964 resultados para BIOLOGIA CELULAR
Resumo:
A medula ssea adulta possui duas populaes de clulas-tronco importantes no tratamento de diversas doenas hepticas: clulas-tronco hematopoiticas (CTHs) e clulas-tronco mesenquimais. A regenerao do fgado aps a hepatectomia um processo complexo que requer a proliferao de todas as clulas hepticas. Fatores de crescimento, citocinas e componentes da matriz extracelular so elementos-chave nesse processo. As lamininas so uma famlia de protenas de matriz extracelular, com funes adesivas e quimiotticas pelo recrutamento de integrinas e outros receptores de superfcie celular. No fgado normal, a laminina expressa nas veias porta e centrolobular. O objetivo desse estudo foi investigar a expresso de laminina durante a regenerao heptica induzida por hepatectomia parcial e aps o transplante de clulas mononucleares de medula ssea. As clulas mononucleares de medula ssea foram obtidas dos fmures e tbias de ratos, isoladas, marcadas com DAPI e injetadas pela veia porta em ratos recm-hepatectomizados. Os fgados foram coletados 15 minutos, 1 dia e 3 dias aps a hepatectomia e o transplante de clulas de medula ssea e congelados. Os cortes foram imunomarcados com anticorpos primrios anti-CD34 e anti-laminina de rato e observados em microscpio confocal de varredura a laser. Os resultados mostraram que 15 minutos aps a hepatectomia parcial, as clulas-tronco hematopoiticas CD34+ transplantadas foram encontradas em contato com a laminina localizada nas veias porta e centrolobular, indicando que a laminina poderia participar na adeso inicial das clulas-tronco a esses vasos logo aps o seu transplante. Alm disso, 1 e 3 dias aps a hepatectomia, as clulas mononucleares de medula ssea transplantadas foram observadas nos sinusides hepticos expressando laminina. Esses resultados sugerem que a laminina pode ser um componente da matriz extracelular importante para a adeso e enxerto de clulas de medula ssea no fgado aps uma leso. Ns tambm analisamos a expresso de osteopontina (OPN) em clulas de medula ssea e CTHs. Os resultados por microscopia confocal demonstraram que a maioria das clulas mononucleares de medula ssea recm-isoladas expressa quantidades variveis de OPN. Alm disso, algumas CTHs CD34+ tambm expressam OPN. Aps 1 e 4 dias de cultura, observamos uma diminuio de clulas expressando CD34, e um aumento na expresso de OPN pelas clulas mononucleares de medula ssea.
Resumo:
Este trabalho teve como objetivo investigar os efeitos da telmisartana (agonista PPAR-gama parcial), losartana (puro bloqueador do receptor AT1 da angiotensina II) e rosiglitazona (agonista PPAR-gama) em modelo experimental de sndrome metablica. Os alvos do estudo foram a presso arterial, metabolismo de carboidratos, resistncia insulnica, inflamao, tecido adiposo e fgado. Camundongos C57BL/6 (a partir de 3 meses de idade) foram alimentados com dieta padro (SC, n = 10) ou dieta hiperlipdica rica em sal (HFHS, n = 40) por 12 semanas. Aps esse tempo, os animais do grupo HFHS foram subdivididos em 4 grupos (n = 10): HFHS (sem tratamento), ROSI (HFHS tratado com rosiglitazona), TELM (HFHS tratado com telmisartana) e LOS (HFHS tratado com losartana) por 5 semanas. O grupo HFHS apresentou um significante ganho de peso e aumento da presso arterial sistlica, hiperinsulinemia com resistncia insulnica, hiperleptinemia, hipertrofia de adipcitos bem como um quadro de esteatose heptica e nveis aumentados da citocina inflamatria interleucina-6 (IL-6). Os animais tratados com telmisartana chegou ao final do experimento com massa corporal similar ao grupo SC, com reverso do quadro de resistncia insulnica, com presso arterial normal, adipcitos de tamanho normal e sem apresentar esteatose heptica. Alm disso, o tratamento com telmisartana aumentou a expresso de PPARγ e adiponectina no tecido adiposo epididimal. A expresso da protena desacopladora-1 (UCP-1) no tecido adiposo branco (TAB) tambm foi aumentada. O tratamento com losartana diminuiu a presso arterial para valores normais, porm com menores efeitos nos parmetros metablicos dos animais. O presente modelo experimental de ganho de peso e hipertenso induzidos por dieta mimetiza a sndrome metablica humana. Neste modelo, a telmisartana aumentou a expresso de UCP-1 no TAB, preveniu o ganho de peso e melhorou a sensibilidade insulina e a esteatose heptica dos camundongos C57BL/6, provavelmente devido ativao PPAR-gama.
