Expressão de SmNPP5a de Schistosoma mansoni em Pichia pastoris

A esquistossomose é causada pelo Schistosoma mansoni e é considerada uma importante doença parasitária que afeta mais de 200 milhões de pessoas em países em desenvolvimento. Estima-se ainda que aproximadamente 600 milhões de pessoas vivam em áreas de risco e que o número de mortes por ano devido a esta parasitose chegue a 200.000. O tratamento existente hoje é eficiente, mas não previne contra re-infecção e contra as formas jovens dos parasitas. O desenvolvimento de uma vacina utilizando antígenos do parasita produzidos de modo recombinantes é o anseio para o controle da esquistossomose. A fosfodiesterase-5 (SmNPP-5a) é uma enzima presente na interface parasita-hospedeiro e acessível ao sistema imune, sendo portanto considerada um potencial candidato vacinal, sua avaliação se faz necessária. A obtenção de uma SmNPP-5a recombinante enzimaticamente ativa é um passo fundamental no processo de avaliação da sua capacidade protetora e determinação da sua função fisiológica para o parasita. Utilizando o sistema de expressão baseados em leveduras metilotróficas, Pichia pastoris, a proteína recombinante pode ser expressa com as modificações pós traducionais necessárias para ter sua estrutura original mantida, característica fundamental para se obter uma proteína enzimáticamente ativa. Para clonagem e expressão da proteína recombinante utilizamos o vetor pPICZαA, pois este possui um sistema de expressão baseado no promotor álcool oxidase (AOX1 e AOX2). Ele possui ainda, a capacidade de adicionar um peptídeo sinal e uma cauda de histidina, com objetivo de secretar a proteína expressa e facilitar sua purificação, respectivamente. A triagem e confirmação dos clones positivos foram feitas por PCR. A análise das amostras de sobrenadantes coletadas com 24, 48 e 72h de estímulo com metanol foi feita por SDS-PAGE e Western blot para verificação da expressão... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Desenvolvimento de kit para quantificação enzimática de etanol

A dosagem do etanol durante a produção de medicamentos, bebidas e combustíveis tem se mostrado bastante importante para o aumento de rendimento dos processos e qualidade dos produtos. Embora existam vários métodos para determinar a concentração do etanol, os enzimáticos são os mais interessantes por serem rápidos, precisos, de fácil manuseio e baixo custo. O objetivo geral desse trabalho foi a elaboração de um Kit de quantificação enzimática de etanol, utilizando a enzima álcool desidrogenase I recombinante de S. cerevisiae (Adh1). Para isso, o gene codificador da enzima álcool desidrogenase I (ADH1) de levedura foi clonado no vetor pET28a para expressão em E. coli (BL21). Em seguida, a produção e solubilidade da enzima álcool desidrogenase I foi determinada, sendo definida uma condição ideal de produção e purificação da proteína recombinante por cromatografia de afinidade. A atividade enzimática da álcool desidrogenase I purificada foi determinada através de ensaios já padronizados na literatura (UV), bem como sua estabilidade em diversas condições de tempo e temperatura. Os resultados obtidos aqui demonstraram que a enzima obtida apresentou boa atividade biológica in vitro, com sensibilidade na detecção de no mínimo 2,3 x 10–4 g/L de etanol em 2 minutos. Além disso, a proteína purificada teve sua atividade preservada quando estocada a - 20°C durante 120 dias, características que possibilitarão que a enzima álcool desidrogenase I recombinante, purificada pela metodologia apresentada nesse trabalho, seja utilizada em um kit de quantificação enzimática de etanol rápido, preciso e de baixo custo

Clonagem, Expressão e Purificação da Proteína Telomérica LaTRF em sistema bacteriano (pMAL)

