Untersuchungen zur Funktion und Regulation der Rezeptor-Tyrosin-Phosphatase RPTPlambda bei der Entwicklung des Mittel- und Hinterhirns

Der isthmische Organisator liegt an der Grenze zwischen dem sich entwickelnden Mittel- und Hinterhirn und kontrolliert Wachstum und Musterbildung dieser beiden Hirnregionen. In der vorliegenden Arbeit wird die räumliche und zeitliche Expression der Rezeptor-ähnlichen Protein Tyrosin Phosphatase lambda aus dem Huhn (cRPTPλ, auch als cRPTPψ bekannt) während der Entwicklung dieser Struktur beschrieben. Nach einer anfänglich weitläufigen Expression im kaudalen Vorderhirn und in der Mittelhirnregion, beschränkt sich die Expression von cRPTPλ zwischen dem embryonalen Tag E2 und E3.5 auf die ventrale Mittellinie des Neuralrohrs, den Bereich der späteren neuralen Retina und Linse und auf einen schmalen Ring anterior der isthmischen Einschnürung, welcher der molekularen Mittel- / Hinterhirngrenze (MHO) entspricht. Ab dem embryonalen Tag E3.5 wird RPTPλ dann auch im gesamten Mittelhirn gebildet. Um Hinweise auf die Funktion von cRPTPλ zu bekommen, wurde die Regulation dieses Moleküls untersucht. Die Expression von cRPTPλ am MHO wird von dem Fibroblasten Wachstumsfaktor Fgf8 und dem Transkriptionsfaktor Lmx1b, nicht aber von dem sezernierten Glykoprotein Wnt1 induziert. Der Transkriptionsfaktor En-1 unterdrückt die Expression von cRPTPλ am MHO. cRPTPλ-Expression im Mittelhirn wird negativ durch das sezernierte Protein Sonic Hedgehog reguliert, während Lmx1b und En-1 dort keinen Einfluss auf das Expressionsmuster von cRPTPλ haben. Fgf8 und Wnt1 sind maßgeblich an der Regulation von Wachstum und Musterbildung des embryonalen Mittelhirns beteiligt. Funktionelle Studien zu RPTPλ deuten darauf hin, dass dieses Protein als negativer Rückkopplungsmechanismus beider Signalwege wirken kann. RNAi- und Überexpressionsstudien am MHO lieferten Hinweise darauf, dass RPTPλ der Induktion der Wnt1-Expression durch Fgf8 entgegenwirkt. Dies scheint durch Interaktion noch unbekannter Faktoren mit der Juxtamembrandomäne von RPTPλ vermittelt zu werden. Auf das Expressionsmuster von Fgf8 selbst, oder einer Reihe anderer Faktoren, die ebenfalls von Fgf8 reguliert werden, hat RPTPλ allerdings keinen Einfluss. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine „künstliche“ Aufrechterhaltung der Expression von cRPTPλ im Mittelhirn zwischen dem embryonalen Tag E2 und E3.5 zu einem stark verkleinerten Mesenzephalon führt. RPTPλ bindet in vivo an β-Catenin, ein zentrales Protein des kanonischen Wnt-Signalweges, und moduliert dadurch vermutlich das Wnt-Signal, welches seinerseits Proliferation im Mesenzephalon fördert. Durch diesen Mechanismus könnte cRPTPλ als „Bremse“ des kanonischen Wnt-Signalweges im Mittelhirn wirken.

Effects of low-density lipoprotein receptor-related protein 4 and apolipoprotein E isoforms on bone metabolism in vivo