Resumo:
O sangue do cordo umbilical e placentrio (SCUP) tem sido usado como fonte de clulas-tronco hematopoiticas (CTH) para reconstituir a funo medular (hematopoiese). A maioria das vezes, esta modalidade de transplante requer a criopreservao das CTH, que permanecem congeladas at uma possvel utilizao futura. Na criopreservao de CTH, o reagente qumico dimetilsulfxido (DMSO) tem sido utilizado como um crioprotetor. No entanto, tem sido provado que DMSO tem efeitos txicos para o corpo humano. Muitos organismos na natureza possuem uma capacidade de sobreviver ao congelamento e desidratao acumulando dissacardeos, como a trealose e sacarose, por isso a trealose, tem sido investigada como um crioprotetor alternativo para diversos tipos celulares. Outro dano muito comum durante o congelamento a formao de espcie reativas de oxignio (ERO) que diminui a viabilidade celular, por isso a adio de bioantioxidantes na soluo de criopreservao das clulas passo muito importante. Este estudo foi dividido em duas fases na primeira foram avaliados os resultados obtidos com a adio de antioxidantes na soluo de criopreservao das clulas de SCUP e na segunda fase avaliou-se a hiptese que a soluo de criopreservao contendo trealose intracelular e extracelular melhora a recuperao e a viabilidade das clulas-tronco do SCUP, aps a criopreservao. SCUP foi processado e submetido criopreservao em solues contendo na primeira fase: solues com diferentes concentraes de DMSO (10%, 5% e 2,5%), assim como as combinaes de DMSO (5%, 2,5%) com um dos dissacardeos (60mmol/L) e cido ascrbico e/ou catalase (10mg/mL); e na segunda fase: solues contendo diferentes concentraes de DMSO (10% e 2,5%), assim como as combinaes de DMSO (2,5%) com trealose intra (a trealose foi introduzida na clula por meio de lipossomas) e extracelular e solues contendo trealose intra e extracelular sem DMSO, armazenados por duas semanas em N2L, e descongeladas. As clulas descongeladas foram avaliadas por citometria de fluxo, pelo ensaio metablico pelo MTT e de unidades formadoras de colnias (UFC). Na primeira fase do estudo, a catalase, melhorou a preservao das clulas CD34+ e CD123+, a UFC e a viabilidade celular, em comparao com a soluo padro de criopreservao. J na segunda fase do estudo, aps as anlises de todos os testes vimos que a soluo que continha trealose intra/extracelular e DMSO mostrou uma capacidade de manuteno da viabilidade/integridade celular superior a todas as outras testadas. A soluo que continha trealose intra e extracelular sem DMSO, obteve um resultado comparvel com seu controle (2,5%DMSO), porm quando avaliamos a soluo que continha apenas trealose intracelular no obtivemos resultados satisfatrios. A catalase pode atuar sobre a reduo dos nveis ERO na soluo de criopreservao das CTH de SCUP, diminuindo os danos por ele causados e a trealose deve estar presente em ambos os lados das clulas durante o processo de congelamento. Portanto, em testes clnicos futuros, ela poder ser um potencial crioprotetor das clulas-tronco de SCUP, podendo substituir totalmente o DMSO da soluo de criopreservao, minimizando com os efeitos colaterais provenientes da infuso de produtos criopreservados nos pacientes.
