bloquées et une immortalisation cellulaire est observée. À l’inverse, dans les CE les plus endommagées par les ROS in vivo, le NAC n’a aucun effet sur le développement de la sénescence, la hTERT, seule ou en combinaison avec le NAC, retarde légèrement la sénescence mais aucune immortalisation n’est observée lorsque ces traitements sont combinés. En conclusion, nos études démontrent que l’exposition chronique au stress oxydant associé aux facteurs de risque cardiovasculaire accélère le développement de la sénescence de CE vasculaires, contribuant potentiellement à l’athérogénèse. Dans les cellules de patients athérosclérotiques, il semble exister un seuil de dommages cellulaires et moléculaires subis in vivo au-delà duquel, aucun traitement (antioxydant ou hTERT) ne peut être bénéfique.

Caractérisation électro-clinique des convulsions fébriles et risque d’épilepsie

Environ 2-3% d’enfants avec convulsions fébriles (CF) développent une épilepsie, mais les outils cliniques existants ne permettent pas d’identifier les enfants susceptibles de développer une épilepsie post-convulsion fébrile. Des études ont mis en évidence des anomalies d’EEG quantifiée, et plus particulièrement en réponse à la stimulation lumineuse intermittente (SLI), chez des patients épileptiques. Aucune étude n’a analysé ces paramètres chez l’enfant avec CF et il importe de déterminer s’ils sont utiles pour évaluer le pronostic des CF. Les objectifs de ce programme de recherche étaient d’identifier, d’une part, des facteurs de risque cliniques qui déterminent le développement de l’épilepsie après des CF et, d’autre part, des marqueurs électrophysiologiques quantitatifs qui différencieraient les enfants avec CF des témoins et pourraient aider à évaluer leur pronostic. Afin de répondre à notre premier objectif, nous avons analysé les dossiers de 482 enfants avec CF, âgés de 3 mois à 6 ans. En utilisant des statistiques de survie, nous avons décrit les facteurs de risque pour développer une épilepsie partielle (antécédents prénataux, retard de développement, CF prolongées et focales) et généralisée (antécédents familiaux d’épilepsie, CF récurrentes et après l’âge de 4 ans). De plus, nous avons identifié trois phénotypes cliniques distincts ayant un pronostic différent : (i) CF simples avec des antécédents familiaux de CF et sans risque d’épilepsie ultérieure; (ii) CF récurrentes avec des antécédents familiaux d’épilepsie et un risque d’épilepsie généralisée; (iii) CF focales avec des antécédents familiaux d’épilepsie et un risque d’épilepsie partielle. Afin de répondre à notre deuxième objectif, nous avons d’abord analysé les potentiels visuels steady-state (PEVSS) évoqués par la SLI (5, 7,5, 10 et 12,5 Hz) en fonction de l’âge. Le tracé EEG de haute densité (128 canaux) a été enregistré chez 61 enfants âgés entre 6 mois et 16 ans et 8 adultes normaux. Nous rapportons un développement topographique différent de l’alignement de phase des composantes des PEVSS de basses (5-15 Hz) et de hautes (30-50 Hz) fréquences. Ainsi, l’alignement de phase des composantes de basses fréquences augmente en fonction de l’âge seulement au niveau des régions occipitale et frontale. Par contre, les composantes de hautes fréquences augmentent au niveau de toutes les régions cérébrales. Puis, en utilisant cette même méthodologie, nous avons investigué si les enfants avec CF présentent des anomalies des composantes gamma (50-100 Hz) des PEVSS auprès de 12 cas de CF, 5 frères et sœurs des enfants avec CF et 15 témoins entre 6 mois et 3 ans. Nous montrons une augmentation de la magnitude et de l’alignement de phase des composantes gamma des PEVSS chez les enfants avec CF comparés au groupe témoin et à la fratrie. Ces travaux ont permis d’identifier des phénotypes électro-cliniques d’intérêt qui différencient les enfants avec CF des enfants témoins et de leur fratrie. L’étape suivante sera de vérifier s’il y a une association entre les anomalies retrouvées, la présentation clinique et le pronostic des CF. Cela pourrait éventuellement aider à identifier les enfants à haut risque de développer une épilepsie et permettre l’institution d’un traitement neuroprotecteur précoce.

