Padrões evolutivos de famílias multigênicas de RNAs (RNAsn e RNAr) no genoma do gafanhoto Abracris flavolineata, com ênfase no cromossomo B

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Organização cromossômica e molecular do DNAr 5S em duas espécies de gafanhotos do gênero Abracris (Acrididae/Ommatolampidinae)

Os DNAs repetitivos compõem grande porção dos genomas eucariotos e estão organizados em distintos grupos, essencialmente DNAs satélite, microsatélites, minisatélites, elementos de transposição (transposons e retrotransposons) e famílias multigênicas. Estas sequências têm sido úteis nas análises cromossômicas com enfoque em estudos de diversificação cariotípica e de estrutura e evolução dos genomas. Os gafanhotos da família Acrididae representam o grupo com maior diversidade da ordem Orthoptera e apresentam do ponto de vista cromossômico ampla conservação com 2n=23,X0 (macho) na maioria das espécies estudadas. Análises enfocando o entendimento da estrutura das sequências de DNAs repetitivos neste grupo são escassas, e em geral restritas ao mapeamento de algumas famílias multigênicas. Outras sequências repetitivas, tais como DNAs satélites, genes de histonas e DNAr 5S foram realizadas principalmente em espécies de Acridídeos ocorrentes na Europa. No presente trabalho foram isolados e caracterizados do ponto de vista cromossômico e molecular o gene de DNAr 5S e seu espaçador não transcrito (NTS) nas espécies de acridídeos (Ommatolampidinae) Abracris flavolineata e Abracris dilecta. Estas análises permitiram um aprofundamento no conhecimento da estrutura/evolução desta sequência de DNA repetitivo entre as duas espécies, testando-se os possíveis modelos de evolução para esta sequência, que incluem evolução em concerto, nascimento e morte ou modelo misto

Esttrutura cromossômica e caracterização cariotípica no gênero Characidium (Teleostei, Characiformes, Crenuchidae)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Padrões evolutivos de famílias multigênicas de RNAs (RNAsn e RNAr) no genoma do gafanhoto Abracris flavolineata, com ênfase no cromossomo B

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Organização cromossômica e molecular do DNAr 5S em duas espécies de gafanhotos do gênero Abracris (Acrididae/Ommatolampidinae)

Os DNAs repetitivos compõem grande porção dos genomas eucariotos e estão organizados em distintos grupos, essencialmente DNAs satélite, microsatélites, minisatélites, elementos de transposição (transposons e retrotransposons) e famílias multigênicas. Estas sequências têm sido úteis nas análises cromossômicas com enfoque em estudos de diversificação cariotípica e de estrutura e evolução dos genomas. Os gafanhotos da família Acrididae representam o grupo com maior diversidade da ordem Orthoptera e apresentam do ponto de vista cromossômico ampla conservação com 2n=23,X0 (macho) na maioria das espécies estudadas. Análises enfocando o entendimento da estrutura das sequências de DNAs repetitivos neste grupo são escassas, e em geral restritas ao mapeamento de algumas famílias multigênicas. Outras sequências repetitivas, tais como DNAs satélites, genes de histonas e DNAr 5S foram realizadas principalmente em espécies de Acridídeos ocorrentes na Europa. No presente trabalho foram isolados e caracterizados do ponto de vista cromossômico e molecular o gene de DNAr 5S e seu espaçador não transcrito (NTS) nas espécies de acridídeos (Ommatolampidinae) Abracris flavolineata e Abracris dilecta. Estas análises permitiram um aprofundamento no conhecimento da estrutura/evolução desta sequência de DNA repetitivo entre as duas espécies, testando-se os possíveis modelos de evolução para esta sequência, que incluem evolução em concerto, nascimento e morte ou modelo misto

Esttrutura cromossômica e caracterização cariotípica no gênero Characidium (Teleostei, Characiformes, Crenuchidae)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Caracterização de rearranjos cromossômicos citogeneticamente equilibrados associados a quadros clínicos