Resumo:
A fibrose heptica o resultado de uma leso crnica, com a ativao de clulas inflamatrias e fibrognicas no fgado, as quais levam a um acmulo excessivo de protenas de matriz extracelular (MEC). Essas alteraes resultam na morte de clulas do fgado, com desorganizao e perda da funo do parnquima heptico. A cirrose o estgio avanado da fibrose, e culmina na falncia heptica, uma condio potencialmente fatal cujo nico tratamento efetivo o transplante de fgado, o qual limitado pela disponibilidade de rgos. Na busca por terapias alternativas visando a regenerao heptica, o transplante de clulas mononucleares de medula ssea (CMMO) mostrou resultados benficos e promissores em modelos animais e alguns protocolos clnicos. Entre essas clulas, esto as clulas-tronco hematopoiticas e mesenquimais, que apresentam potencial regenerativo e modulador da resposta inflamatria. Este estudo pretendeu avanar na compreenso dos mecanismos pelos quais as CMMO podem ajudar na regenerao heptica. Ratos com fibrose heptica induzida por ligadura do ducto biliar (LDB) foram transplantados com CMMO e comparados com ratos com fibrose sem transplante e ratos normais. Parmetros hepticos como componentes da MEC (colgeno total, colgenos tipos I e IV, laminina, metaloproteinases de matriz MMPs), componentes celulares (clulas fibrognicas, clulas de Kupffer e colangicitos) e enzimas hepticas foram analisados por microscopia de luz, microscopia confocal, western blotting e espectrofotometria. Os resultados mostraram que o transplante de CMMO contribui para a regenerao heptica de maneira global, (a) diminuindo o acmulo de colgeno e laminina; (b) aumentando a produo de MMPs que favorecem o remodelamento da MEC, principalmente por clulas de Kupffer; (c) normalizando a quantidade de colangicitos e diminuindo a quantidade de clulas fibrognicas; e (d) normalizando os nveis sanguneos das enzimas hepticas. Portanto, ns sugerimos que as CMMO podem ajudar na regenerao heptica atravs de mecanismos parcrinos e se diferenciando em clulas de Kupffer, contribuindo para a secreo de fatores antiinflamatrios e anti-fibrognicos no fgado com fibrose.
Resumo:
A toxoplasmose uma zoonose amplamente distribuda que afeta mais de um tero da populao mundial e de grande importncia na sade pblica. A maioria das infeces em humanos por Toxoplasma gondii assintomtica. A toxoplasmose amplamente investigada visto que se apresenta como uma doena grave em pessoas imunodeprimidas (portadores da sndrome da imunodeficincia adquirida (SIDA), no tratados, indivduos transplantados, paciente em tratamento quimioterpico ou em uso de drogas supressoras e gestantes). A toxoplasmose congnita frequentemente pode levar ao aborto espontneo ou at mesmo resultar na formao de crianas com algum grau de atraso no desenvolvimento mental e/ou fsicos, deste modo, a transmisso congnita pode ser muito mais importante do que se pensava, pois os parasitos encontrados na circulao sanguinea so capazes de infectar as clulas endoteliais dos vasos e os tecidos circunjacentes, podendo resultar no encistamento do T. gondii. Atualmente a toxoplasmose vem sendo investigada devido a sua associao a inmeras outras doenas, assim, estudos sobre a evoluo da infeco por T. gondii em diferentes tipos de clulas hospedeiras se fazem necessrios para uma abordagem teraputica adequada. Ao invadir a clula hospedeira o parasito possui a capacidade de recrutar as mitocndrias promovendo mudanas na organizao mitocondrial ao longo da progresso da infeco, garantindo um ambiente favorvel a sua multiplicao. Diante disso, investigamos se o parasito possui a capacidade de interferir no metabolismo mitocondrial e na resposta apopttica da clula endotelial. O presente trabalho teve como objetivo analisar o metabolismo mitocondrial atravs da respirometria de alta-resoluo e da resposta apopttica atravs do western blotting das clulas endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) infectadas por 2, 6 e 20 horas por taquizotos de T. gondii. A respirometria de alta-resoluo revelou que o parasito interfere no metabolismo energtico da clula hospedeira. A anlise do contedo de protenas da famlia Bcl-2 por western blotting revelou maior estmulo apopttico no tempo inicial de infeco, quando comparado aos demais tempos. Os resultados dos contedos de caspase 3, protena efetora da apoptose, no demonstrou diferena nos tempos iniciais de infeco Entretanto, em tempos mais tardios, o contedo de caspase 3 mostrou-se significativamente aumentado quando comparado s HUVEC no infectadas. A dinmica de replicao do parasito foi observada atravs do monitoramento pelo sistema Time-Lapse Nikon BioStation IMQ em tempo real das clulas infectadas por T.gondii. Portanto, nossos resultados sugerem que o protozorio ao recrutar as mitocndrias da clula hospedeira interfere no metabolismo mitocondrial e na modulao da apoptose para garantir um ambiente favorvel a sua multiplicao.
