Composite electrospun gelatin fiber-alginate gel scaffolds for mechanically robust tissue engineered cornea

A severe shortage of good quality donor cornea is now an international crisis in public health. Alternatives for donor tissue need to be urgently developed to meet the increasing demand for corneal transplantation. Hydrogels have been widely used as scaffolds for corneal tissue regeneration due to their large water content, similar to that of native tissue. However, these hydrogel scaffolds lack the fibrous structure that functions as a load-bearing component in the native tissue, resulting in poor mechanical performance. This work shows that mechanical properties of compliant hydrogels can be substantially enhanced with electrospun nanofiber reinforcement. Electrospun gelatin nanofibers were infiltrated with alginate hydrogels, yielding transparent fiber-reinforced hydrogels. Without prior crosslinking, electrospun gelatin nanofibers improved the tensile elastic modulus of the hydrogels from 78±19. kPa to 450±100. kPa. Stiffer hydrogels, with elastic modulus of 820±210. kPa, were obtained by crosslinking the gelatin fibers with carbodiimide hydrochloride in ethanol before the infiltration process, but at the expense of transparency. The developed fiber-reinforced hydrogels show great promise as mechanically robust scaffolds for corneal tissue engineering applications. © 2013 Elsevier Ltd.

Time-dependent fracture toughness of cornea.

The fracture and time-dependent properties of cornea are very important for the development of corneal scaffolds and prostheses. However, there has been no systematic study of cornea fracture; time-dependent behavior of cornea has never been investigated in a fracture context. In this work, fracture toughness of cornea was characterized by trouser tear tests, and time-dependent properties of cornea were examined by stress-relaxation and uniaxial tensile tests. Control experiments were performed on a photoelastic rubber sheet. Corneal fracture resistance was found to be strain-rate dependent, with values ranging from 3.39±0.57 to 5.40±0.48kJm(-2) over strain rates from 3 to 300mmmin(-1). Results from stress-relaxation tests confirmed that cornea is a nonlinear viscoelastic material. The cornea behaved closer to a viscous fluid at small strain but became relatively more elastic at larger strain. Although cornea properties are greatly dependent on time, the stress-strain responses of cornea were found to be insensitive to the strain rate when subjected to tensile loading.

3D refraction correction and extraction of clinical parameters from spectral domain optical coherence tomography of the cornea.

Capable of three-dimensional imaging of the cornea with micrometer-scale resolution, spectral domain-optical coherence tomography (SDOCT) offers potential advantages over Placido ring and Scheimpflug photography based systems for accurate extraction of quantitative keratometric parameters. In this work, an SDOCT scanning protocol and motion correction algorithm were implemented to minimize the effects of patient motion during data acquisition. Procedures are described for correction of image data artifacts resulting from 3D refraction of SDOCT light in the cornea and from non-idealities of the scanning system geometry performed as a pre-requisite for accurate parameter extraction. Zernike polynomial 3D reconstruction and a recursive half searching algorithm (RHSA) were implemented to extract clinical keratometric parameters including anterior and posterior radii of curvature, central cornea optical power, central corneal thickness, and thickness maps of the cornea. Accuracy and repeatability of the extracted parameters obtained using a commercial 859nm SDOCT retinal imaging system with a corneal adapter were assessed using a rigid gas permeable (RGP) contact lens as a phantom target. Extraction of these parameters was performed in vivo in 3 patients and compared to commercial Placido topography and Scheimpflug photography systems. The repeatability of SDOCT central corneal power measured in vivo was 0.18 Diopters, and the difference observed between the systems averaged 0.1 Diopters between SDOCT and Scheimpflug photography, and 0.6 Diopters between SDOCT and Placido topography.