Este estudo teve como objetivos (a) identificar mecanismos pelos quais rearranjos cromossômicos citogeneticamente equilibrados possam estar associados de maneira causal a determinados quadros clínicos e (b) contribuir para a compreensão dos mecanismos de formação desses rearranjos. Para isso, foram estudados 45 rearranjos cromossômicos citogeneticamente equilibrados (29 translocações, 10 inversões e seis rearranjos complexos), detectados em pacientes que apresentavam malformações congênitas, comprometimento do desenvolvimento neuropsicomotor ou déficit intelectual. Foram 31 rearranjos cromossômicos esporádicos, três familiais que segregavam com o quadro clínico e mais 11 rearranjos cromossômicos herdados de genitores fenotipicamente normais. Inicialmente os pontos de quebra desses rearranjos foram mapeados por hibridação in situ fluorescente (FISH). A busca por microdeleções e duplicações genômicas foi realizada por a-CGH. A investigação dos pontos de quebra prosseguiu com a aplicação da técnica de Mate-Pair Sequencing (MPS), que permite localizar as quebras em segmentos de 100 pb - 1 kb, na maioria dos casos. Para obter os segmentos de junção das quebras no nível de pares de bases, os segmentos delimitados por MPS foram sequenciados pelo método de Sanger. A análise por aCGH revelou microdeleções ou microduplicações localizadas nos cromossomos rearranjados, em 12 dos 45 pacientes investigados (27%). A análise de 27 rearranjos por MPS permitiu a caracterização dos pontos de junção das quebras. MPS expandiu o número de pontos de quebra, detectados por análise do cariótipo ou aCGH, de 114 para 156 (em resolução < 2kb, na maioria dos casos). O número de pontos de quebra/rearranjo variou de 2 a 20. Os 156 pontos de quebra resultaram em 86 variantes estruturais equilibradas e outras 32 variantes não equilibradas. Perdas e ganhos de segmentos submiscroscópicos nos cromossomos rearranjados constituíram a principal causa ou, provavelmente, contribuíram para o quadro clínico de 12 dos 45 pacientes. Em cinco desses 12 rearranjos foram detectadas por MPS a interrupção de genes já relacionados à doença, ou provável alteração de sua região reguladora, contribundo para o quadro clínico. Em quatro dos 33 rearranjos não associados a perdas ou ganhos de segmentos, a análise por MPS revelou a interrupção de genes que já foram anteriormente relacionados a doenças, explicando-se, assim, as características clínicas dos portadores; outro rearranjo pode ter levando alteração da expressão gênica de gene sensível a dosagem e ao quadro clínico. Um rearranjo cromossômico familial, identificado na análise após bandamento G como uma translocação equilibrada, t(2;22)(p14;q12), segregava com quadro de atraso do desenvolvimento neuropsicomotor e dificuldade de aprendizado associados a dismorfismos. A combinação das análises por FISH, aCGH e MPS revelou que se tratava, na verdade, de rearranjo complexo entre os cromossomos 2, 5 e 22, incluindo 10 quebras. A segregação de diferentes desequilíbrios submicroscópicos em indivíduos afetados e clinicamente normais permitiu a compreensão da variabilidade clínica observada na família. Rearranjos equilibrados detectados em indivíduos afetados, mas herdados de genitores clinicamente normais, são, em geral, considerados como não tendo relação com o quadro clínico, apesar da possibilidade de desequilíbrios cromossômicos gerados por permuta desigual na meiose do genitor portador do rearranjo. Neste trabalho, a investigação de 11 desses rearranjos por aCGH não revelou perdas ou ganhos de segmentos nos cromossomos rearranjados. No entanto, a análise por aCGH da portadora de um desses rearranjos - inv(12)mat - revelou deleção de 8,7 Mb no cromossomo 8, como causa de seu fenótipo clínico. Essa deleção estava relacionada com outro rearranjo equilibrado também presente em sua mãe, independente da inversão. Para compreender os mecanismos de formação de rearranjos citogeneticamente equilibrados, investigamos os segmentos de junção no nível de pares de base. A análise por MPS que levou, na maioria dos casos, ao mapeamento dos pontos de quebras em segmentos <1kb permitiu o sequenciamento pelo método de Sanger de 51 segmentos de junções de 17 rearranjos. A ocorrência de blunt fusions ou inserções e deleções <10 pb, e a ausência de homologia ou a presença de micro homologia de 2 pb a 4 pb de extensão indicaram o mecanismo de junção de extremidades não homólogas (non-homologous end joinging; NHEJ), na maioria das 51 junções caracterizadas. As características de três dos quatro rearranjos mais complexos, com 17-20 quebras, indicaram sua formação pelo mecanismo de chromothripsis. Este estudo mostra a importância da análise genômica de variações de número de cópias por microarray, juntamente com o mapeamento dos pontos de quebra por MPS, para determinar a estrutura de rearranjos cromossômicos citogeneticamente equilibrados e seu impacto clínico. O mapeamento dos segmentos de junção por MPS, permitindo o sequenciamento pelo método de Sanger, foi essencial para a compreensão de mecanismos de formação desses rearranjos

Expression profiling and sequence diversity of novel DREB genes from common bean (Phaseolus vulgaris L.) and their association with drought-related traits

