Produção de plantas e metabólitos de Cleome dendroides Schult. & Schult. f. (Cleomaceae) utilizando diferentes sistemas de cultivo in vitro

Cleome dendroides é uma espécie endêmica da Mata Atlântica dos estados do Rio de Janeiro e Espírito Santo, bioma alterado por intensa atividade antrópica, o que constitui uma ameaça à preservação de suas populações. Não existem estudos dos pontos de vista fisiológico, biotecnológico, fitoquímico ou farmacológico sobre a espécie. Considerando-se o perfil fitoquímico e o potencial medicinal do gênero, torna-se relevante definirem-se protocolos para a produção de plantas e metabólitos de C. dendroides utilizando diferentes sistemas de cultivo in vitro. No presente trabalho, foram realizados estudos sobre a germinação in vivo da espécie, avaliando-se a influência do substrato, temperatura e luz. Não se observou qualquer tipo de dormência, sendo as temperaturas de 20, 25 e 20-30C, em areia ou vermiculita, apropriadas para a germinação in vivo. Definiu-se também uma metodologia eficiente de germinação sob condições in vitro, e as plântulas obtidas foram utilizadas como fonte de explantes para os estudos de propagação in vitro. A resposta morfogênica foi avaliada considerando-se a origem e tipo do explante, tipos e concentrações de reguladores de crescimento e número de subculturas. A metodologia empregada mostrou-se eficiente para a produção de brotos e manutenção de estoques de plantas in vitro que serviram como fonte de explantes. A melhor condição para a propagação in vitro foi definida em meio solidificado contendo BA, independentemente do tipo de explante e da origem. Os brotos obtidos foram alongados, enraizados e aclimatizados. Também foi estabelecida a cultura de raízes e a regeneração de brotos a partir destas culturas. Avaliou-se o efeito da origem do explante, assim como dos tipos e concentrações de fitorreguladores sobre a proliferação de raízes e a regeneração de brotos. O fitorregulador AIB propiciou maior multiplicação das raízes, enquanto BA mostrou-se eficiente na regeneração de brotos a partir das raízes recém-formadas. Foi estabelecido ainda um protocolo de cultura de calos e de suspensões celulares. Avaliou-se o efeito da origem e do tipo de explante, dos tipos e das concentrações de fitorreguladores sobre a calogênese. A combinação de PIC com KIN foi a mais eficiente para a indução de calos em explantes de plântulas obtidas a partir de germinação in vitro, produzindo calos que foram mantidos por pelo menos dois anos. As suspensões celulares também foram estabelecidas em meio contendo PIC + KIN, mantendo uma produção de biomassa de cerca de cinco vezes o peso fresco inicial por três sucessivas subculturas. Análises histoquímicas e fitoquímicas revelaram a presença de alcaloides nos calos e nas suspensões celulares. Foram realizadas análises fitoquímicas de plantas de campo, plantas aclimatizadas, plantas mantidas em estoque in vitro e culturas de raízes, as quais indicaram a presença de derivados de glicosinolatos. Os resultados demonstraram a viabilidade de produção de material vegetal de C. dendroides por meio de métodos biotecnológicos e a produção in vitro de metabólitos de importância medicinal

Produção in vitro, análise fitoquímica e avaliação da atividade antineoplásica de metabólitos de Hovenia dulcis Thunb. (Rhamnaceae) obtidos por diferentes estratégias biotecnológicas

