TBX3-Mutationsanalysen und Konstruktion einer Zelllinie für TBX2-Inhibitorscreenings

Die nahe verwandten T-box Transkriptionsfaktoren TBX2 und TBX3 werden in zahlreichen humanen Krebsarten überexprimiert, insbesondere in Brustkrebs und Melanomen. Die Überexpression von TBX2 und TBX3 hat verschiedene zelluläre Effekte, darunter die Unterdrückung der Seneszenz, die Förderung der Epithelialen-Mesenchymalen Transition sowie invasive Zellmotilität. Im Gegensatz dazu führt ein Funktionsverlust von TBX3 und der meisten anderen humanen T-box-Gene zu haploinsuffizienten Entwicklungsdefekten. Durch Sequenzierung des Exoms von Brustkrebsproben identifizierten Stephens et al. fünf verschiedene Mutationen in TBX3, welche allesamt die DNA-bindende T-box-Domäne betrafen. Die In-Frame-Deletion N212delN wurde zweimal gefunden. Aus der Anhäufung der Mutationen innerhalb der T-box-Domäne wurde geschlossen, dass TBX3 bei Brustkrebs ein Treibergen ist. Da Mutationen innerhalb der T-box-Domäne im Allgemeinen zu einem Funktionsverlust führen, aber die onkogene Aktivität von TBX3 meist auf eine Überexpression zurückzuführen ist, wurden die potentiellen Treibermutationen hinsichtlich einer verminderten oder gesteigerten TBX3-Funktion geprüft. Getestet wurden zwei In-Frame Deletionen, eine Missense- sowie eine Frameshift-Mutante bezüglich der DNA-Bindung in vitro und der Zielgen-Repression in Zellkultur. Zusätzlich wurde eine in silico Analyse der im The Cancer Genome Atlas (TCGA) gelisteten somatischen TBX-Brustkrebsmutationen durchgeführt. Sowohl die experimentelle als auch die in silico Analyse zeigten, dass die untersuchten Mutationen vorwiegend zum Verlust der TBX3-Funktion führen. Um den Mechanismus der Genrepression durch TBX3 besser zu verstehen, wurden weitere TBX3-Mutanten bezüglich ihrer Wirkung auf die p21-Promotoraktivität (p21-Luc-Reporter und endogene p21-Expression) analysiert. Wildtypische p21-Luc-Repression zeigten die zwei Mutationen S674A (Phosphorylierung) und D275K (SUMOylierung), welche posttranslationale Modifikationen verhindern, sowie die Interaktion mit dem Tumorsuppressor Rb1 unterbindende M302A/V304A-Mutation. Erstaunlicherweise war die endogene p21-Repression dieser Mutanten stärker als die des wildtypischen TBX3-Proteins. Alle drei Mutationen führten zu einer Stabilisierung des TBX3-Proteins. Die ursprünglich in Patienten mit Ulna-Mamma Syndrom identifizierte, DNA-bindungsdefekte Y149S-Mutante konnte weder p21-Luc noch endogenes p21 reprimieren. Mutationen in potentiellen Interaktionsdomänen für die Bindung der Co-Repressoren Groucho und C-terminalem Bindeprotein zeigten sowohl auf p21-Luc als auch auf endogenes p21-Gen wildtypische Repressoraktivität, so dass diese Co-Repressoren in COS-7-Zellen wahrscheinlich nicht an der Repression dieses Gens beteiligt sind. Da TBX2 und TBX3 interessante Ziele zur direkten Krebsbekämpfung darstellen, sollte ein zelluläres Reportersystem zur Identifikation TBX2-inhibierender, pharmakologisch aktiver Substanzen etabliert werden. Dazu sollte eine stabile Zelllinie mit vom p21-Promotor reguliertem d2EGFP-Reporter und Doxyzyklin-induzierbarem TBX2-Protein erzeugt werden, da ektopische Expression von TBX2 genetische Instabilität und Toxizität induzieren kann. In dieser Zelllinie sollte die TBX2-Expression zur Reduktion der d2EGFP-Fluoreszenz führen. Zur Erzeugung der Zelllinie wurden die folgenden drei Konstrukte Schritt-für-Schritt stabil in das Genom der Zielzelllinie COS-7 integriert: pEF1alpha-Tet3G, pTRE3G-TBX2 und p21-d2EGFP. Während die Herstellung der doppelt stabilen COS-7-Zelllinie gelang, scheiterte die Herstellung der dreifach stabilen Zelllinie.

Individualisierte Krebstherapie : präklinischer „proof of concept“ einer mutationsspezifischen Immuntherapie