Resumo:
A diferenciao da oligodendroglia depende de alteraes coordenadas no citoesqueleto e na sua relao com a membrana plasmtica, um componente importante para a formao da bainha de mielina. A 23 nucleotdeo cclico 3 fosfodiesterase (CNPase) est relacionada com a organizao do citoesqueleto, sendo uma protena ancoradoura de microtbulos na membrana plasmtica. In vitro, a CNPase compe, com a F-actina e os microtbulos, as estruturas semelhantes a nervuras ou os componentes radiais. A glicoprotena associada a mielina (MAG), tambm importante para a formao dos vus de membrana e est associada a CNPase e a tubulina. Alm disso, as trs protenas podem ser reguladas pela via de sinalizao do AMPc/PKA. Buscando avaliar os efeitos da via do AMPc/PKA na regulao da diferenciao oligodendroglial, culturas de hemisfrios cerebrais com 5 dias foram tratadas por 30 min ou 24 h com o inibidor (SQ22356-SQ [1 M]) ou com o ativador (forscolina [10M]) da adenilato ciclase ou com o inibidor da PKA, H-89 [1 M]. A oligodendroglia foi identificada pelo anticorpo anti-CNPase e por sua morfologia. Com 30 min de tratamento com forscolina, as clulas das culturas tratadas apresentaram prolongamentos maiores e menos vus de membrana quando comparadas s culturas controle. O tratamento com SQ tambm causou um aumento no tamanho dos prolongamentos e o tratamento com H-89 causou a reduo no tamanho dos prolongamentos e nos vus de membrana. Com 24 h, as clulas tratadas com forscolina apresentaram poucos prolongamentos, j as culturas tratadas com SQ apresentaram um aumento no tamanho do prolongamento e as tratadas com H-89 demonstraram reduo no vu de membrana. Observamos tambm alteraes na distribuio da CNPase, tubulina e MAG, a primeira apresentou uma concentrao prxima ao ncleo depois dos dois tempos de tratamento com H-89, o mesmo ocorreu com a tubulina. A CNPase adquiriu ainda um padro puntiforme depois de 24 h de tratamento com ambos os inibidores. A MAG apresentou um aumento na concentrao prximo ao ncleo depois de 30 min de tratamento com forscolina e SQ. O tratamento com SQ tambm reduziu a distribuio da MAG nos vus de membrana. A mesma reduo foi observada depois de 24 h de tratamento com H-89. Esses resultados reforam a participao da via do AMPc/PKA no desenvolvimento da oligodendroglia, incluindo a formao dos prolongamentos, suas ramificaes e ainda a formao dos vus de membrana, com provveis consequncias na formao e manuteno da bainha de mielina.
Resumo:
Apesar do desenvolvimento de novas drogas antifngicas e da sua utilizao como terapia profiltica visando preveno de infeces fngicas invasivas, estas ainda constituem-se num problema emergente, com elevadas taxas de mortalidade. Neste contexto, destaca-se a aspergilose invasiva, uma infeco fngica oportunista que acomete pacientes com neutropenia profunda e prolongada, principalmente os pacientes com leucemia aguda ou submetidos a transplante de medula ssea. Aspergillus fumigatus, um fungo filamentoso, o principal agente etiolgico da aspergilose invasiva, sendo um patgeno angioinvasivo. As hifas deste fungo so capazes de causar injria e ativao endotelial, induzindo o endotlio a um fentipo pr-trombtico, que por sua vez, mediado pela secreo de citocinas pr-inflamatrias, em especial, o TNF-α. O presente trabalho teve como objetivo estudar a capacidade de cepas mutantes de A. fumigatus em ativar clulas endoteliais, avaliando o perfil de secreo de citocinas em meio condicionado e a expresso de fator tecidual. Resumidamente, monocamadas confluentes de clulas endoteliais isoladas da veia umbilical humana foram incubadas com condios e tubos germinativos de cepas selvagens (Af293 e Ku80) e mutantes (Δugm1, ΔcalA, ΔcrzA, ΔprtT) de A. fumigatus. A taxa de adeso e endocitose destas cepas s monocamadas de HUVEC foi avaliada a partir de um ensaio quantitativo de imunofluorescncia diferencial. O perfil cintico de secreo de citocinas foi determinado em meio condicionado das HUVECs, por ensaio de multiplex para IL-6, IL-8 e TNF-α. A ativao endotelial, por sua vez, foi determinada pela expresso de fator tecidual por RT-PCR em tempo real. Os resultados obtidos demonstraram que a mutante para o gene ugm1, responsvel por codificar a enzima UDP-galactopiranose mutase, que converte resduos