Tono-Pen determination of intraocular pressure in patients with band keratopathy or glued cornea

Aims. To evaluate the intraocular pressure (IOP) measurements in patients with band keratopathy or glued corneas obtained from affected and non-affected areas. Methods. 15 patients with band keratopathy or glued corneas were prospectively recruited. When both eyes were affected, only the right eye was analysed. Tono-Pen readings of IOP were obtained sequentially from the affected and non-affected corneal surface. Additionally, Goldmann applanation tonometry was attempted. Results. Determination of IOP with the Tono-Pen was possible in all cases, while Goldmann tonometry was not performed in three patients because of severe corneal irregularities. The average of the Tono-Pen readings obtained from the affected cornea (34.8 (SD 14.0) mmHg) was consistently and significantly higher (p <0.001) than mean IOP obtained by the Tono-Pen from the non-affected area (14.8 (4.3) mmHg). The average of Goldmann tonometry readings (14.4 (6.1) mmHg) did not differ significantly from the Tono-Pen values obtained from the non-affected corneal area (p = 0.47) but was significantly lower than the Tono-Pen measurements obtained from the affected area (p <0.001) Conclusion. In patients with band keratopathy or glued corneas determination of IOP by Tono-Pen tonometry varies from affected to non-affected area. The Tono-Pen overestimates the level of IOP when it is applied to areas with band keratopathy or with glue.

Enrichment of pathogenic alleles in the brittle cornea gene, ZNF469, in keratoconus

Keratoconus, a common inherited ocular disorder resulting in progressive corneal thinning, is the leading indication for corneal transplantation in the developed world. Genome-wide association studies have identified common SNPs 100 kb upstream of ZNF469 strongly associated with corneal thickness. Homozygous mutations in ZNF469 and PR domain-containing protein 5 (PRDM5) genes result in brittle cornea syndrome (BCS) Types 1 and 2, respectively. BCS is an autosomal recessive generalized connective tissue disorder associated with extreme corneal thinning and a high risk of corneal rupture. Some individuals with heterozygous PRDM5 mutations demonstrate a carrier ocular phenotype, which includes a mildly reduced corneal thickness, keratoconus and blue sclera. We hypothesized that heterozygous variants in PRDM5 and ZNF469 predispose to the development of isolated keratoconus. We found a significant enrichment of potentially pathologic heterozygous alleles in ZNF469 associated with the development of keratoconus (P = 0.00102) resulting in a relative risk of 12.0. This enrichment of rare potentially pathogenic alleles in ZNF469 in 12.5% of keratoconus patients represents a significant mutational load and highlights ZNF469 as the most significant genetic factor responsible for keratoconus identified to date.

The impact of topical prostaglandin analogs on the biomechanical properties of the cornea in patients with open angle glaucoma