Hovenia dulcis Thunberg, natural da Ásia Oriental, é cultivada no Brasil onde é conhecida como uva-do-japão. A espécie possui várias indicações na medicina popular e alguns estudos apontam o seu potencial antineoplásico, tripanocida e hepatoprotetor. Metabólitos secundários são substâncias não essenciais para a sobrevivência celular, mas que fornecem vantagens adaptativas aos vegetais, sendo atribuído, para algumas delas, atividades biológicas importantes. Substâncias de interesse medicinal têm sido obtidas por técnicas da cultura de tecidos vegetais, como a calogênese e a cultura de células em suspensão, que permitem a síntese de matéria-prima de forma contínua e homogênea, independentemente de fatores ambientais e sazonais. O presente estudo objetivou o estabelecimento de culturas in vitro de H. dulcis, visando à produção de metabólitos de interesse, com vistas à avaliação do seu potencial antineoplásico sobre células K562. Foram testados protocolos para o estabelecimento de diferentes sistemas, como culturas de calos, de células em suspensão (CCS) e compact callus clusters (CCC) e ainda a avaliação do uso de elicitores na otimização de metabólitos produzidos in vitro. Foi verificado que a adição dos fitorreguladores KIN e TDZ, substituindo o BAP, não foi capaz de induzir a formação de calos friáveis, bem como a manutenção das culturas em ausência de luz. O uso do nitrato de prata promoveu a friabilidade de calos em todas as concentrações testadas, considerando-se 2,0 mg.L-1 a melhor concentração. Foram alcançadas taxas de 100% de formação de CCS tanto na presença, quanto em ausência de AgNO3. O maior acúmulo de biomassa foi verificado na concentração mais baixa de PIC (0,625 mg.L-1). A análise dos espectros de RMN indicou a presença de (+)-dihidromiricetina, (+)-galocatequina, hovenitina II, hovenosideo G, hodulosideo III, hodulosideo IV, hodulosideo I e hovenidulciosideo B1 nas culturas de calos friáveis. No estabelecimento de culturas CCC, observou-se a formação de calos compactos verdes em todas as concentrações de ANA testadas. O aumento da velocidade de rotação para 135 rpm aumentou a dispersão das células com consequente formação dos agregados celulares desejados. A seleção de linhagens celulares demonstrou ser um método eficiente na uniformização do tamanho desses agregados e tal uniformidade se manteve estável por mais de cinco subcultivos em 100% das culturas. Uma fração rica em saponinas foi obtida a partir dos agregados celulares, correspondendo a 1,46% da massa seca. A análise por RMN sugeriu a presença das saponinas Hovenosideo G e dos hovenidulciosideos A2 e B2. O uso de elicitores em cultura de calos mostrou-se adequado à produção de metabólitos secundários, sem alterações morfológicas nos mesmos. A elicitação alterou o perfil cromatográfico analisado por HPLC. Na elicitação com 5,0 mg.L-1 de extrato de levedura foi verificado um aumento de quase três vezes (12,280 3,396 equivalentes de quercetina/mg de extrato) na síntese de flavonoides. Finalmente, os estudos de ação antitumoral in vitro demonstraram citotoxicidade dos extratos de calos não elicitados de H. dulcis sobre linhagem de leucemia mieloide crônica (IC50 de 74,05 μg.mL-1.) e inibição do crescimento de tais células (K562), sugerindo o potencial antineoplásico para um produto biotecnológio (calo) desta espécie.

Micropropagation of Begonia and a study of genome stability in Begonia rex

The development of procedures and media for the micropropagation of B. rex are described. Media for the production of plantlets from a number of other Begonia hybrids are also provided. Growth analysis data is given for plants produced in vivo from leaf cuttings and in vitro from mature leaf petioles and immature leaves derived from singly and multiply recycled axenic plantlets. No significant difference was found in phenotype or quantitative vegetative characters for any of the populations assessed. The results presented from studies on the development of broad spectrum media for the propagation of a number of B. rex cultivars using axenic leaf explants on factorial combinations of hormones illustrate the major influence played by the genotype on explant response in vitro and suggest media on which a range of B. rex cultivars may be propagated. Procedures for in vitro irradiation and colchicine treatments to destabilize the B. rex genome have also been described. Variants produced from these treatments indicate the utility of in vitro procedures for the expression of induced somatic variation. Colour variants produced from irradiation treatment have been cultured and prove stable. Polyploids produced as variants from irradiation treatment have been subcultured but prove unstable. Media for the induction and proliferation of callus are outlined. The influence of callus subculture and aging on the stability of the B. rex genome is assessed by chromosomal analysis of cells, in vitro and in regenerants. The B. rex genome is destabilized in callus culture but attenuation of variation occurs on regeneration. Diploid cell lines are maintained in callus subcultures and supplementation of regenerative media with high cytokinin concentrations, casein hydrolysate or adenine failed to produce variants. Callus aging however resulted in the production of polyploids. The presence and expression of pre-existing somatic variation in B. rex pith and root tissue is assessed and polyploids have been produced from pith tissues cultured in vitro. The stability of the B. rex genome and the application of tissue culture to micropropagation and breeding of B. rex are discussed.