de galactopiranose a galactofuranose, apresentou um fentipo hiperaderente s clulas endoteliais e um estmulo 10 vezes maior secreo de TNF-α e 2,5 vezes maior a secreo de IL-6, quando comparada a ativao observada para as cepas selvagens. A galactofuranose um componente importante de glicoconjugados da parede celular de A. fumigatus. Dessa forma, a ausncia desse monossacardeo na clula fngica leva a um mecanismo compensatrio caracterizado por um aumento na expresso de molculas de galactosaminogalactana na parede celular. De maneira contrria, mutantes para os genes calA e crzA, apresentaram um fentipo hipoaderente s HUVECs e uma perda na capacidade de induzir a secreo de citocinas e ativar o endotlio. Essas mutantes apresentam delees que interferem na via de clcio/calcineurina, responsvel por regular a morfognese e virulncia de A. fumigatus, alm de apresentarem alteraes no contedo de beta-1-3 glucana. J a cepa ΔprtT, mutante para o fator de transcrio prtT que regula a secreo de mltiplas proteases, apresentou um fentipo de adeso, estmulo e ativao endotelial semelhante ao observado para as cepas selvagens. A comparao entre a capacidade de condios e tubos germinativos em ativar clulas endoteliais, corroborou achados anteriores da literatura que reportam que s hifas so capazes de ativar clulas endoteliais, independentemente da sua viabilidade. Os dados deste estudo permitiram concluir que dentre os componentes de superfcie celular de A. fumigatus, os polmeros de galactose, em especial a galactosaminogalactana, parecem ser responsveis, pelo menos em parte, pelos mecanismos de interao e ativao endotelial.
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O cncer colorretal (CCR) o terceiro tipo de cncer mais incidente no mundo para o sexo masculino, o segundo para o sexo feminino e a radioterapia um dos tratamentos de primeira linha no combate a este tipo de cncer. Durante a progresso do CCR as clulas sofrem alteraes morfogenticas, sendo a desorganizao do complexo juncional apical (CJA) um dos eventos iniciais desse processo. As junes oclusivas (JTs) so um dos principais componentes da CJA e desempenham papel importante no controle do fluxo paracelular, na determinao da polaridade celular e na transduo de sinais relacionados com a progresso tumoral. As claudinas so protenas transmembrana, constituintes das JTs e cumprem um importante papel no controle desses eventos. Alteraes na expresso das claudinas so observadas em tumores de diferentes rgos e tm sido relacionadas com a progresso tumoral. No entanto os mecanismos que regulam essas alteraes e sua consequncia na progresso do CCR so poucos conhecidos. Desta forma, o presente estudo teve como objetivo avaliar a influncia da superexpresso da claudina-3 na radiorresposta de clulas CCR. Nossos resultados mostraram que a superexpresso de claudina-3 minimiza alteraes morfolgicas causadas pela radiao, causa diminuio da resistncia eltrica transepitelial e no tem efeito na permeabilidade a macromolculas aps a irradiao. Alm disso, observamos que a superexpresso de claudina-3 aumenta o potencial proliferativo das clulas e que esta caracterstica torna as clulas mais sensveis a radiao. Porm quando avaliamos eventos celulares relacionados a progresso tumoral observamos que apesar da radiao diminuir a capacidade migratria das prognies, as clulas que superexpressam claudina-3 apresentam migrao mais elevada. Alm disso, verificamos que a superexpresso de claudina-3 diminui a invaso e a capacidade de formao de colnias frente ao tratamento com a radiao. Em seguida fomos avaliar o efeito da inibio das vias de proliferao (MEK/ERK) e sobrevivncia (PI3K-Akt) na resposta das clulas que superexpressam claudina-3 frente a radiao. Observamos que a inibio de MEK capaz de sensibilizar as clulas que superexpressam claudina-3 radiao no ensaio de proliferao celular, no entanto a inibio de MEK e PI3K antes da exposio radiao capaz aumentar a migrao e a capacidade de formao de colnias de clulas que superexpressam claudina-3 contribuindo para o aumento do potencial maligno. Em conjunto nossos resultados mostram que a superexpresso de claudina-3 contribui para um fentipo mais maligno, no entanto frente ao tratamento com a radiao capaz de sensibilizar as clulas.