Justification: Le glaucome entraîne une perte progressive de la vision causée par la détérioration du nerf optique. Le glaucome est répandu dans le monde et cause la cécité dans environ sept millions de personnes. Le glaucome touche plus de 400 000 Canadiens et sa prévalence augmente avec le vieillissement de la population.1,2 Il s'agit d'une maladie chronique surnoise dont les symptômes se manifestent uniquement lors des stades avancés et qui peuvent mener à la cécité. Présentement, le seul moyen possible d’arrêter la progression du glaucome au stade initial est de diminuer la pression intra-oculaire (PIO). Les analogues de prostaglandines (APG) topiques sont fréquemment utilisées comme traitement de première ligne. Cependant, la recherche démontre que cette classe de médicaments peut changer certaines propriétés de la cornée, et possiblement influencer la mesure de la PIO.3 Objectif: À déterminer si l'utilisation d'APG affecte les propriétés biomécaniques de la cornée. La conclusion sera basée sur l'analyse intégrée des résultats obtenus de l'analyseur Reichert oculaire Réponse (ORA), la tonométrie par applanation de Goldmann (TAG) et la pachymétrie ultrasonographique. Le deuxième objectif potentiel de cette étude est de déterminer la corrélation, le cas échéant, entre les propriétés biomécaniques de la cornée, l'épaisseur de la cornée centrale (ECC) et la PIO chez les patients subissant un traitement d’APG topique. L'hypothèse principale de cette étude est que l’APG influence les propriétés de la cornée telles que l'épaisseur centrale, l'élasticité et la résistance. Patients et méthodes : Soixante-dix yeux de 35 patients, âgés de 50-85 ans, atteints de glaucome à angle ouvert (GAO) et traités avec APG topique ont été examinés. Seulement les sujets avec une réfraction manifeste entre -6,00 D et +4,25 D ont été inclus. Les critères d'exclusion sont: patients avec n'importe quelle autre maladie de la cornée de l’œil, telles que la dystrophie endothéliale de Fuch’s et kératocône, ou tout antécédent de traumatisme ou d'une chirurgie de la cornée, ainsi que le port de lentilles de contact. Nous avons demandé aux patients atteints du glaucome qui ont des paramètres stables et qui utilisent l’APG dans les deux yeux de cesser l’APG dans l'œil moins affecté par la PIO, et de continuer l’utilisation d’APG dans l'œil contralatéral. Le meilleur œil est défini comme celui avec moins de dommage sur le champ visuel (CV) (déviation moyenne (DM), le moins négatif) ou une PIO maximale historique plus basse si la DM est égale ou encore celui avec plus de dommage sur la tomographie par cohérence optique (TCO, Cirrus, CA) ou la tomographie confocale par balayage laser (HRT, Heidelberg, Allemagne). Toutes les mesures ont été prises avant la cessation d’APG et répétées 6 semaines après l’arrêt. Les patients ont ensuite recommencé l’utilisation d’APG et toutes les mesures ont été répétées encore une fois après une période supplémentaire de 6 semaines. Après commencer ou de changer le traitement du glaucome, le patient doit être vu environ 4-6 semaines plus tard pour évaluer l'efficacité de la goutte.4 Pour cette raison, on été décidé d'utiliser 6 semaines d'intervalle. Toutes les mesures ont été effectuées à l’institut du glaucome de Montréal par le même technicien, avec le même équipement et à la même heure de la journée. L'œil contralatéral a servi comme œil contrôle pour les analyses statistiques. La tonométrie par applanation de Goldmann a été utilisée pour mesurer la PIO, la pachymétrie ultrasonographique pour mesurer l'ECC, et l’ORA pour mesurer les propriétés biomécaniques de la cornée, incluant l'hystérèse cornéenne (HC). L’hypothèse de l'absence d'effet de l'arrêt de l’APG sur les propriétés biomécaniques a été examiné par un modèle linéaire à effets mixtes en utilisant le logiciel statistique R. Les effets aléatoires ont été définies à deux niveaux: le patient (niveau 1) et l'œil de chaque patient (niveau 2). Les effets aléatoires ont été ajoutés au modèle pour tenir compte de la variance intra-individuelle. L’âge a également été inclus dans le modèle comme variable. Les contrastes entre les yeux et les temps ont été estimés en utilisant les valeurs p ajustées pour contrôler les taux d'erreur internes de la famille en utilisant multcomp paquet dans R. Résultats: Une augmentation statistiquement significative due l 'HC a été trouvée entre les visites 1 (sur APG) et 2 (aucun APG) dans les yeux de l'étude, avec une moyenne (±erreur standard) des valeurs de 8,98 ± 0,29 mmHg et 10,35 ± 0,29 mmHg, respectivement, correspondant à une augmentation