Common bean is a major dietary component in several countries, but its productivity is negatively affected by abiotic stresses. Dissecting candidate genes involved in abiotic stress tolerance is a paramount step toward the improvement of common bean performance under such constraints. Thereby, this thesis presents a systematic analysis of the DEHYDRATION RESPONSIVE ELEMENT-BINDING (DREB) gene subfamily, which encompasses genes that regulate several processes during stress responses, but with limited information for common bean. First, a series of in silico analyses with sequences retrieved from the P. vulgaris genome on Phytozome supported the categorization of 54 putative PvDREB genes distributed within six phylogenetic subgroups (A-1 to A-6), along the 11 chromosomes. Second, we cloned four novel PvDREB genes and determined their inducibility-factors, including the dehydration-, salinity- and cold-inducible genes PvDREB1F and PvDREB5A, and the dehydration- and cold-inducible genes PvDREB2A and PvDREB6B. Afterwards, nucleotide polymorphisms were searched through Sanger sequencing along those genes, revealing a high number of single nucleotide polymorphisms within PvDREB6B by the comparison of Mesoamerican and Andean genotypes. The nomenclature of PvDREB6B is discussed in details. Furthermore, we used the BARCBean6K_3 SNP platform to identify and genotype the closest SNP to each one of the 54 PvDREB genes. We selected PvDREB6B for a broader study encompassing a collection of wild common bean accessions of Mesoamerican origin. The population structure of the wild beans was accessed using sequence polymorphisms of PvDREB6B. The genetic clusters were partially associated with variation in latitude, altitude, precipitation and temperature throughout the areas such beans are distributed. With an emphasis on drought stress, an adapted tube-screening method in greenhouse conditions enabled the phenotyping of several drought-related traits in the wild collection. Interestingly, our data revealed a correlation between root depth, plant height and biomass and the environmental data of the location of the accessions. Correlation was also observed between the population structure determined through PvDREB6B and the environmental data. An association study combining data from the SNP array and DREB polymorphisms enabled the detection of SNP associated with drought-related traits through a compressed mixed linear model (CMLM) analysis. This thesis highlighted important features of DREB genes in common bean, revealing candidates for further strategies aimed at improvement of abiotic stress tolerance, with emphasis on drought tolerance

Padrões temporais e grau de diversificação cariotípica em espécies atlânticas da família Acanthuridae (Perciformes)

The Acanthuridae family is a representative group from the marine fish that plays a key role in ecological dynamics of coral reefs. Three species are common along coastal reefs of Western Atlantic: Acanthurus coeruleus, Acanthurus bahianus and Acanthurus chirurgus. In the present study, cytogenetic data are presented for these three species Acanthurus based on classical cytogenetic methods and mapping of repetitive sequences such as ribosomal 18S and 5S rDNA and telomeric repeats to improve their karyotype evolutionary analyses. The cytogenetic pattern of these species indicated sequential steps of chromosomal rearrangements dating back 19 to 5 millions of years ago (M.a.) that accounted for their interspecific differences. A. coeruleus (2n=48; 2sm+4st+42a), A. bahianus (2n=36; 12m+2sm+4st+18a) and A. chirurgus (2n=34; 12m+2sm+4st+16a) share an older set of three chromosomal pairs that were originated through pericentric inversions. A set of six large metacentric pairs formed by Robertsonian (Rb) translocations found in A. bahianus and A. chirurgus and a putative in tandem fusion found in A. chirurgus are more recent events. The lack of interstitial telomeric sequences (ITS) in spite of several centric fusions in A. bahianus and A. chirurgus might be related to the long period of time after their occurrence (estimated in 5 M.a.). Furthermore, the homeologies among the chromosome pairs bearing ribosomal genes, in addition to other structural features, highlight large conserved chromosomal regions in the three species. Our findings indicate that macrostructural changes occurred during the cladogenesis of these species were not followed by conspicuous microstructural rearrangements in the karyotypes.