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A via de sinalizao da cinase regulada por fatores extracelulares, da famlia das protenas cinases ativadas por mitgenos (MAPK/ERK) importante tanto para a sobrevivncia como para a progresso da diferenciao de oligodendrcitos. Neste trabalho, a via da MAPK/ERK foi avaliada na oligodendroglia in vitro com a utilizao de inibidores da MEK. A morfologia celular, assim como a distribuio de protenas foram analisadas em diferentes estgios de maturao da oligodendroglia. Culturas primrias de oligodendrcitos foram tratadas com os inibidores da MEK PD98059 ou U0126, aos 5 ou 11dias in vitro (div), por 30min, 24 ou 48h. A oligodendroglia foi distinguida com marcadores estgio-especficos: A2B5, 23nucleotdeo cclico 3 fosfodiesterase (CNPase) e protena bsica de mielina (MBP), e classificada de acordo com sua morfologia em diferentes estgios de desenvolvimento. O tratamento aumentou significativamente o nmero de clulas com morfologia mais imatura e diminuiu o nmero de clulas maduras. Alm disso, aumentou o nmero de clulas redondas e sem prolongamentos as quais no puderam ser classificadas em nenhum dos estgios de desenvolvimento da oligodendroglia. Os efeitos mais evidentes foram observados logo aps o menor tempo de tratamento. Clulas redondas eram positivas para CNPase e MBP, porm no foram marcadas com A2B5 ou com NG2, indicando que seriam clulas maduras incapazes de estender ou manter seus prolongamentos. De fato, estas mudanas foram acompanhadas por alteraes na distribuio de protenas de oligodendrcitos como a MBP e a CNPase, assim como alteraes em protenas de citoesqueleto, como actina, tubulina e na cinase de adeso focal (FAK). A MBP foi observada nas clulas tratadas em um padro de distribuio desorganizado e disperso, oposto ao padro contnuo que observado nas clulas das culturas controle. Alm disso, o tratamento causou uma desorganizao na distribuio da CNPase, actina e tubulina. Nas clulas das culturas controle, estas protenas apresentam um padro organizado compondo as estruturas de citoqueleto semelhantes a nervuras. Aps um pequeno perodo de tratamento (30min), actina e tubulina apresentaram o mesmo padro de marcao puntiforme que a CNPase apresentou. O tratamento tambm reduziu os pontos de adeso focal demonstrados pela FAK. Com o decorrer do tratamento, aps 24 e 48h, actina e tubulina aparentavam estar se reorganizando em um padro filamentar. Estes resultados indicam um efeito importante da via da MAPK/ERK na ramificao e alongamento dos prolongamentos dos oligodendrcitos, com possveis consequncias para a formao da bainha de mielina.
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Nos meados da dcada de 60, o Nobel da Medicina Sidney Brenner props a utilizao do nemtode bacterifago, do solo, Caenorhabditis elegans, tambm conhecido como C. elegans, para estudos de gentica e desenvolvimento, dado possuir um conjunto de caractersticas que o tornavam o ideal para modelo biolgico, nomeadamente a sua pequena dimenso (ca. de 1 mm), facilidade de observao, facilidade de cultivo e manuteno em laboratrio, curto ciclo de vida com uma capacidade reprodutiva notvel, presena de hermafroditas e machos (5%). O seu artigo seminal de 1974, The genetics of C. elegans abriu o caminho para a investigao nesta rea. Hoje em dia, revistas como a Nature, Science, Genes and Development, etc publicam frequentemente os resultados da investigao com recurso a este modelo. de notar, no entanto, que os nemtodes tm sido utilizados h muito tempo como modelo de estudo, tais como van Beneden, em finais do sculo XIX, que observando clulas de Ascaris equorum, descobriu o fenmeno da meiose. O fenmeno da fertilizao foi igualmente descoberto num nemtode. Desde a dcada de setenta at aos nossos dias, o C. elegans tem sido intensamente utilizado para estudos de anatomia interna e sua correlao com linhagens celulares e desenvolvimento. Assim, Sulston e Horvitz elucidaram a origem e desenvolvimento das 959 clulas somticas que, de uma forma constante, se produzem nesta espcie (eutelia). Um dos primeiros sistemas a ser estudado foi o sistema nervoso, sendo este nemtode o primeiro animal de que se conhece perfeitamente a identidade de todos os neurnios, a sua linhagem e o circuito nervoso global. Para alm de modelo de biologia do desenvolvimento, o C. elegans tem sido alvo de estudo do fenmeno do envelhecimento celular, tendo sido possvel identificar os respectivos genes. Kennyon, nos anos 90, e mais recentemente Arantes e Oliveira, tm demonstrado ser possvel prolongar a vida deste animal de 21 para mais de 180 dias, o que corresponde a 675 anos em vida humana, atravs de manipulaes diversas, tais como agentes mutagnicos, ablao com raio laser, etc.. Tambm o mecanismo de morte celular programada ou apoptose tem sido estudado neste modelo. Em 2002, o Comit Nobel entendeu atribuir o prmio Nobel da Medicina a Brenner, Sulston e Horvitz for their discoveries concerning genetic regulation of organ development and programmed cell death. interessante notar pela leitura de The common thread, de John Sulston, a importncia decisiva da sequenciao do genoma de C. elegans, em 1998, para o avano na sequenciao do genoma humano efectuada em 2000, e de cuja mega-equipa Sulston participou de forma decisiva. Finalmente, e como modelo pedaggico, o nemtode C. elegans constitui a escolha ideal para diversas disciplinas dos cursos de Biologia, tais como Biologia celular, Histologia, Biologia do Desenvolvimento, Gentica, Etologia, etc.