LRP4, member of the LDLR family, is a multifunctional membrane-bound receptor that is expressed in various tissues. The expression of LRP4 by osteoblasts, its novel interaction with Wnt-signaling inhibitors Dkk1 and SOST, and the lower levels of activated beta-catenin in different bone locations described here, adds another player to the long list of established factors that modulate canonical Wnt-signaling in bone. By demonstrating that in addition to Wise, LRP4 is able to interact with two additional important modulators of Wnt- and BMP-signaling, our perspective of the complexity of the integration of BMP and Wnt-signaling pathways on the osteoblast surface has expanded further. Nevertheless the recently described association of both the SOST and LRP4 genes with BMD in humans, together with our findings suggest that LRP4 plays a physiologically important role in the skeletal development and bone metabolism not only in rodents, but in humans as well. The efficiency with which LRP4 binds both SOST and Dkk1, presumably at the osteoblastic surface, LRP4 may act as a sink and competes with LRP5/6 for the binding of these Wnt antagonists, which then are no longer available for suppression of the signal through the LRP5/6 axis. rnApoE, a 299 amino acid glycoprotein, is a crucial regulator in the uptake of triglyceride, phospholipids, cholesteryl esters, and cholesterol into cells. ApoE has been linked to osteoporosis, and such a role is further strengthened by the present of a high bone mass phenotype in ApoE null mice. Until recently, the effects of respective ApoE isoforms E2, E3, and E4, and their impact on bone metabolism, have been unclear. Here we report that respective human ApoE knockin mice display diverse effects on bone metabolism. ApoE2 mice show decreased trabecular bone volume per total volume in femoral bone and lumbar spine in comparison to ApoE3 and E4 animals. In this context, urinary bone resorption marker DPD is increased in these animals, which is accompanied by a low ratio of osteoclastogenesis markers OPG/RANKL. Interestingly, serum bone formation markers ALP and OCN are diminished in ApoE4 mice. In contrast to this finding, ApoE2 mice show the lowest bone formation of all groups in vivo. These findings cannot be explained by the low receptor-affinity of ApoE2 and subsequent decreased uptake of triglyceride-rich lipoproteins by osteoblasts, resulting in elevated levels of undercarboxylated osteocalcin. Thus, other crucial pathways relevant for bone metabolism, e. g. Wnt/beta-catenin-signaling pathways, must be, compared to the ApoE3/4 isoforms, more affected by the ApoE2 isoform.

Cytotoxicity and P-glycoprotein inhibition by cardiotonic steroids

Herzwirksame Glykoside sind in der Natur sowohl im Tier- als auch im Pflanzenreich zu finden und werden regelmäßig zur Therpaie von Herzinsuffizienz eingesetzt. In letzter Zeit belegten viele Studien, dass herzwirksame Glykoside vielversprechende Substanzen für die Behandlung von Krebs darstellen. Ihr Wirkmechanismus basiert auf der Hemmung der Na+/K+-ATPase. Die Na+/K+-ATPase spielt neuerdings eine wichtige Rolle in der Krebsbiologie, da sie viele relevante Signalwege beeinflusst. Multiresistenzen gegen Arzneimittel sind oftmals verantwortlich für das Scheitern einer Chemotherapie. Bei multi-drug-resistenten Tumoren erfolgt ein Transport der Chemotherapeutika aus der Krebszelle hinaus durch das Membranprotein P-Glykoprotein. In der vorliegenden Arbeit wurde die Zytotoxizität von 66 herzwirksamen Glykosiden und ihren Derivaten in sensitiven und resistenten Leukämie-Zellen getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Naturstoffe die Zell-Linien in verschiedenen molaren Bereichen abtöten. Allerdings waren die Resistenz-Indizes niedrig (d. h. die IC50 Werte waren in beiden Zell-Linien ähnlich). Die untersuchten 66 Substanzen besitzen eine große Vielfalt an chemischen Substituenten. Die Wirkung dieser Substituenten auf die Zytotoxizität wurde daher durch Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR) erforscht. Des Weiteren wiesen quantitative Struktur-Aktivitäts-Beziehung (QSAR) und molekulares Docking darauf hin, dass die Na+/K+-ATPase in sensitiven und resistenten Zellen unterschiedlich stark exprimiert wird. Eine Herunterregulation der Na+/K+-ATPase in multi-drug-resistenten Zellen wurde durch Western Blot bestätigt und die Wirkung dieser auf relevante Signalwege durch Next-Generation-Sequenzierung weiter verfolgt. Dadurch konnte eine Verbindung zwischen der Überexpression von P-Glykoprotein und der Herunterregulation der Na+/K+-ATPase hergestellt werden. Der zweite Aspekt der Arbeit war die Hemmung von P-Glykoprotein durch herzwirksame Glykoside, welche durch Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie getestet wurde. Sechs wirksame Glykoside konnten den P-Glykoprotein-vermittelten Transport von Doxorubicin inhibieren. Zudem konnte die Zytotoxität von Doxorubicin in multi-drug-resistenten Zellen teilweise wieder zurück erlangt werden. Unabhängig von herzwirksamen Glykosiden war die Bewertung der Anwendung von molekularem Docking in der P-Glykoprotein Forschung ein weiterer Aspekt der Arbeit. Es ließ sich schlussfolgern, dass molekulares Docking fähig ist, zwischen den verschiedenen Molekülen zu unterscheiden, die mit P-Glykoprotein interagieren. Die Anwendbarkeit von molekularem Docking in Bezug auf die Bestimmung der Bindestelle einer Substanz wurde ebenfalls untersucht.