Mécanismes de plasticité synaptique dans l’amygdale lors de la réactivation de la mémoire de peur auditive chez le rat : interaction dynamique des récepteurs NMDA et AMPA

La plasticité synaptique est une propriété indispensable à l’acquisition de la mémoire chez toutes les espèces étudiées, des invertébrés aux primates. La formation d’une mémoire débute par une phase de plasticité qui inclut une restructuration synaptique ; ensuite elle se poursuit par la consolidation de ces modifications, contribuant à la mémoire à long terme. Certaines mémoires redeviennent malléables lorsqu’elles sont rappelées. La trace mnésique entre alors dans une nouvelle de phase de plasticité, au cours de laquelle certaines composantes de la mémoire peuvent être mises à jour, puis reconsolidées. L’objectif de la présente thèse est d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sont activés lors du rappel d’une mémoire. Nous avons utilisé un modèle de conditionnement Pavlovien, combiné à l’administration d’agents pharmacologiques et à l’analyse quantitative de marqueurs de plasticité synaptique, afin d’étudier la dynamique de la mémoire de peur auditive chez des rats Sprague Dawley. La circuiterie neuronale et les mécanismes associatifs impliqués dans la neurobiologie de cette mémoire sont bien caractérisés, en particulier le rôle des récepteurs glutamatergiques de type NMDA et AMPA dans la plasticité synaptique et la consolidation. Nos résultats démontrent que le retour de la trace mnésique à un état de labilité nécessite l’activation des récepteurs NMDA dans l’amygdale baso-latérale à l’instant même du rappel, alors que les récepteurs AMPA sont requis pour l’expression comportementale de la réponse de peur conditionnée. D’autre part, les résultats identifient le rappel comme une phase bien plus dynamique que présumée, et suggèrent que l’expression de la peur conditionnée mette en jeu la régulation du trafic des récepteurs AMPA par les récepteurs NMDA. Le présent travail espère contribuer à la compréhension de la neurobiologie fondamentale de la mémoire. De plus, il propose une intégration des résultats aux modèles animaux d’étude des troubles psychologiques conséquents aux mémoires traumatiques chez l’humain, tels que les phobies et les syndromes de stress post-traumatiques.

« Accommodements raisonnables » pour motif religieux : étude d’un débat public

Ce mémoire porte sur la polémique qui a eu lieu au Québec entre mars 2006 et décembre 2007 autour des pratiques d’« accommodements raisonnables » pour motif religieux. À partir d’une approche compréhensive et d’un cadre théorique propre à la sociologie des relations ethniques, il propose une analyse qualitative de lettres d’opinion publiées dans des quotidiens québécois. Une première analyse, thématique, a permis de constituer des registres argumentaires dans lesquels ont puisé les participants au débat public sur les « accommodements raisonnables » par le biais de lettres d’opinion. Une seconde analyse, comparative, a permis de construire des figures d’intervenants du débat public qui témoignent non seulement des forces idéologiques qui se sont affrontées dans le débat public, mais également de leur positionnement au croisement des axes saillants de la différenciation sociale dans cette polémique Les résultats de ces analyses suggèrent d’abord que la polémique résulte d’un conflit entre marqueurs identitaires devant servir au positionnement des frontières ethniques, et ensuite que la polémique des « accommodements raisonnables » a donné lieu à une reconfiguration des rapports ethniques au Québec, attribuable à la dissociation entre le conflit entre deux nations et celui sur les critères d’inclusion à la nation.