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Tese de dout., Bioqumica (Biologia Celular e Molecular), Faculdade de Cincias e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2010
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We report the exploration of some unique metabolic pathways in Perkinsus olseni a marine protist parasite, responsible to significant mortalities in mollusks, especially in bivalves all around the world. In Algarve, south of Portugal carpet shell clam Ruditapes decussatus mortalities can reach up to 70%, causing social and economic losses. The objective of studying those unique pathways, is finding new therapeutic strategies capable of controlling/eliminating P. olseni proliferation in clams. In that sense metabolic pathways, were explored, and drugs affecting these cycles were tested for activity. The first step involved the identification of the genes behind those pathways, the reconstitution of the main steps, and molecular characterization of those genes and later on, the identification of possible targets within the genes studied. Metabolic cycles were screened due to the fact of not being present in host or differ in a critical way, such as the following pathways: shikimate, MEP- isoprenoids, Leloir cycle for chitin production, purine biosynthesis (unique among protists), the de novo synthesis of folates (absent in metazoa) and some unique genes like, the alternative oxidase (a branch of respiratory chain) and the hypoxia sensor HPH. All those pathways were covered and possible chemical inhibition using therapeutic drugs was tested with positive results. The relation between the common host Ruditapes decussatus and P. olseni was also explored in a dimension not possible some years ago. With the accessibility to second generation sequencers and microarray analysis platforms, genes involved in host defense or parasite virulence and resistance to the host were deciphered, allowing aiming to new targets (mechanisms and pathways), offering new possibilities for the control of Perkinsus in close environments. The thousands of genes, generated by this work, sequenced and analyzed from this commercial valuable clam and for Perkinsus olseni will be an important and value tool for the scientific community, allowing a better understanding of host-parasite interactions, promoting the usage of P. olseni as an emerging model for alveolata parasites.
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ATP binding cassette (ABC) and solute carrier (SLC) transporters are responsible for the majority of the transcellular movement of various substrates, including drugs, among epithelial cells. Despite the well characterized regulation of influx (SLC) and efflux (ABC) transporters by endogenous mediators, such as inflammatory cytokines, little is known about how changes in oxygen levels may affect expression of these transporters. In this study we showed that the expression of SLC22A4, SLC22A5, SLC22A1, SLC02B1, SLC10A2, ABCC2 and ABCC3 transporters is upregulated by hypoxia in HT29 colon carcinoma cells, but not in HepG2 hepatocarcinoma cells. Moreover, OCTN1 (SLC22A4), OCT1 (SLC22A1) and OATP-B (SLC02B1) transporter expression is also induced by inflammatory cytokines but in a smaller extent than in hypoxia. Furthermore our experiments indicate that there is no cross talk between HIF-1 and NF-B pathways in HT-29 cells, but these two pathways act simultaneously activating common genes, such as, some SLC and ABC transporters. Our preliminary results from studies with an in vivo murine model of colitis, suggest that HIF-1is stabilized and OCTN1 is strongly induced during severe inflammation, which can be relevant for a recovery from the inflammatory process. We have also been interested in the distribution of HIF-1 variants among different ethnic groups as well as their contribution for cancer risk. Thus, we have demonstrated that there is an ethnicity-related variation in the frequency of the C1772T (P582S) single nucleotide polymorphism (SNP) in the HIF-1 gene. Furthermore, we performed a case-control study in a breast cancer population and our results suggest that there is no association between this SNP or the rare G1790A (A588T) SNP and the incidence of breast cancer. Taken together, the results obtained in this study contribute to a better knowledge of drug influx and efflux during hypoxia and inflammation as well as to the understanding of the pharmacogenetic variability of the HIF-1.