Da nicht-synonyme tumorspezifische Punktmutationen nur in malignen Geweben vorkommen und das veränderte Proteinprodukt vom Immunsystem als „fremd“ erkannt werden kann, stellen diese einen bisher ungenutzten Pool von Zielstrukturen für die Immuntherapie dar. Menschliche Tumore können individuell bis zu tausenden nicht-synonymer Punktmutationen in ihrem Genom tragen, welche nicht der zentralen Immuntoleranz unterliegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Hypothese zu untersuchen, dass das Immunsystem in der Lage sein sollte, mutierte Epitope auf Tumorzellen zu erkennen und zu klären, ob auf dieser Basis eine wirksame mRNA (RNA) basierte anti-tumorale Vakzinierung etabliert werden kann. Hierzu wurde von Ugur Sahin und Kollegen, das gesamte Genom des murinen B16-F10 Melanoms sequenziert und bioinformatisch analysiert. Im Rahmen der NGS Sequenzierung wurden mehr als 500 nicht-synonyme Punktmutationen identifiziert, von welchen 50 Mutationen selektiert und durch Sanger Sequenzierung validiert wurden. rnNach der Etablierung des immunologischen Testsysteme war eine Hauptfragestellung dieser Arbeit, die selektierten nicht-synonyme Punktmutationen in einem in vivo Ansatz systematisch auf Antigenität zu testen. Für diese Studien wurden mutierte Sequenzen in einer Länge von 27 Aminosäuren genutzt, in denen die mutierte Aminosäure zentral positioniert war. Durch die Länge der Peptide können prinzipiell alle möglichen MHC Klasse-I und -II Epitope abgedeckt werden, welche die Mutation enthalten. Eine Grundidee des Projektes Ansatzes ist es, einen auf in vitro transkribierter RNA basierten oligotopen Impfstoff zu entwickeln. Daher wurden die Impfungen naiver Mäuse sowohl mit langen Peptiden, als auch in einem unabhängigen Ansatz mit peptidkodierender RNA durchgeführt. Die Immunphänotypisierung der Impfstoff induzierten T-Zellen zeigte, dass insgesamt 16 der 50 (32%) mutierten Sequenzen eine T-Zellreaktivität induzierten. rnDie Verwendung der vorhergesagten Epitope in therapeutischen Vakzinierungsstudien bestätigten die Hypothese das mutierte Neo-Epitope potente Zielstrukturen einer anti-tumoralen Impftherapie darstellen können. So wurde in therapeutischen Tumorstudien gezeigt, dass auf Basis von RNA 9 von 12 bestätigten Epitopen einen anti-tumoralen Effekt zeigte.rnÜberaschenderweise wurde bei einem MHC Klasse-II restringierten mutiertem Epitop (Mut-30) sowohl in einem subkutanen, als auch in einem unabhängigen therapeutischen Lungenmetastasen Modell ein starker anti-tumoraler Effekt auf B16-F10 beobachtet, der dieses Epitop als neues immundominantes Epitop für das B16-F10 Melanom etabliert. Um den immunologischen Mechanismus hinter diesem Effekt näher zu untersuchen wurde in verschieden Experimenten die Rolle von CD4+, CD8+ sowie NK-Zellen zu verschieden Zeitpunkten der Tumorentwicklung untersucht. Die Analyse des Tumorgewebes ergab, eine signifikante erhöhte Frequenz von NK-Zellen in den mit Mut-30 RNA vakzinierten Tieren. Das NK Zellen in der frühen Phase der Therapie eine entscheidende Rolle spielen wurde anhand von Depletionsstudien bestätigt. Daran anschließend wurde gezeigt, dass im fortgeschrittenen Tumorstadium die NK Zellen keinen weiteren relevanten Beitrag zum anti-tumoralen Effekt der RNA Vakzinierung leisten, sondern die Vakzine induzierte adaptive Immunantwort. Durch die Isolierung von Lymphozyten aus dem Tumorgewebe und deren Einsatz als Effektorzellen im IFN-γ ELISPOT wurde nachgewiesen, dass Mut-30 spezifische T-Zellen das Tumorgewebe infiltrieren und dort u.a. IFN-γ sekretieren. Dass diese spezifische IFN-γ Ausschüttung für den beobachteten antitumoralen Effekt eine zentrale Rolle einnimmt wurde unter der Verwendung von IFN-γ -/- K.O. Mäusen bestätigt.rnDas Konzept der individuellen RNA basierten mutationsspezifischen Vakzine sieht vor, nicht nur mit einem mutations-spezifischen Epitop, sondern mit mehreren RNA-kodierten Mutationen Patienten zu impfen um der Entstehung von „escape“-Mutanten entgegenzuwirken. Da es nur Erfahrung mit der Herstellung und Verabreichung von Monotop-RNA gab, also RNA die für ein Epitop kodiert, war eine wichtige Fragestellungen, inwieweit Oligotope, welche die mutierten Sequenzen sequentiell durch Linker verbunden als Fusionsprotein kodieren, Immunantworten induzieren können. Hierzu wurden Pentatope mit variierender Position des einzelnen Epitopes hinsichtlich ihrer in vivo induzierten T-Zellreaktivitäten charakterisiert. Die Experimente zeigten, dass es möglich ist, unabhängig von der Position im Pentatop eine Immunantwort gegen ein Epitop zu induzieren. Des weiteren wurde beobachtet, dass die induzierten T-Zellfrequenzen nach Pentatop Vakzinierung im Vergleich zur Nutzung von Monotopen signifikant gesteigert werden kann.rnZusammenfassend wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit präklinisch erstmalig nachgewiesen, dass nicht-synonyme Mutationen eine numerisch relevante Quelle von Zielstrukturen für die anti-tumorale Immuntherapie darstellen. Überraschenderweise zeigte sich eine dominante Induktion MHC-II restringierter Immunantworten, welche partiell in der Lage waren massive Tumorabstoßungsreaktionen zu induzieren. Im Sinne einer Translation der gewonnenen Erkenntnisse wurde ein RNA basiertes Oligotop-Format etabliert, welches Eingang in die klinische Testung des Konzeptes fand.rn