Validação de espécies de Centropomus (Centropomidae, Perciformes) do litoral do Rio Grande do Norte através de caracterização citogenética e molecular

The Centropomidae family consists of three genera, Centropomus, Lates and Psammoperca. Centropomus is the most diverse group, with six Centropomus species occur in the Western Atlantic Ocean C. poeyi Chávez, 1961, C. parallelus Poey, 1860, C. mexicanus Bocourt, 1868, C. pectinatus Poey, 1860 and C. ensiferus Poey, 1860. Some of these species are considered cryptic, because of its morphological traits showed low resolution for identification purposes. Despite showing great interest as a natural resource and fish culture, aspects of their diversity and karyotypic patterns are poorly understood. In this work morphological identification and comparison of mitochondrial 16S gene sequence were used to identify the species of the genus Centropomus occurring in Rio Grande do Norte, northeastern Brazil. Two sepecies were identified, C. undecimalis and C. mexicanus, which had the chromosomal aspects analyzed, through Classical cytogenetic method analyzes (conventional staining, C-banding, Ag-NORs), fluorochrome staining AT- and GC-specific, replication bands by incorporating of the base analog 5-Bromo-2’-deoxyuridine (5-BrdU), in situ chromosomal mapping of (TTAGGG)n sequences and in situ chromosome mapping 18S and 5S rRNA genes. Both species show 2n=48 acrocentric chromosomes, with ribosomal sites (Ag-NOR/18S rDNA/ Mitramycin+) in second chromosomal pair, in telomeric position on the long arm in C. mexicanus and interstitial in C. undecimalis. The nuclear organization pair (pair 2) shown a resolutive cytotaxonomic marker for these two species. The generated data reveal a lower species diversity than previously believed, suggesting that greater attention should be paid in taxonomic identification of the species, in view of optimize commercial actions exploitation, biological conservation and cultivation.

Diversidade cromossômica e padrões ecomorfológicos em Gobiidae (Perciformes) no litoral e ilhas oceânicas do Brasil

A família Gobiidae é a mais diversificada no ambiente marinho, onde tamanha diversidade parece ter sido acompanhada por alterações cromossômicas significativas, a tornando um modelo biológico importante. Em geral apresentam ampla distribuição geográfica com características comportamentais e reprodutivas que as tornam propícias aos efeitos de barreiras biogeográficas. Comparados a outros representantes da ordem Perciformes apresenta características morfológicas reduzidas, com simplificações e perdas que dificultam estudos filogenéticos e tornam imprescindível a associação de novas metodologias para melhor entendimento dos processos ecológicos e evolutivos que garantiram tamanha diversificação. Dados citogenéticos para espécies presentes no litoral brasileiro são ínfimos. Os resultados aqui apresentados, abrangendo um maior espectro taxonômico e profundidade de análises, identificaram marcante diversidade cariotípica estrutural interespecífica para Coryphopterus glaucofraenum, Bathygobius mystacium, Bathygobius soporator, Bathygobius sp., Ctenogobius smaragdus, Ctenogobius boleosoma, Gobionellus oceanicus, Gobionellus stomatus, Microgobius meeki e Evorthodus lyricus. As espécies estudadas fazem parte de uma fauna críptica pouco percebida e estudada, frequentemente impactadas, mesmo por eventos locais estocásticos. Análises por morfometria geométrica indicaram variação significante na morfologia corporal de espécies do gênero Bathygobius e o reconhecimento de padrões de variação de forma corporal referentes ao sexo, com populações mais dimórficas em menores latitudes. Técnicas citogenéticas moleculares resolutivas aplicadas em estudos populacionais no litoral e em ilhas oceânicas identificaram diferenciações locais e reconheceram uma nova espécie para o gênero Bathygobius, residente no Atol das Rocas e Arquipélago de Fernando de Noronha. As análises ainda possibilitaram a descrição de cromossomos sexuais XY nas duas espécies do gênero Gobionellus e a participação de elementos repetitivos na diferenciação deste sistema. Os dados aqui apresentados dão suporte ao alto grau de diversificação evolutiva da família, ampliam o conhecimento citogenético para o grupo, permitem identificar estruturações populacionais e respostas evolutivas das espécies às variações geográficas. Como modelo biológico a família Gobiidae representa um útil contraponto evolutivo em relação aos padrões genéticos vigentes às espécies de grande vagilidade.

Variabilidade genética de Leishmania spp. circulantes entre seres humanos e cães e infecção de flebotomíneos em áreas endêmicas para as leishmanioses no Rio Grande do Norte