Resumo:
Induced pluripotent stem cells (iPSc) have great potential for applications in regenerative medicine, disease modeling and basic research. Several methods have been developed for their derivation. The original method of Takahashi and Yamanaka involved the use of retroviral vectors which result in insertional mutagenesis, presence in the genome of potential oncogenes and effects of residual transgene expression on differentiation bias of each particular iPSc line. Other methods have been developed, using different viral vectors (adenovirus and Sendai virus), transient plasmid transfection, mRNA transduction, protein transduction and use of small molecules. However, these methods suffer from low efficiencies; can be extremely labor intensive, or both. An additional method makes use of the piggybac transposon, which has the advantage of inserting its payload into the host genome and being perfectly excised upon re-expression of the transposon transposase. Briefly, a policistronic cassette expressing Oct4, Sox2, Klf4 and C-Myc flanked by piggybac terminal repeats is delivered to the cells along with a plasmid transiently expressing piggybac transposase. Once reprogramming occurs, the cells are re-transfected with transposase and subclones free of tranposon integrations screened for. The procedure is therefore very labor intensive, requiring multiple manipulations and successive rounds of cloning and screening. The original method for reprogramming with the the PiggyBac transposon was created by Woltjen et al in 2009 (schematized here) and describes a process with which it is possible to obtain insert-free iPSc. Insert-free iPSc enables the establishment of better cellular models of iPS and adds a new level of security to the use of these cells in regenerative medicine. Due to the fact that it was based on several low efficiency steps, the overall efficiency of the method is very low (<1%). Moreover, the stochastic transfection, integration, excision and the inexistence of an active way of selection leaves this method in need of extensive characterization and screening of the final clones. In this work we aime to develop a non-integrative iPSc derivation system in which integration and excision of the transgenes can be controlled by simple media manipulations, avoiding labor intensive and potentially mutagenic procedures. To reach our goal we developed a two vector system which is simultaneously delivered to original population of fibroblasts. The first vector, Remo I, carries the reprogramming cassette and GFP under the regulation of a constitutive promoter (CAG). The second vector, Eneas, carries the piggybac transposase associated with an estrogen receptor fragment (ERT2), regulated in a TET-OFF fashion, and its equivalent reverse trans-activator associated with a positive-negative selection cassette under a constitutive promoter. We tested its functionality in HEK 293T cells. The protocol is divided in two the following steps: 1) Obtaining acceptable transfection efficiency into human fibroblasts. 2) Testing the functionality of the construct 3) Determining the ideal concentration of DOX for repressing mPB-ERT2 expression 4) Determining the ideal concentration of TM for transposition into the genome 5) Determining the ideal Windows of no DOX/TM pulse for transposition into the genome 6) 3, 4 and 5) for transposition out of the genome 7) Determination of the ideal concentration of GCV for negative selection We successfully demonstrated that ENEAS behaved as expected in terms of DOX regulation of the expression of mPB-ERT2. We also demonstrated that by delivering the plasmid into 293T HEK cells and manipulating the levels of DOX and TM in the medium, we could obtain puromycin resistant lines. The number of puromycin resistant colonies obtained was significantly higher when DOX as absent, suggesting that the colonies resulted from transposition events. Presence of TM added an extra layer of regulation, albeit weaker. Our PCR analysis, while not a clean as would be desired, suggested that transposition was indeed occurring, although a background level of random integration could not be ruled out. Finally, our attempt to determine whether we could use GVC to select clones that had successfully mobilized PB out of the genome was unsuccessful. Unexpectedly, 293T HEK cells that had been transfected with ENEAS and selected for puromycin resistance were insensitive to GCV.
Resumo:
Tese de doutoramento, Farmcia (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmcia, 2014