As proteínas da família TRF2 (“TTAGGG repeat-binding factor 2”) fazem parte de complexos multiprotéicos responsáveis pela manutenção dos telômeros de alguns eucariotos. Elas apresentam domínios funcionais que a caracterizam como proteínas que interagem com DNA telomérico na forma de dupla fita. São eles, o domínio de interação com o DNA do tipo Myb-like, localizado na porção C-terminal, um domínio acídico N-terminal e um domínio de homodimerização TRFH (“TRF homology domain for homodimerization”). A proteína TRF2 também está envolvida na formação de estruturas teloméricas terminais denominadas “t-loops”. O intuito deste projeto é a clonagem, expressão em vetor bacteriano (pMAL) e a purificação de uma proteína homóloga as proteínas teloméricas TRFs humana em parasitas do gênero Leishmania, especificamente a espécie Leishmania amazonensis (LaTRF). Primeiramente foram desenhados iniciadores (primers) utilizados para a amplificação da sequência LaTRF por PCR. O(s) produto(s) de amplificação foram clonados em vetores de clonagem para produtos de PCR e sequenciados para análise. Uma vez obtida a seqüência da LaTRF, o inserto contendo o gene foi subclonado direcionalmente e na mesma fase de leitura do vetor de expressão bacteriano (pMAL-c5x, NEB) para obtenção e futura purificação da proteína recombinante. Verificou-se a expressão da proteína recombinante LaTRF utilizando SDS-PAGE e “Western Blot”. Pelos resultados obtidos na análise de expressão em pequena escala da proteína recombinante, foi observado possíveis indícios de que esta esteja sendo expressa. Com isso, torna-se possível a tentativa de uma expressão em grande escala utilizando esse mesmo sistema bacteriano (pMAL) a fim de se obter a proteína purificada que poderá ser futuramente utilizada para ensaios de “pull-down” dentre outras aplicações

Produção de vetores recombinantes para expressão de diferentes formas da proteína K1 do herpesvírus associado ao Sarcoma de Kaposi (KSHV)

Kaposi´s sarcoma associated herpesvirus (KSHV) or human herpesvirus 8 (HHV-8) is a gammaherpesvirus essential for the development of all forms of Kaposi´s sarcoma (KS). The KSHV’s life cycle is basically divided into latent and lytic phases, which have distinct viral gene expression profiles. Some important oncogenic products of KSHV are expressed during the lytic phase, including the viral K1 protein. As an effect of interfer-ence with intracellular signaling, K1 expression increases proliferation and survival of KSHV-infected cells. Due to its high level of genetic variability compared to other re-gions of the viral genome, the K1-encoding ORF (ORF-K1) is commonly evaluated for KSHV genotyping. It remains unclear whether different viral genotypes have particular biological effects that might modify the KSHV oncogenicity. The present study aimed to contribute to the establishment of an experimental in vitro model for evaluation of the K1 protein from common KSHV genotypes. Recombinant expression vectors with the ORF-K1 from KSHV genotypes A, B and C were prepared by genetic cloning. The recombi-nant vectors pKSHVOK1 obtained by cloning were sequenced for structural validation. After that, HEK293 cell line was transfected with the recombinant vectors, and proteins were extracted for expression analysis by Western blot technique, for K1 functional vali-dation. Results showed that ORF-K1 vectors containing KSHV ORF-K1 from the A, B and C genotypes were produced and structurally validated by DNA sequencing. The K1 expression at the protein level was also confirmed by immunoblots using an antibody for FLAG detection, an epitope from the vector that binds to K1. Based on presented re-sults, it´s possible to conclude that the recombinant vectors will be able to be used in future studies of K1 protein biological properties from distinct KSHV genotypes

Clonagem de sequências codificantes de citocinas felinas para construção de curva padrão para PCR em tempo real