moyenne de 1,37 ± 0,18 mmHg (p <0,001). Une réduction significative de 1,25 ± 0,18 mmHg (p <0,001) a été observée entre les visites 2 et 3, avec une valeur moyenne HC finale de 9,09 ± 0,29 mmHg. En outre, une différence statistiquement significative entre l’oeil d’étude et le contrôle n'a été observée que lors de la visite 2 (1,01 ± 0,23 mmHg, p <0,001) et non lors des visites 1 et 3. Une augmentation statistiquement significative du facteur de résistance conréen (FRC) a été trouvée entre les visites 1 et 2 dans les yeux de l'étude, avec des valeurs moyennes de 10,23 ± 0,34 mmHg et 11,71 ± 0,34 mmHg, respectivement. Le FRC a ensuite été réduit de 1,90 ± 0,21 mmHg (p <0,001) entre les visites 2 et 3, avec une valeur moyenne FRC finale de 9,81 ± 0,34 mmHg. Une différence statistiquement significative entre l’oeil d’étude et le contrôle n'a été observée que lors de la visite 2 (1,46 ± 0,23 mmHg, p <0,001). Une augmentation statistiquement significative de l'ECC a été trouvée entre les visites 1 et 2 dans les yeux de l'étude, avec des valeurs moyennes de 541,83 ± 7,27 µm et 551,91 ± 7,27 µm, respectivement, ce qui correspond à une augmentation moyenne de 10,09 ± 0,94 µm (p <0,001). L'ECC a ensuite diminué de 9,40 ± 0,94 µm (p <0,001) entre les visites 2 et 3, avec une valeur moyenne finale de 542,51 ± 7,27 µm. Une différence entre l’étude et le contrôle des yeux n'a été enregistré que lors de la visite 2 (11,26 ± 1,79 µm, p <0,001). De même, on a observé une augmentation significative de la PIO entre les visites 1 et 2 dans les yeux de l'étude, avec des valeurs moyennes de 15,37 ± 0,54 mmHg et 18,37 ± 0,54 mmHg, respectivement, ce qui correspond à une augmentation moyenne de 3,0 ± 0,49 mmHg (p <0,001). Une réduction significative de 2,83 ± 0,49 mmHg (p <0,001) a été observée entre les visites 2 et 3, avec une valeur moyenne de la PIO finale de 15,54 ± 0,54 mmHg. L’oeil de contrôle et d’étude ne différaient que lors de la visite 2 (1,91 ± 0,49 mmHg, p <0,001), ce qui confirme l'efficacité du traitement de l’APG. Lors de la visite 1, le biais de la PIO (PIOcc - PIO Goldmann) était similaire dans les deux groupes avec des valeurs moyennes de 4,1 ± 0,54 mmHg dans les yeux de contrôles et de 4,8 ± 0,54 mmHg dans les yeux d’études. Lors de la visite 2, après un lavage de 6 semaines d’APG, le biais de la PIO dans l'œil testé a été réduit à 1,6 ± 0,54 mmHg (p <0,001), ce qui signifie que la sous-estimation de la PIO par TAG était significativement moins dans la visite 2 que de la visite 1. La différence en biais PIO moyenne entre l'étude et le contrôle des yeux lors de la visite 2, en revanche, n'a pas atteint la signification statistique (p = 0,124). On a observé une augmentation peu significative de 1,53 ± 0,60 mmHg (p = 0,055) entre les visites 2 et 3 dans les yeux de l'étude, avec une valeur de polarisation finale de la PIO moyenne de 3,10 ± 0,54 mmHg dans les yeux d'études et de 2,8 ± 0,54 mmHg dans les yeux de contrôles. Nous avons ensuite cherché à déterminer si une faible HC a été associée à un stade de glaucome plus avancé chez nos patients atteints du glaucome à angle ouvert traités avec l’APG. Lorsque l'on considère tous les yeux sur l’APG au moment de la première visite, aucune association n'a été trouvée entre les dommages sur le CV et l'HC. Cependant, si l'on considère seulement les yeux avec un glaucome plus avancé, une corrélation positive significative a été observée entre la DM et l'HC (B = 0,65, p = 0,003). Une HC inférieure a été associé à une valeur de DM de champ visuelle plus négative et donc plus de dommages liés au glaucome. Conclusions : Les prostaglandines topiques affectent les propriétés biomécaniques de la cornée. Ils réduisent l'hystérèse cornéenne, le facteur de résistance cornéen et l'épaisseur centrale de la cornée. On doit tenir compte de ces changements lors de l'évaluation des effets d’APG sur la PIO. Plus de recherche devrait être menées pour confirmer nos résultats. De plus, d’autres études pourraient être réalisées en utilisant des médicaments qui diminuent la PIO sans influencer les propriétés biomécaniques de la cornée ou à l'aide de tonomètre dynamique de Pascal ou similaire qui ne dépend pas des propriétés biomécaniques de la cornée. En ce qui concerne l'interaction entre les dommages de glaucome et l'hystérésis de la cornée, nous pouvons conclure qu' une HC inférieure a été associé à une valeur de DM de CV plus négative. Mots Clés glaucome - analogues de prostaglandines - hystérèse cornéenne – l’épaisseur de la cornée centrale - la pression intraoculaire - propriétés biomécaniques de la cornée.