Brain tumor and brain endothelial cells' response to ionizing radiation and phytochemical treatments

Le glioblastome multiforme (GBM) représente la tumeur cérébrale primaire la plus agressive et la plus vascularisée chez l’adulte. La survie médiane après le diagnostic est de moins d’un an en l’absence de traitement. Malheureusement, 90% des patients traités avec de la radiothérapie après la résection chirurgicale d’un GBM développent une récidive tumorale. Récemment, le traitement des GBM avec radiothérapie et témozolomide, un agent reconnu pour ses propriétés antiangiogéniques, a permis de prolonger la survie médiane à 14,6 mois. Des efforts sont déployés pour identifier des substances naturelles capables d’inhiber, de retarder ou de renverser le processus de carcinogenèse. Epigallocatechin-3-gallate (EGCG), un polyphénol retrouvé dans le thé vert, est reconnu pour ses propriétés anticancéreuses et antiangiogéniques. L’EGCG pourrait sensibiliser les cellules tumorales cérébrales et les cellules endothéliales dérivées des tumeurs aux traitements conventionnels. Le chapitre II décrit la première partie de ce projet de doctorat. Nous avons tenté de déterminer si l’EGCG pourrait sensibiliser la réponse des GBM à l’irradiation (IR) et si des marqueurs moléculaires spécifiques sont impliqués. Nous avons documenté que les cellules U-87 étaient relativement radiorésistantes et que Survivin, une protéine inhibitrice de l’apoptose, pourrait être impliquée dans la radiorésistance des GBM. Aussi, nous avons démontré que le pré-traitement des cellules U-87 avec de l’EGCG pourrait annuler l’effet cytoprotecteur d’une surexpression de Survivin et potentialiser l’effet cytoréducteur de l’IR. Au chapitre III, nous avons caractérisé l’impact de l’IR sur la survie de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales humaines (HBMEC) et nous avons déterminé si l’EGCG pouvait optimiser cet effet. Bien que les traitements individuels avec l’EGCG et l’IR diminuaient la survie des HBMEC, le traitement combiné diminuait de façon synergique la survie cellulaire. Nous avons documenté que le traitement combiné augmentait la mort cellulaire, plus spécifiquement la nécrose. Au chapitre IV, nous avons investigué l’impact de l’IR sur les fonctions angiogéniques des HBMEC résistantes à l’IR, notamment la prolifération cellulaire, la migration cellulaire en présence de facteurs de croissance dérivés des tumeurs cérébrales, et la capacité de tubulogenèse. La voie de signalisation des Rho a aussi été étudiée en relation avec les propriétés angiogéniques des HBMEC radiorésistantes. Nos données suggèrent que l’IR altère significativement les propriétés angiogéniques des HBMEC. La réponse aux facteurs importants pour la croissance tumorale et l’angiogenèse ainsi que la tubulogenèse sont atténuées dans ces cellules. En conclusion, ce projet de doctorat confirme les propriétés cytoréductrices de l’IR sur les gliomes malins et propose un nouveau mécanisme pour expliquer la radiorésistance des GBM. Ce projet documente pour la première fois l’effet cytotoxique de l’IR sur les HBMEC. Aussi, ce projet reconnaît l’existence de HBMEC radiorésistantes et caractérise leurs fonctions angiogéniques altérées. La combinaison de molécules naturelles anticancéreuses et antiangiogéniques telles que l’EGCG avec de la radiothérapie pourrait améliorer l’effet de l’IR sur les cellules tumorales et sur les cellules endothéliales associées, possiblement en augmentant la mort cellulaire. Cette thèse supporte l’intégration de nutriments avec propriétés anticancéreuses et antiangiogéniques dans le traitement des gliomes malins pour sensibiliser les cellules tumorales et endothéliales aux traitements conventionnels.

