Mucinartige Glycopeptide als Inhibitoren selektinvermittelter Zelladhäsionsprozesse

Es wurden Glycopeptide mit einer Partialsequenz aus der N-terminalen Domäne des natürlichen Selektinliganden PSGL-1 synthetisiert, welche prinzipiell als kompetitive Inhibitoren unerwünschter selektinvermittelter Zelladhäsionsphänomene fungieren könnten. Grundsätzlich könnte es möglich sein, auf diesem Wege entsprechende chronisch entzündliche Krankheiten wie rheumatoide Arthritis zu behandeln und bestimmte akut eintretende schwere Schädigungen von gesundem Gewebe sowie die Metastasenbildung maligner Tumore zu unterdrücken. Das tatsächliche Potential der hergestellten Glycopeptide als Liganden der Selektine kann nun in biologischen Tests geprüft werden. Der gewählte Ausschnitt aus dem P-Selektin-Glycoprotein-Liganden-1 (PSGL-1) reicht von Tyr48 bis Pro59 und umfasst so sämtliche Aminosäurereste der Sequenz, die für das Auftreten einer hochaffinen Rezeptorbindung erforderlich sind. Dabei ist die Seitenkette von Thr57 mit einem O-Glycan modifiziert, welches das in natürlichen Selektinliganden häufig vorkommende Tetrasaccharid Sialyl-Lewisx bzw. ein Mimetikum desselben enthält und die für Mucine typische Form der Anbindung an das peptidische Rückgrat über eine N-Acetyl-α-D-galactosamineinheit aufweist. Zum Aufbau der komplexen Glycopeptidstrukturen wurde zunächst eine Strategie für die Synthese des an die Hydroxylaminosäure gebundenen Oligosaccharids im Gramm-Maßstab ausgearbeitet. Dabei kam der Wahl eines geeigneten Schutzgruppenmusters besondere Bedeutung zu. Das entwickelte Konzept basiert allein auf chemischen Methoden und ermöglicht die parallele Herstellung potentieller Mimetika. So wurde in dieser Arbeit L-Fucose durch D-Arabinose und N-Acetyl-D-neuraminsäure durch (S)-Cyclohexylmilchsäure ersetzt. Die erhaltenen Glycosylaminosäure-Bausteine wurden schließlich in die Glycopeptid-synthesen an der festen Phase eingebracht, welche nach vollständiger Deblockierung die gewünschten Zielverbindungen lieferten.rn

Analyse des anti-inflammatorischen Pilzmetaboliten S-Curvularin in verschiedenen Modellen der rheumatoiden Arthritis

An der Entwicklung und Aufrechterhaltung chronisch-inflammatorischer Erkrankungen wie der rheumatoiden Arthritis (RA) ist die Fehlregulation verschiedener pro-inflammatorischer Gene von entscheidender Bedeutung. Bei der RA führt unter anderem eine erhöhte Expression der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) zu einer gesteigerten NO-Produktion, was schließlich zum Knochenabbau beiträgt. Für eine Therapie der RA werden häufig Glukokortikoide eingesetzt, die jedoch viele Nebenwirkungen zeigen. Um eine mögliche Therapiealternative zu identifizieren, sollten die Effekte des anti-inflammatorisch wirksamen Pilzmetaboliten S-Curvularin in verschiedenen Modellen der RA analysiert werden.rnIn humanen C-28/I2-Chondrozyten als in vitro-Modell der RA führte die Inkubation mit einem Zytokingemisch zu einer Induktion der iNOS-Expression, die vom chondrogenen Differenzierungsgrad der Zellen abhängig war. Entscheidend für die iNOS-Induktion in C-28/I2-Zellen ist hauptsächlich der p38-MAPK-, der JAK-STAT- und der NF-kappa B-Signaltransduktionsweg. Eine Inkubation der Zellen mit S-Curvularin führte zu einer deutlichen Hemmung der iNOS-Expression. Dexamethason hatte hingegen keinen Effekt auf die iNOS-Expression, was vermutlich auf die fehlende Expression der Glukokortikoidrezeptor-mRNA zurückgeführt werden kann. Daher können von S-Curvularin abgeleitete Pharmaka möglicherweise auch in Fällen einer Steroidresistenz zur Therapie von RA-Patienten zum Einsatz kommen.rnIm Tiermodell der Kollagen-induzierten Arthritis konnte die anti-inflammatorische Wirkung von S-Curvularin auf mehreren Ebenen bestätigt werden. Die Pilzsubstanz reduzierte sowohl die Schwellung der Pfoten als auch die Expression CII-induzierter pro-inflammatorischer Gene, wie z.B. S100A8, Defb6, Camp und Mpo. Dabei waren die Effekte von S-Curvularin meist deutlicher als in Dexamethason-behandelten Mäusen. Die Analyse von Zytokinen (z.B. TNF-alpha, IL-1beta) und Chemokinen (z.B. MCP-1, MIP-1alpha) zeigte, dass die CII-induzierte Expression dieser pro-inflammatorischen Mediatoren in den Pfoten der Mäuse durch eine Therapie mit S-Curvularin und Dexamethason wieder reduziert werden konnte, wobei Unterschiede zwischen den Behandlungen beobachtet werden konnte.rnAuch im Tiermodell der LPS-induzierten akuten Entzündung wurde die iNOS- und die S100A8-Expression in verschiedenen Geweben S-Curvularin reduziert. rnrnS-Curvularin ist also in der Lage, in verschiedenen Modellen der RA und im akuten Entzündungsmodell die pro-inflammatorische Genexpression effizient zu hemmen und könnte somit in Zukunft eine Rolle in der Therapie der RA einnehmen.rn

