Symbiotische Mikroorganismen aus dem Termitendarm

Symbiotische Mikroorganismen aus dem Termitendarm Es ist eine bekannte Tatsache, dass die Hauptaufgabe der Darmflora der niederen Termite im Abbau von Holz liegt. Im Laufe der Millionen Jahre alten Entwicklung der Termiten hat sich in ihrem Darm ein Ökosystem aufgebaut, das aus Protozoen, Archaeen, Bakterien und Hefen besteht. Ziel der vorliegenden Arbeit war die teilweise Erforschung der symbiotischen Zusammenhänge in diesem ökologischen System. Es wurden dabei zwei Gebiete genauer untersucht: Cellulolytische Bakterien im Darm von niederen Termiten Die bisher vorherrschende Meinung sah in den Protozoen die Hauptkomponenten des Celluloseabbaus in Termiten. In dieser Arbeit gelang es 164 cellulolytische Bakterienstämme aus sieben niederen Termitenarten zu isolieren und zu identifizieren. Diese Vielzahl cellulolytischer Bakterienarten könnte ein Indiz dafür sein, dass Bakterien beim Holzabbau von Termiten eine effizientere Rolle spielen als angenommen. Oberflächenbakterien von Mixotricha paradoxa, einem Flagellaten aus dem Darm der niederen Termite Mastotermes darwiniensisMixotricha paradoxa ist ein Beispiel der seltenen Form einer Bewegungssymbiose zwischen Protozoen und Bakterien. Der Flagellat wird von Spirochäten, die auf seiner Oberfläche befestigt sind, vorangetrieben. Zusätzlich leben noch stäbchenförmige Bakterien auf der Hülle. Drei Spirochätenarten und das stäbchenförmige Bakterium konnten identifiziert und lokalisiert werden. Es wird angenommen, dass alle drei Spirochätenarten Mitglieder der Bewegungssymbiose sind.

Bioinformatische Identifizierung und Charakterisierung von Zyklin-abhängigen Kinasen und Zyklinen des Parasiten Eimeria tenella und deren Nutzung im rationalen Wirkstoffdesign

Parasiten der Apicomplexa umfassen sowohl humanpathogene, als auch tierpathogene Protozoen. Beispiele für wichtige Vertreter human- und tierpathogener Parasiten sind Plasmodium falciparum und Eimeria tenella. E. tenella verursacht die Kokzidiose des Hühnchens, eine Darmerkrankung die weltweit für Verluste in einer geschätzten Höhe von bis zu 3 Milliarden US$ verantwortlich zeichnet. Eine prophylaktische Vakzinierung gegen diese Krankheit ist ökonomisch meist ineffizient, und eine Behandlung mit Kokzidiostatika wird durch häufige Resistenzbildung gegen bekannte Wirkstoffe erschwert. Diese Situation erfordert die Entwicklung neuer kostengünstiger Alternativen. Geeignete Zielproteine für die Entwicklung neuartiger Arzneistoffe zur Behandlung der Kokzidiose sind die Zyklin-abhängigen Kinasen (CDKs), zu denen auch die CDK-related Kinase 2 (EtCRK2) aus E. tenella gehört. Diese Proteine sind maßgeblich an der Regulation des Zellzyklus beteiligt. Durch chemische Validierung mit dem CDK Inhibitor Flavopiridol konnte nachgewiesen werden, dass ein Funktionsverlust von CDKs in E. tenella die Vermehrung des Parasiten in Zellkultur inhibiert. E. tenella CDKs sind daher als Zielproteine für die Entwicklung einer Chemotherapie der Kokzidiose geeignet. Mittels bioinformatischer Tiefenanalysen sollten CDK Proteine im Parasiten E. tenella identifiziert werden. Das Genom von E. tenella liegt in Rohfassung vor [ftp://ftp.sanger.ac.uk]. Jedoch waren zum Zeitpunkt dieser Arbeiten viele Sequenzen des Genoms noch nicht annotiert. Homologe CDK Proteine von E. tenella konnten durch den Vergleich von Sequenzinformationen mit anderen Organismen der Apicomplexa identifiziert und analysiert werden. Durch diese Analysen konnten neben der bereits bekannten EtCRK2, drei weitere, bislang nicht annotierte CDKs in E. tenella identifiziert werden (EtCRK1, EtCRK3 sowie EtMRK). Darüber hinaus wurde eine Analyse der entsprechenden Zykline – der Aktivatoren der CDKs – bezüglich Funktion und Struktur, sowie eine Datenbanksuche nach bisher nicht beschriebenen Zyklinen in E. tenella durchgeführt. Diese Suchen ergaben vier neue potentielle Zykline für E. tenella, wovon EtCYC3a als Aktivator der EtCRK2 von María L. Suárez Fernández (Intervet Innovation GmbH, Schwabenheim) bestätigt werden konnte. Sequenzvergleiche lassen vermuten, dass auch EtCYC1 und EtCYC3b in der Lage sind, EtCRK2 zu aktivieren. Außerdem ist anzunehmen, dass EtCYC4 als Aktivator der EtCRK1 fungiert. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Suche und Optimierung nach neuen Inhibitoren von CDKs aus E. tenella. In vorangegangenen Arbeiten konnten bereits Inhibitoren der EtCRK2 gefunden werden [BEYER, 2007]. Mittels Substruktur- und Ähnlichkeitssuchen konnten im Rahmen dieser Arbeit weitere Inhibitoren der EtCRK2 identifiziert werden. Vier dieser Strukturklassen erfüllen die Kriterien einer Leitstruktur. Eine dieser Leitstrukturen gehört zur Strukturklasse der Benzimidazol-Carbonitrile und ist bislang nicht als Inhibitor anderer Kinasen beschrieben. Diese neu identifizierte Leitstruktur konnte in silico weiter optimiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Bindungsenergien von Vertretern dieser Strukturklasse berechnet, um einen wahrscheinlichen Bindemodus vorherzusagen. Für die weiterführende in silico Optimierung wurde eine virtuelle kombinatorische Substanzbibliothek dieser Klasse erstellt. Die Auswahl geeigneter Verbindungen für eine chemische Synthese erfolgte durch molekulares Docking unter Nutzung von Homologiemodellen der EtCRK2. Darüber hinaus wurde ein in silico Screening nach potentiellen Inhibitoren der PfMRK und EtMRK durchgeführt. Dabei konnten weitere interessante virtuelle Hit-Strukturen aus einer Substanzdatenbank kommerziell erhältlicher Verbindungen gefunden werden. Durch dieses virtuelle Screening konnten jeweils sieben Verbindungen als virtuelle Hits der PfMRK sowie der EtMRK identifiziert werden. Die Häufung von Strukturklassen mit bekannter CDK Aktivität deutet darauf hin, dass während des virtuellen Screenings eine Anreicherung von CDK Inhibitoren stattgefunden hat. Diese Ergebnisse lassen auf eine Weiterentwicklung neuer Wirkstoffe gegen Kokzidiose und Malaria hoffen.