The Origin and Stimuli Implicated in the Expression of Nestin(+) Cardiac Myocyte-like Cells in the Ischemic Heart

Nos études ont démontrées que la formation de la cicatrice et la guérison sont associées avec l’apparition de cellules de type myocytes cardiaques nestine(+) dans la région péri-infarcie. Présentement, l’étude examine le mécanisme, tel que l’hypoxie ou les hormones neuronales, possiblement impliqué dans leur recrutement et de dévoiler leur origine cellulaire. La présence de ces cellules a été détectée dans les coeurs infarcies d’une semaine et maintenue après neuf mois suite à une sujétion coronaire complète. Aussi, ces cellules de type myocytes cardiaques nestine(+) ont été observées dans le coeur infarci humain. L’hypoxie représente un événement prédominant suite à un infarctus de myocarde, mais l’exposition des rats normaux à un environnement hypoxique n’a pas pu promouvoir l’apparition de ces cellules. Autrement, l’infusion de l’agoniste -adrénergique non-sélectif isoprotérénol (ISO) dans les rats adultes Sprague-Dawley a augmenté la protéine nestine dans le ventricule gauche et a été associé avec la réapparition de cellules de type myocytes cardiaques nestine(+). Cela représente possiblement un effet secondaire suite à la nécrose des myocytes cardiaques par l’administration d’isoprotérénol. Dernièrement, on a identifié une sous-population de cellules nestine(+) dans le coeur normal du rat qui co-exprime les marqueurs de cellules cardiaques progénitrices Nkx-2.5 et GATA-4. Cette sous-population de cellules nestine/Nkx-2.5/GATA-4 pourrait représenter des substrats cellulaires qui puissent se différentier en cellules de type myocytes cardiaques nestine(+) suite à une ischémie. Mots clés: nestine, isoprotérénol, nécrose, cellule souche, cellule progénitrice, myocyte cardiaque

Mutagénèse semi-aléatoire au site actif de la DHFR humaine : création et caractérisation de variantes hautement résistantes au MTX.

La dihydrofolate réductase humaine (DHFRh) est une enzyme essentielle à la prolifération cellulaire. Elle réduit le dihydrofolate en tétrahydrofolate, un co-facteur impliqué dans la biosynthèse des purines et du thymidylate. La DHFRh est une cible de choix pour des agents de chimiothérapie comme le méthotrexate (MTX), inhibant spécifiquement l’enzyme ce qui mène à un arrêt de la prolifération et ultimement à la mort cellulaire. Le MTX est utilisé pour le traitement de plusieurs maladies prolifératives, incluant le cancer. La grande utilisation du MTX dans le milieu clinique a mené au développement de mécanismes de résistance, qui réduisent l’efficacité de traitement. La présente étude se penche sur l’un des mécanismes de résistance, soit des mutations dans la DHFRh qui réduisent son affinité pour le MTX, dans le but de mieux comprendre les éléments moléculaires requis pour la reconnaissance de l’inhibiteur au site actif de l’enzyme. En parallèle, nous visons à identifier des variantes plus résistantes au MTX pour leur utilisation en tant que marqueurs de sélection en culture cellulaire pour des systèmes particuliers, tel que la culture de cellules hématopoïétiques souches (CHS), qui offrent des possibilités intéressantes dans le domaine de la thérapie cellulaire. Pour étudier le rôle des différentes régions du site actif, et pour vérifier la présence d’une corrélation entre des mutations à ces régions et une augmentation de la résistance au MTX, une stratégie combinatoire a été dévelopée pour la création de plusieurs banques de variantes à des résidus du site actif à proximité du MTX lié. Les banques ont été sélectionnées in vivo dans un système bactérien en utilisant des milieux de croissance contenant des hautes concentrations de MTX. La banque DHFRh 31/34/35 généra un nombre considérable de variantes combinatoires de la DHFRh hautement résistantes au MTX. Les variantes les plus intéressantes ont été testées pour leur potentiel en tant que marqueur de sélection dans plusieurs lignées cellulaires, dont les cellules hématopoïétiques transduites. Une protection complète contre les effets cytotoxiques du MTX a été observée chez ces cellules suite à leur infection avec les variantes combinatoires. Pour mieux comprendre les causes moléculaires reliées à la résistance au MTX, des études de structure tridimensionnelle de variantes liées au MTX ont été entreprises. La résolution de la structure de la double variante F31R/Q35E lié au MTX a révélé que le phénotype de résistance était attribuable à d’importantes différences entre le site actif de la double variante et de l’enzyme native, possiblement dû à un phénomème dynamique. Une compréhension plus générale de la reconnaissance et la résistance aux antifolates a été réalisée en comparant des séquences et des structures de variantes de la DHFR résistants aux antifolates et provenant de différentes espèces. En somme, ces travaux apportent de nouveaux éléments pour la comprehension des intéractions importantes entre une enzyme et un ligand, pouvant aider au développement de nouveaux antifolates plus efficaces pour le traitement de diverses maladies. De plus, ces travaux ont généré de nouveaux gènes de résistance pouvant être utilisés en tant que marqueurs de sélection en biologie cellulaire.