Leishmania infantum is the main etiologic agent of visceral leishmaniasis in the New World. The pattern of distribution of leishmaniasis has changed substantially and has presented an emerging profile within the periphery of the Large Urban Centers. Leishmania infection can compromise skin, mucosa and viscera. Only 10% of the individuals infected develop the disease and 90% of human infection is asymptomatic. The main factors involved in the development of the disease are the host immune response, the vector’s species and the parasite’s genetic content. The sequencing of Leishmania isolated seeks to increase the understanding of the symptoms of individuals. The aim of this study was to evaluate the genetic diversity of circulating Leishmania strains among humans, and symptomatic and asymptomatic, and dogs from endemic areas of Rio Grande do Norte State and analyze sandflies from endemic areas for cutaneous and visceral disease. The genetic variability was evaluated by the use of markers hsp70 , ITS1 and a whole genome sequencing was also carried out. The amplified hsp70 and ITS1 of samples were analyzed and assembled using a Phred / Phrap package. The dendograms were constructed using the same methodology, but adding 500 bootstraps, followed by inferences on the relationships between Leishmania variants. The sequences of the 20 Brazilian isolates were mapped to the reference genome L. infantum JPCM5, using the Bowtie2 program and the identification of 36 contigs. The information of the valid SNPs were used in the PCA. SNPs were visualized by Geneious 7.1 and IGV. The genome annotations were transferred to their respective chromosomes and displayed on Geneious. The matching sequences of all chromosomes were aligned using Mauve. The phylogenetic trees were calculated according to maximum likelihood and JTT models. Sandflies were analyzed by PCR for the identification of Leishmania infection, a blood meal source and GAPDH sand fly. As a result, hsp70 and ITS1 were not capable of identifying genetic variability among human isolates from symptomatic and asymptomatic, and dogs. The complete sequencing of the 20 Brazilian isolates revealed a strong similarity between the circulating Leishmania strains in Rio Grande do Norte. The isolates collected in the city of Natal from humans and canines remained grouped in all analyzes, suggesting that there is genotypic and geographic proximity among the isolates. The isolated samples in the 1990s had a higher genotypic diversity when compared to freshly isolated samples. All isolates presented 36 chromosomes with variable ploidy among them, no correlation was found between the number of amastina genes copies, gp63, A2 and SSG with such clinic forms. In general, we did not find correlation between symptomatic and asymptomatic clinical forms and the gene content of the Brazilian isolates of Leishmania. 34,28% of the sandflies collected in the upper west region were L. longipalpis and the main sources of blood meal were humans, dogs and chickens.

Variabilidade genética de Leishmania spp. circulantes entre seres humanos e cães e infecção de flebotomíneos em áreas endêmicas para as leishmanioses no Rio Grande do Norte

Leishmania infantum is the main etiologic agent of visceral leishmaniasis in the New World. The pattern of distribution of leishmaniasis has changed substantially and has presented an emerging profile within the periphery of the Large Urban Centers. Leishmania infection can compromise skin, mucosa and viscera. Only 10% of the individuals infected develop the disease and 90% of human infection is asymptomatic. The main factors involved in the development of the disease are the host immune response, the vector’s species and the parasite’s genetic content. The sequencing of Leishmania isolated seeks to increase the understanding of the symptoms of individuals. The aim of this study was to evaluate the genetic diversity of circulating Leishmania strains among humans, and symptomatic and asymptomatic, and dogs from endemic areas of Rio Grande do Norte State and analyze sandflies from endemic areas for cutaneous and visceral disease. The genetic variability was evaluated by the use of markers hsp70 , ITS1 and a whole genome sequencing was also carried out. The amplified hsp70 and ITS1 of samples were analyzed and assembled using a Phred / Phrap package. The dendograms were constructed using the same methodology, but adding 500 bootstraps, followed by inferences on the relationships between Leishmania variants. The sequences of the 20 Brazilian isolates were mapped to the reference genome L. infantum JPCM5, using the Bowtie2 program and the identification of 36 contigs. The information of the valid SNPs were used in the PCA. SNPs were visualized by Geneious 7.1 and IGV. The genome annotations were transferred to their respective chromosomes and displayed on Geneious. The matching sequences of all chromosomes were aligned using Mauve. The phylogenetic trees were calculated according to maximum likelihood and JTT models. Sandflies were analyzed by PCR for the identification of Leishmania infection, a blood meal source and GAPDH sand fly. As a result, hsp70 and ITS1 were not capable of identifying genetic variability among human isolates from symptomatic and asymptomatic, and dogs. The complete sequencing of the 20 Brazilian isolates revealed a strong similarity between the circulating Leishmania strains in Rio Grande do Norte. The isolates collected in the city of Natal from humans and canines remained grouped in all analyzes, suggesting that there is genotypic and geographic proximity among the isolates. The isolated samples in the 1990s had a higher genotypic diversity when compared to freshly isolated samples. All isolates presented 36 chromosomes with variable ploidy among them, no correlation was found between the number of amastina genes copies, gp63, A2 and SSG with such clinic forms. In general, we did not find correlation between symptomatic and asymptomatic clinical forms and the gene content of the Brazilian isolates of Leishmania. 34,28% of the sandflies collected in the upper west region were L. longipalpis and the main sources of blood meal were humans, dogs and chickens.