Neue wasserlösliche Cystein-Protease-Inhibitoren mit Aziridin-2,3-dicarbonsäure-Baustein

Die Leishmaniose gehört zu den „vernachlässigten tropischen Erkrankungen“. Sie wird durch parasitäre Protozoen der Gattung Leishmania ausgelöst. Weltweit sind ca. 12 Mio. Menschen infiziert, ca. 70 Tausend erliegen ihr jährlich. Die aktuelle Therapie wird überschattet von Toxizitäts- und Teratogenitätsproblemen und von aufkommenden Resistenzen. Die von den Leishmanien exprimierten Cysteinproteasen spielen vielfältige Rollen bei Wachstum und Vermehrung der Erreger. Aufgrund der evolutionären Verwandtschaft der Enzyme sind die parasitären Cysteinproteasen strukturell den humanen sehr ähnlich. Die Herausforderung bei der Entwicklung antiparasitärer Wirkstoffe, basierend auf der Hemmung dieser Proteasen, besteht deshalb darin, sehr selektive Inhibitoren zu entwickeln, die die Wirtsproteasen nicht, oder nur in einem vertretbaren Rahmen, inhibieren. Das Ziel dieser Arbeit war die Weiterentwicklung der Aziridin-2,3-dicarbonsäure-basierten Cysteinproteaseinhibitoren RV122C bzw. CS09 hinsichtlich Selektivität und Aktivität gegenüber der parasitären Cathepsin-L-ähnlichen Cystein-Protease LmCPB2.8 durch Design, incl. Docking, Synthese und Testung. Neben der gezielten Variation nicht essenzieller Gruppen wurde molekulares Docking mittels AutoDock Vina an Cruzain als verwandtes Modellenzym durchgeführt, um durch Variationen K.O.-Kandidaten für die Differenzierung zwischen zwei postulierten Bindungsmodi zu finden. Die Ergebnisse der Enzymassays zeigen eine Verbesserung der Hemmeigenschaften bei gleichzeitig verbesserter Selektivität sowie erhöhter ligand efficiency und ligand lipophilic efficiency für Derivate mit sterisch anspruchsvolleren Ester-Resten und für Derivate mit einer freien Carbonsäurefunktion am Aziridin-Ring (Halbester).