Rôle des Cellules Endothéliales Progénitrices dans la Régulation de la Fonction Plaquettaire

Les Cellules Endothéliales Progénitrices ("Endothelial Progenitor Cells", EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui jouent un rôle émergeant en biologie vasculaire. Les EPCs ont été localisées dans le cordon ombilical, la moelle osseuse, le sang périphérique et dans certains tissus régénérateurs. Les interactions des EPCs avec les cellules sanguines et vasculaires peuvent largement influencer leurs propriétés biologiques et dicter leur fonctionnement pendant la réparation endothéliale. Plus spécifiquement, les interactions des EPCs avec les plaquettes circulantes induisent leur migration, leur recrutement et leur différentiation en cellules endothéliales aux sites de lésions vasculaires. Cependant, l’impact d’une telle interaction sur la fonction plaquettaire n’a pas été recherché. Le but de mon projet était de :1) générer des EPCs à partir des cellules mononucléaires du sang humain périphérique ("Peripheral Blood Mononuclear Cells", PBMCs); 2) étudier les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes; 3) déterminer leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus et 4) décrire le mécanisme d’action des EPCs sur les plaquettes et le thrombus. Mises en culture sur une surface de fibronectine dans un milieu conditionné, les PBMCs fraîchement isolées possédaient une morphologie ronde et une petite taille. Après cinq jours, les PBMCs adhérentes donnaient naissance à des colonies, puis formaient une monocouche de cellules aplaties caractéristiques des EPCs après dix jours de culture. Les EPCs différenciées étaient positives pour l’Ulex-lectine et l’Acétyle des lipoprotéines de faible densité ("Acetylated Low Density Lipoprotein", Ac-LDL), exprimaient les marqueurs progéniteurs (CD34, P-sélectine, VEGFR2, vWF et VE-Cadhérine) tandis que les marqueurs leucocytaires (CD14, PSGL-1 et L-sélectine) étaient absents. Ces EPCs interagissaient avec les plaquettes activées par un mécanisme dépendant de la P-sélectine plaquettaire, inhibaient l’activation et l’agrégation plaquettaire et réduisaient significativement l’adhésion plaquettaire, principalement par l’action de prostacycline (PGI2). En fait, ceci était associé avec une augmentation de l’expression de la cyclooxygénase-2 (COX-2) et du monoxyde d’azote (NO) synthéthase inductible (iNOS). Toutefois, les effets inhibiteurs des EPCs sur la fonction plaquettaire ont été renversés par une inhibition de la COX et non pas du NO. Bien que les EPCs fussent en mesure de lier les plaquettes via la P-sélectine, leurs effets prédominants étaient médiés essentiellement par une sécrétion paracrine, impliquant la PGI2. Néanmoins, un rapprochement étroit ou un bref contact entre les EPCs et les plaquettes était requis pour que cette fonction soit complètement réalisée. D’ailleurs, cet aspect a été investigué chez des souris déficientes en P-sélectine (P-sel-/-) et chez leurs congénères de phénotype sauvage (Wild Type, WT). Chez les souris WT, les EPCs inhibaient l’agrégation plaquettaire dans le sang complet de manière concentration-dépendante alors que dans les souris P-sel-/-, l’action des EPCs n’avait pas d’effet significatif. De plus, en utilisant un modèle murin de thrombose artérielle, nous avons démontré que l’infusion systémique des EPCs altéraient la formation du thrombus et réduisaient significativement sa masse chez les souris WT, mais non pas chez les souris P-sel-/-. En outre, le nombre des EPCs incorporées au niveau du thrombus et de la paroi vasculaire était visiblement réduit chez les P-sel-/- par rapport aux souris WT. Dans cette étude, nous sommes parvenus à différentier adéquatement des EPCs à partir des PBMCs, nous avons étudié les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes, et nous avons décrit leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus. De plus, nous avons identifié la PGI2 comme étant le principal facteur soluble sécrété par les EPCs en culture et responsable de leurs effets inhibiteurs sur l’activation, l’adhésion et l’agrégation plaquettaire in vitro. De surcroît, nous avons élucidé le mécanisme d’action des EPCs sur l’agrégation plaquettaire et la formation du thrombus, in vivo, et nous avons souligné le rôle de la P-sélectine plaquettaire dans ce processus. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur la biologie des EPCs et définissent leur rôle potentiel dans la régulation de la fonction plaquettaire et la thrombogenèse.