Method of plant tissue culture and regeneration

Plants may be regenerated from stomatal cells or protoplasts of such cells. Prior to regeneration the cells or protoplasts may be genetically transformed by the introduction of hereditary material most preferably by a DNA construct which is free of genes which specify resistance to antibiotics. The regeneration step may include callus formation on a hormone-free medium. The method is particularly suitable for sugar beet.

A novel regeneration system for a wild passion fruit species (Passiflora cincinnata Mast.) based on somatic embryogenesis from mature zygotic embryos

The objective of the present work was to induce somatic embryogenesis from zygotic embryos of Passiflora cincinnata Masters. Zygotic embryos formed calli on media with different concentrations of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 4.5 mu M benzyladenine (BA) after 30 days of in vitro culture. A concentration of 18.1 mu M 2,4-D resulted in the largest number of somatic embryos. Embryogenic calli were yellowish and friable, forming whitish proembryogenic masses. Morphologically, embryogenic cells were small and had large nuclei and dense cytoplasm, whereas non-embryogenic cells were elongated, with small nuclei and less dense cytoplasm. Calli cultured under white light on basal Murashige and Skoog`s medium with activated charcoal produced embryos in all developmental stages. There were differences among the treatments, with some leading to the production of calli with embryos and some only to callus formation. Some abnormalities were associated with somatic embryos, including fused axes, fused cotyledons and polycotyledonary embryos. Production of secondary somatic embryos occurred in the first cycle of primary embryo development. Secondary embryos differentiated from the surface of the protodermal layer of primary embryos with intense cell proliferation, successive mitotic divisions in the initial phase of embryoid development, and a vascular system formed with no connection to the parental tissue. This secondary embryogenic system of P. cincinnata is characterized by intense proliferation and maintenance of embryogenic competence after successive subcultures. This reproducible protocol opens new prospects for massive propagation and is an alternative to the current organogenesis-based transformation protocol.

PROPAGAÇÃO do UMEZEIRO (Prunus mume Sieb & Zucc.) POR ESTAQUIA HERBÁCEA

A utilização do umezeiro ou damasqueiro-japonês (Prunus mume Sieb & Zucc.) como porta-enxerto de Prunus sp. vem despertando grande interesse em função de sua rusticidade, resistência a pragas e doenças, adaptação e, principalmente, por reduzir o porte de pessegueiros e nectarineiras. Este trabalho foi conduzido no Departamento de Produção Vegetal da FCAV/UNESP, Câmpus de Jaboticabal-SP, e teve por objetivo estudar a propagação vegetativa desta espécie. Para tanto, utilizaram-se estacas herbáceas com 12cm de comprimento dos Clones 02; 05; 10 e 15, provenientes do Programa de Melhoramento Genético do Instituto Agronômico de Campinas, submetidas às concentrações de 0 e 2000mg.L-1 de AIB, por cinco segundos. O experimento foi conduzido em delineamento experimental inteiramente casualizado, com 4 repetições de 20 estacas por parcela, esquema fatorial 4 x 2, sendo o fator clone em 4 níveis (Clones 02; 05; 10 e 15) e AIB em 2 níveis (0 e 2000mg.L-1). de acordo com os resultados, verificou-se diferença entre os clones quanto à porcentagem de enraizamento, sendo o Clone 15 significativamente superior ao Clone 02 (93,75% e 78,13%, respectivamente). Os Clones 05 (85,0%) e 10 (83,13%) comportaram-se como intermediários, não diferindo dos demais. Não houve diferença entre os clones testados quanto à formação de calo, raízes por estaca, comprimento de raízes e porcentagem de estacas brotadas. O ácido indolbutírico na concentração de 2000mg.L-1 favoreceu a emissão de raízes adventícias e aumentou o comprimento das raízes, mas não teve influência na brotação das estacas. Não houve efeito da interação entre os fatores testados para as variáveis analisadas.