Investigation of K14/K5 as a stem cell marker in the limbal region of the bovine cornea

Background: Identification of stem cells from a corneal epithelial cell population by specific molecular markers has been investigated previously. Expressions of P63, ABCG2 and K14/K5 have all been linked to mammalian corneal epithelial stem cells. Here we report on the limitations of K14/K5 as a limbal stem cell marker. Methodology/Principal Findings: K14/K5 expression was measured by immunohistochemistry, Western blotting and Real time PCR and compared between bovine epithelial cells in the limbus and central cornea. A functional study was also included to investigate changes in K5/14 expression within cultured limbal epithelial cells undergoing forced differentiation. K14 expression (or its partner K5) was detected in quiescent epithelial cells from both the limbal area and central cornea. K14 was localized predominantly to basal epithelial cells in the limbus and suprabasal epithelial cells in the central cornea. Western blotting revealed K14 expression in both limbus and central cornea (higher levels in the limbus). Similarly, quantitative real time PCR found K5, partner to K14, to be expressed in both the central cornea and limbus. Following forced differentiation in culture the limbal epithelial cells revealed an increase in K5/14 gene/protein expression levels in concert with a predictable rise in a known differentiation marker. Conclusions/Significance: K14 and its partner K5 are limited not only to the limbus but also to the central bovine cornea epithelial cells suggesting K14/K5 is not limbal specific in situ. Furthermore K14/K5 expression levels were not lowered (in fact they increased) within a limbal epithelial cell culture undergoing forced differentiation suggesting K14/K5 is an unreliable maker for undifferentiated cells ex vivo.

On the barrier properties of the cornea: a microscopy study of the penetration of fluorescently labeled nanoparticles, polymers, and sodium fluorescein

Overcoming the natural defensive barrier functions of the eye remains one of the greatest challenges of ocular drug delivery. Cornea is a chemical and mechanical barrier preventing the passage of any foreign bodies including drugs into the eye, but the factors limiting penetration of permeants and nanoparticulate drug delivery systems through the cornea are still not fully understood. In this study, we investigate these barrier properties of the cornea using thiolated and PEGylated (750 and 5000 Da) nanoparticles, sodium fluorescein, and two linear polymers (dextran and polyethylene glycol). Experiments used intact bovine cornea in addition to bovine cornea de-epithelialized or tissues pretreated with cyclodextrin. It was shown that corneal epithelium is the major barrier for permeation; pretreatment of the cornea with β-cyclodextrin provides higher permeation of low molecular weight compounds, such as sodium fluorescein, but does not enhance penetration of nanoparticles and larger molecules. Studying penetration of thiolated and PEGylated (750 and 5000 Da) nanoparticles into the de-epithelialized ocular tissue revealed that interactions between corneal surface and thiol groups of nanoparticles were more significant determinants of penetration than particle size (for the sizes used here). PEGylation with polyethylene glycol of a higher molecular weight (5000 Da) allows penetration of nanoparticles into the stroma, which proceeds gradually, after an initial 1 h lag phase.

Metrics of the normal cornea : anterior segment imaging with the Visante OCT

Purpose:  The purpose of the study was to obtain anterior segment biometry for 40 normal eyes and to measure variables that may be useful to design large diameter gas permeable contact lenses that sit outside the region normally viewed by corneal topographers. Also, the distribution of these variables in the normal eye and how well they correlated to each other were determined.