A quantificação de citocinas felinas possibilita uma avaliação do sistema imune do animal em diferentes doenças, permite também a identificação de diferentes fatores que alteram sua secreção, e colabora na compreensão da patogênese das enfermidades. Em humanos e camundongos essa mensuração é feita principalmente pelo método de ELISA, mas para os felinos há uma menor disponibilidade de kits específicos para determinadas citocinas, e estes possuem um custo elevado. Assim, uma alternativa é utilizar a reação de PCR em tempo real com transcrição reversa (RT-qPCR) para quantificação absoluta dos RNAs mensageiros das citocinas felinas, uma técnica bastante sensível e específica para analisar a expressão desses genes. Com esse intuito, esse trabalho teve como objetivo clonar as sequências gênicas codificantes de citocinas, para construir uma curva padrão para a qPCR. Assim, foi feita extração de RNA de amostras de sangue total de gatos domésticos, e estes foram tratados com DNAse para evitar contaminação por DNA genômico. O cDNA foi sintetizado, e amplificado com os primers específicos para cada fragmento codificante de citocina e o GAPDH felino. Cada amplicon purificado foi inserido em um plasmídeo comercial, e introduzido em bactérias E. coli cepa DH5. Os clones recombinantes foram sequenciados para confirmar a inserção do fragmento no vetor. As curvas padrão da qPCR foram construídas com cada plasmídeo recombinante numa de 106 a 101 cópias por reação. O sequenciamento mostrou que todos os clones eram semelhantes àqueles encontrados no GenBank. A eficiência das amplificações, baseado no slope das curvas padrão foram: 101,3% para GAPDH, 99,1% para IL-1, 83,2% para IL-6, 94,4% para IL-10, 105,5% para IL-12, 83,4% para IFN- e 83,8% para TNF-. O valor de r2 foi de 0,99 em todas as reações. Dessa forma, com a clonagem dos fragmentos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Caracterização funcional da proteína XAC1201 envolvida na patogenicidade de Xanthomonas citri subsp. citri

Pós-graduação em Agronomia (Genética e Melhoramento de Plantas) - FCAV

Efeito protetor da proteína anti-inflamatória Galectina-1 sobre o processo de uveíte induzida pelo inflamógeno lipopolissacarídeo

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Modelo experimental de conjuntivite alérgica: efeito do tratamento farmacológico com a proteína anti-inflamatória galectina - 1

Pós-graduação em Genética - IBILCE

Análise da expressão de genes selecionados do herpevírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV) em células TIVE-LTC expostas à proteína tat do vírus da imunodeficiência humana (HIV-1)

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Produção otimizada de biocelulose utilização de biologia molecular de micro-organismos

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

O uso de rhBMP-2 para aumento ósseo maxilar: relato de caso clínico

The bone resorption in the anterior maxilla, due to its aesthetic importance, can be considered one of the challenges in implant dentistry. Autogenous bone graft is the most indicated bone augmentation procedure, aiming an implant supported rehabilitation.. Alternatively, some other graft procedures can be done with homogenous and xenogenous bone graft, biomaterials and different associations. Additionally to the mentioned biomaterials, the bone morphogenetic protein (BMP), specially the rhBMP-2, which was characterized as a bone osteoinductor, and consecutively, a potential autogenous graft substitute, with previsibility and no necessity of association to other biomaterial. The objective of this study is to present a single case using the rhBMP-2 for bone augmentation.

Estrutura genética de populações de Rhizoctonia oryzae-sativae do arroz em São Paulo, Brasil, e em meta, Colômbia, e potencial adaptativo do patógeno à Urochloa spp

Pós-graduação em Agronomia - FEIS

Caracterização dos mecanismos de ação da imunoterapia intravesical com P-MAPA envolvendo as vias de sinalização dor receptores Toll-like (TLR) 2 e 4 na progressão do câncer de bexiga não-músculo invasivo

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Subconjunctival and topical application of recombinant tissue plasminogen activator in rabbits

To quantify fibrin degradation products after topical and subconjunctival administration of recombinant tissue plasminogen activator in rabbits. Methods: Fibrin formation was induced in the anterior chamber in 25 rabbits. Subsequently, five rabbits received an injection of r-TPA (positive control) in the anterior chamber, another 10 received a subconjunctival injection of r-TPA, and the remaining 10 received instillations of topical r-TPA. Afterwards, samples of aqueous humor were collected and semi-quantitative analysis of fibrin degradation products (FDP) was performed. Results: No statistical differences were noted between the treatment and control groups at any time point. Fibrin degradation products semi-quantification showed statistical improvement in the control group and the subconjunctival group. Conclusion: Fibrin degradation products were observed in the anterior chamber after subconjunctival administration of r-TPA. However, it was probably not sufficient to cause fibrin degradation. Topical r-TPA did not effectively absorb anterior chamber fibrin.

Expression of cellular components in granulomatous inflammatory response in piaractus mesopotamicus model

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)