Micropropagation of fig (Ficus carica L.) 'Roxo de Valinhos' plants

An in vitro protocol for Ficus carica cv. 'Roxo de Valinhos' was optimized. Nodal explants containing two buds were excised from field-grown mature plants, and transferred to different proliferation media consisting of combinations of distinct concentrations of activated charcoal with benzyladenine (BA), kinetin with gibberellic acid (GA(3)), and WPM (woody plant medium) with kinetin. The regular strength of WPM in combination with 0.5 mg l(-1) kinetin was the best condition for shoot proliferation of Ficus carica 'Roxo de Valinhos' plants. The addition of activated charcoal in the medium completely inhibited shoot proliferation. The inclusion of BA in the medium induced excessive callus formation as well as small and vitrified shoots, while GA(3) induced excessive elongation associated with vitrification, chlorosis, and tip-burned shoots.

Efeito do ácido indolbutírico no enraizamento de estacas de ramos semilenhosos de pessegueiro

Neste trabalho objetivou-se estudar o efeito do ácido indolbutírico (AIB) na formação de raízes adventícias em estacas semilenhosas de nove cultivares-copa (Arlequim, Aurora, Biuti, Diamante, Momo, Ouromel, Pérola de Mairinque, Premier e Tropical) e dois porta-enxertos (Okinawa e R-15-2) de pessegueiro. O experimento foi realizado na Universidade Federal de Lavras (UFLA), Lavras, MG, em nov./dez. de 1997. As concentrações de AIB utilizadas foram de 0, 1.000, 2.000 e 3.000 mg L-1, e as estacas tiveram a base imersa em solução durante cinco segundos. O AIB influenciou no enraizamento, na formação de calo e no número de raízes. As maiores porcentagens de enraizamento foram observadas nas cultivares Pérola de Mairinque (56,62%) e Tropical (55,04%), ambas ocorrendo na concentração de 3.000 mg L-1 de AIB.

Estudo da enxertia hipocotiledonar do maracujazeiro-amarelo sobre dois porta-enxertos, através de microscopia eletrônica de varredura

O objetivo deste trabalho foi verificar quanto tempo após a realização da enxertia hipocotiledonar ocorre a soldadura ou adesão entre enxerto e porta-enxerto, e também a formação da ponte de calo, verificada pelo total preenchimento da fenda por tecido meristemático secundário (calo). Foram produzidas 56 mudas de maracujazeiro-amarelo (Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Deg.) pela enxertia hipocotiledonar em fenda cheia no topo sobre dois porta-enxertos (P. edulis Sims f. flavicarpa Deg. e P. alata Dryander). Aos 0, 3, 6, 9, 12, 15 e 18 dias após a enxertia, coletou-se a região da enxertia de quatro mudas de cada combinação. O material coletado foi fixado em solução de glutaraldeído a 3%, pós-fixado em tetróxido de ósmio a 2%, desidratado em uma série de álcool etílico (30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100%), levado ao secador de ponto crítico (CO2), montado, metalizado com ouro - paládio (35 nm) e, por fim, observados e eletromicrografados em microscópio eletrônico de varredura JEOL JSM 5410 (operado em 15 kV). Verificou-se que, aos seis dias após a enxertia, a soldadura para o porta-enxerto Passiflora alata já havia ocorrido, o que só foi constatado para Passiflora edulis f. flavicarpa aos nove dias. Também, aos nove dias, observou-se para ambos os porta-enxertos a completa formação da ponte de calo, indicando que, a partir daí, pode-se iniciar o processo de aclimatação da muda, para levá-la a um ambiente de menor umidade.

Estudo anatômico comparativo entre formas normais e estruturas teratogênicas provocadas por 2,4 -D em cana-de-açúcar

A aplicação do herbicida 2,4-D amina, para controlar plantas daninhas em cultura de cana-de-açúcar, produziu estruturas anormais e afetou a própria cultura da cana. Foram estuda das as alterações anatômicas e organográfícas dessas formas teratogénicas e comparadas com as estruturas normais. Foram observadas deformações no colmo que apresentou curvatur as e entrenós mais finos e curtos; o sistema radicular apresentou-se pouco desenvolvido. Na região do anel meristemático e saída das raízes adventícias, observou-se um intumescimento com tumoração e posterior necrose. Anatomicamente, na região do anel meristemático, a epiderme e o parênquima cortical apresentaram células hipertrofíadas e crescimento desordenado; houve malformação de feixes fibrovasculares. Na região das raízes adventícias foi observada tumoração com acentuada hiperplasia e necrose na periferia.