Methods:  This is a cross-sectional study, in which data were collected at a single study visit. Corneal topography and imaging of the anterior segment of the eye were performed using the Orbscan II and Visante OCT. The variables that were collected were horizontal K reading, central corneal/scleral sagittal depth at 15 mm chord, and nasal and temporal angles at the 15 mm chord using the built-in software measurement tools.

Results:  The central horizontal K readings for the 40 eyes were 43 ± 1.73 D (7.85 ± 0.31 mm), with ± 95% confidence interval (CI) of 38.7 (8.7 mm) and 46.6 D (7.24 mm). The mean corneal/scleral sagittal depth at the 15 mm chord was 3.74 ± 0.19 mm and the range was 3.14 to 4.04 mm. The average nasal angle (which was not different from the temporal angle) at the 15 mm chord was 39.32 ± 3.07 degrees and the ± 95%CI was 33.7 and 45.5 degrees. The correlation coefficient comparing the K reading and the corneal/scleral sagittal depth showed the best correlation (0.58, p < 0.001). The corneal/scleral sagittal depth at 15 mm correlated less with the nasal angle (0.44, p = 0.004) and the weakest correlation was for the nasal angle at 15 mm with the horizontal readings (0.32, p = 0.046).

Conclusion:  The Visante OCT is a valuable tool for imaging the anterior segment of the eye. The Visante OCT is especially effective in providing the biometry of the peripheral cornea and sclera and may help in fitting GP lenses with a higher percentage of initial lens success, when the corneal sag and lens sag are better matched.

New technologies to access lens-mediated effects of the cornea

Contact lenses can affect the cornea in a variety of ways. Corneal structure can be altered so that its thickness changes to involve the epithelium and the stroma. As a result, the curvature may be affected, but whether it is the front or the back surface that is affected depends on the type of lens used. If thickness increases sufficiently, corneal transparency may decrease. Contact lenses can also affect cellular structure of all layers of the cornea through mechanical trauma, hypoxia, or toxicity from solutions that are used in association with lenses. More serious complications, such as inflammation and infection, can arise. All these changes can be detected by clinicians using slitlamp biomicroscopes and keratometers if the changes are significant enough. Since the development of computers, optical instruments have become more sophisticated and have enabled the detection of subtle changes but have also facilitated more precise measurement of these conditions along with the ability to capture images of the alterations or defects. This article describes some of the newer techniques and, specifically, the application of optical coherence tomography, confocal microscopy, and esthesiometry.

Membrane nanotubes in myeloid cells in the adult mouse cornea represent a novel mode of immune cell interaction

Membrane nanotubes (MNTs) are newly discovered cellular extensions that are either blind-ended or can connect widely separated cells. They have predominantly been investigated in cultured isolated cells, however, previously we were the first group to demonstrate the existence of these structures in vivo in intact mammalian tissues. We previously demonstrated the frequency of both cell–cell or bridging MNTs and blind-ended MNTs was greatest between major histocompatibility complex (MHC) class II+ cells during corneal injury or TLR ligand-mediated inflammation. The present study aimed to further explore the dynamics of MNT formation and their size, presence in another tissue, the dura mater, and response to stress factors and an active local viral infection of the murine cornea. Confocal live cell imaging of myeloid-derived cells in inflamed corneal explants from Cx3cr1GFP and CD11ceYFP transgenic mice revealed that MNTs form de novo at a rate of 15.5 μm/min. This observation contrasts with previous studies that demonstrated that in vitro these structures originate from cell–cell contacts. Conditions that promote formation of MNTs include inflammation in vivo and cell stress due to serum starvation ex vivo. Herpes simplex virus-1 infection did not cause a significant increase in MNT numbers in myeloid cells in the cornea above that observed in injury controls, confirming that corneal epithelium injury alone elicits MNT formation in vivo. These novel observations extend the currently limited understanding of MNTs in live mammalian tissues.