Die Bedeutung von KSRP für die pro-inflammatorische Genexpression in Autoimmunerkrankungen - Einfluss des Naturstoffes Resveratrol auf KSRP-vermittelte Regulationsmechanismen

Die Pathogenese chronisch inflammatorischer Erkrankungen ist von einer Dysregulation der pro-inflammatorischen Genexpression geprägt. Dieser liegen wahrscheinlich pathologische Veränderungen der Aktivität von verschiedenen Transkriptionsfaktoren und RNA-bindenden Proteinen zugrunde. In dieser Arbeit konnte die Regulation der KSRP-Expression in einem murinen Modell der rheumatoiden Arthritis (RA) nachgewiesen werden. In humanen Chondrozyten führte eine erhöhte KSRP-Expression zu einer Reduktion der Expression von bekannten KSRP-Zielgenen. Der Vergleich von verschiedenden Microarray-Analysen aus den verwendeten humanen und murinen Modellen der RA führte zur Identifikation von pro-inflammatorischen und pro-angiogenetischen Faktoren (SPARC, MMP2, MMP3, PLA2G2D, GZMA, HPSE, TNMD und IL-18-R), die in der RA eine Rolle spielen und höchstwahrscheinlich durch eine erhöhte KSRP-Expression reguliert werden. Daher könnte eine Modulation der KSRP-Expression bei der Therapie von Autoimmunerkrankungen von Bedeutung sein. In diesem Zusammenhang ist die Detektion der Bindung des cardioprotektiven und anti-inflammatorisch wirkenden Naturstoffs Resveratrol an KSRP zu nennen. Diese spezifische Interaktion führte zu einer Reduktion der p38-MAPK-vermittelten Thr-Phosphorylierung des KSRP-Proteins (in situ und in vivo), was eine Aktivierung der KSRP-vermittelten Mechanismen zur Folge hatte. Somit konnte in situ die mRNA-Stabilität der iNOS reduziert und die miR-155-Expression erhöht werden. Im murinen Atherosklerosemodell führte die Behandlung mit Resveratrol zu einer verringerten Expression bekannter KSRP-Ziel-mRNAs. rnNeben diesem post-translationalen Regulationsmechanismus von KSRP durch Resveratrol konnte die Modulation der KSRP-Expression auf transkriptioneller Ebene durch KSRP selbst gezeigt werden. Dies geschieht möglicherweise über die Bindung von KSRP an das FUSE-analoge Element innerhalb des KSRP-Promotors, welches eine positive Autoregulation der KSRP-Expression bewirkt. Bei der Analyse der post-transkriptionellen Regulation der KSRP-Expression interagierten die mRNA-bindenden Proteine HuR, PABP und die AUF-1-Isoformen p40, p42 und p45 in vitro mit der KSRP-3’UTR. Dabei konnte in Expressionsanalysen nachgewiesen werden, dass die KSRP-mRNA durch PABP positiv und durch p42 negativ reguliert wird.rnZusammenfassend ist zu sagen, dass die KSRP-Expression neben post-translationalen Mechanismen auch auf transkriptioneller und post-transkriptioneller Ebene moduliert wird. Zusätzlich wurde eine Regulation der KSRP-Expression innerhalb entzündlicher Erkrankungen nachgewiesen, die Bedeutung dieser Modulation für die pro-inflammatorischen Genexpression diskutiert und ein möglicher therapeutischer Angriffspunkt durch Resveratrol identifiziert.