Interações entre auxinas e ácido bórico, no enraizamento de estacas caulinares de Coffea arabica L. cv. Mundo Novo

O presente trabalho teve como finalidade, estudar o efeito de auxinas e do boro no enraizamento de estacas caulinares de Coffea arabica L. cv. Mundo Novo. As estacas foram retiradas de ramos ortotrópicos semi-lenhosos de cafeeiro, as quais foram tratadas durante 24 horas com soluções de IBA ou NAA e boro, e a mistura das três substâncias, resultando um total de 14 tratamentos. Para a avaliação do objetivo em questão, foram realizadas as seguintes observações, mediante coleta após 90 dias de plantio: número de estacas enraizadas e número de estacas com calos. Através dos resultados obtidos, pode-se concluir que, para obter um maior número de estacas enraizadas, é conveniente o tratamento com NAA à 100 ou 200 ppm mais boro.

Efeitos da aplicação de reguladores vegetais e do ácido bórico, em estacas de lichieira (Litchi chinensis Sonn.)

Estudaram-se as interações entre os ácidos indol-butírico, alfa-naftaleno-acético e bórico no desenvolvimento de calos e na sobrevivência das estacas de lichieira (Litchi chinensis Sonn.). As estacas apresentavam 25 cm de comprimento e 4 folhas cortadas pela metade, sendo retiradas em duas épocas diferentes (janeiro e abril) e colocadas para enraizar em bandejas de isopor, tendo como substrato vermiculita e em condições de câmara de nebulização. Foi feita imersão de 2,5 cm da base das estacas, em soluções aquosas por l minuto. Os tratamentos utilizados corresponderam a 5.000 e 2.000 ppm de IBA; 3.000 e 1.500 ppra de NAA; 150 microgramas/ml de H3BO3; IBA 5.000 e 2.000 ppm + H3BO(3)150 microgramas/ml; NAA 3.000 e 1.500 ppm + H3BO3 150 microgramas/ml e H2O. Avaliou-se a formação de calos e a sobrevivência das estacas após 120 dias do plantio. Através dos resultados obtidos, foi possível concluir que dos tratamentos utilizados, nenhum foi efetivo na formação de raízes, havendo somente a formação de calos. A melhor época para a retirada de estacas correspondeu ao mês de abril.

Composites PVDF-TrFE/BT used as bioactive membranes for enhancing bone regeneration

In this paper a piezoelectric composite membranes were developed for charge generator to promoter bone regeneration on defects sites. Is known that the osteogenesis process is induced by interactions between biological mechanisms and electrical phenomena. The membranes were prepared by mixing Barium Titanate (BT) powders and PVDF-TrFE (PVDF:TrFE = 60:40 mol%) on dimethylformamide medium. This precursor solution was dried and crystallized at 100degreesC for 12 hours. Composites membranes were obtained by following methods: solvent casting (SC), spincoating (SP), solvent extraction by water addition (WS) and hot pressing (HP).The microstructural analysis performed by SEM showed connectivity type 3-0 and 3-1 with high homogeneity for samples of ceramic volume fraction major than 0.50. Powder agglomerates within the polymer matrix was evidenced were observed for composites with the BT volume fraction major than 40%. The composite of ceramic fraction of 0.55 presented the best values of remanent polarization (similar to33 muC/cm(2)), but the flexibility of these composites with the larger ceramic fraction was significantly affected.For in vivo evaluation PVDF-TrFE/BT 90/10 membranes with 3cm larger were longitudinally implanted under tibiae of male rabbit. After 21 days the animals were sacrificed. By histological analyses were observed neo formed bone with a high mitotic activity. In the interface bone-membrane was evidenced a pronounced callus formation. These results encourage further applications of these membranes in bone-repair process.

Utilização de plasma rico ou pobre em plaquetas, associado ou não a enxerto ósseo cortical alógeno, na reparação cirúrgica de falha ulnar em ovinos

Pós-graduação em Cirurgia Veterinária - FCAV

Germinação de sementes, enraizamento de estacas caulineares e cultivo in vitro de cubiu (Solanum sessiliflorum Dunal

Pós-graduação em Agronomia (Horticultura) - FCA