Modulation du cytochrome P450 dans un modèle murin d'insuffisance rénale chronique

Introduction : Les modèles murins sont grandement utilisés dans l’étude des maladies rénales et des pathologies associées. La concentration de la créatinine sérique est un bon indicateur de la filtration glomérulaire et en présence d’insuffisance rénale chronique (IRC), les concentrations de créatinine sérique (et la clairance) reflètent la sévérité de l’IRC. De plus, il a été démontré que l’IRC modifie le métabolisme des médicaments en diminuant l’activité et l’expression des enzymes hépatiques du cytochrome P450 (CYP450). Afin d’étudier la modulation du P450 par l’IRC avec un modèle murin et de confirmer nos résultats chez le rat, nous devons 1) développer un modèle d’IRC chez la souris, 2) mettre au point une technique de dosage des marqueurs de l’IRC et, 3) évaluer l’expression protéique du CYP450 en présence IRC. Matériel et Méthode : Trois modèles chirurgicaux d’IRC chez la souris ont été développés. Une méthode du dosage de la créatinine par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) a été mise au point chez la souris et l’expression protéique du P450 a été mesurée par immunobuvardage de type Western. Résultats : Plusieurs paramètres de CLHP comme le pH, la concentration et le débit de la phase mobile modifient le pic d’élution et le temps de rétention de la créatinine. Concernant le modèle expérimental, on observe une perte de poids et une augmentation de la concentration plasmatique de la créatinine chez les souris avec une IRC. De plus, l’expression protéique de plusieurs isoformes du cytochrome P450 est modulée par l’IRC. Nous observons une diminution du CYP 2D de 42% (p < 0,01), du CYP 3A11 de 60% et du CYP 1A de 37% (p <0,01) par rapport aux souris témoins. On ne dénote aucun changement significatif au niveau de l’isoforme 2E1. Conclusion : Il est possible d’induire une insuffisance rénale chronique chez la souris suite à une néphrectomie. La technique de dosage de la créatinine par CLHP est précise et exacte et permet de caractériser la sévérité de l’IRC chez la souris. L’expression protéique du CYP450 est régulée à la baisse dans le foie des souris atteintes d’IRC.