Analysen zur Expression proinflammatorischer Mediatoren in humanen Zellkulturmodellen und murinen Tiermodellen chronisch-inflammatorischer Erkrankungen

Die humane induzierbare NO-Synthase (iNOS) spielt bei zahlreichen Erkrankungen wie Asthma, Krebs und der rheumatoiden Arthritis eine entscheidende Rolle. Durch Fehlregulation der iNOS-Expression kommt es häufig zu massiven Gewebeschädigungen. Aus diesem Grund ist es wichtig die Mechanismen der Genregulation der iNOS-Expression zu verstehen. Bei Affinitätschromatographie-Analysen wurde das zytosolische PolyA-bindende Protein (PABP) als direkter Interaktionspartner der 3´UTR der humanen iNOS identifiziert. Weitere Bindungsanalysen konnten eine spezifische Bindestelle für PABP in der 5´UTR und zwei Bindestellen im AU-reichen Bereich der 3´UTR der humanen iNOS nachweisen. Eine siRNA-mediierte Herabregulation von PABP mit Hilfe der stabilen Expression spezifischer siRNAs in DLD-1 Zellen (siPABP Zellen) zeigte eine signifikant verringerte Expression der humanen iNOS und damit einhergehend eine verringerte NO-Produktion nach Zytokinstimulation. Promotoranalysen zeigten keine Veränderung der Induzierbarkeit des humanen 16 kb iNOS-Promotors in siPABP Zellen. RNA-Stabilitätsanalysen zeigten einen verstärkten Abbau der iNOS-mRNA in diesen Zellen, so dass davon auszugehen ist, dass die Regulation der humanen iNOS über die mRNA-Stabilität erfolgt. Reportergen-Analysen mit Plasmiden, welche die 5’ und/oder 3’UTR Sequenzen der humanen iNOS mit den identifizierten PABP-Bindestellen oder Mutationen in diesen Bindestellen enthielten, zeigten, dass PABP die iNOS-mRNA über die 5´UTR stabilisiert und anscheinend über die 3´UTR einen destabilisierenden Effekt auf die mRNA ausübt. Ebenfalls scheint PABP über die 3’UTR dieTranslation der iNOS mRNA zu hemmen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass PABP, über seine allgemeinen Funktionen hinaus, eine spezifische Rolle in der Regulation der Expression der humanen iNOS einnimmt.rnDie rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch entzündliche Autoimmunerkrankung, welche überwiegend die peripheren Gelenke der Hände und Füße betrifft. Die aktuellen Therapiemöglichkeiten sind immer noch mit einer Vielzahl von Nebenwirkungen behaftet und führen nicht zur vollständigen Remission der Erkrankung, so dass die Entwicklung neuer Medikamente unerlässlich ist. In dieser Arbeit wurden die antiinflammatorischen Substanzen Gallielalacton (Gal) und Oxacyclododecindion (Oxa) im Mausmodell der kollagen-induzierten Arthritis (CIA) getestet. Leider waren beide Substanzen nicht in der Lage die Symptome der CIA zu vermindern, obwohl beide im Modell der LPS-induzierten akuten Entzündung die Expression proinflammatorischer Mediatoren senken konnten. Die Substanz S-Curvularin (SC) hat sich im CIA-Modell bereits bewährt und wurde in dieser Arbeit weiter untersucht. SC war in der Lage die Expression knorpel- und knochendestruktiver Markergene signifikant zu verrindern. rnIn der vorliegenden Arbeit wurden neue microRNAs identifiziert, die in der Pathogenese der CIA eine Dysregulation zeigen. Die Expression dieser microRNAs wurde von SC wieder auf das Normalniveau gebracht, so dass SC eine vielversprechende Substanz in der Therapie chronisch inflammatorische Erkrangungen sein könnte. Die neu identifizierten CIA-relevanten microRNAs könnten als neueRA-Marker oder als Zielstrukturen für neue Medikamente dienen.rn

Etablierung eines Triple-Kultur-Modells der oberen Atemwege unter Einbeziehung immunkompetenter Zellen

Organophosphate können chronische Lungenerkrankungen und Vergiftungen hervorrufen. Bei der Vergiftung erfolgt eine Immunreaktion, welche noch nicht erforscht ist. In dieser Arbeit wurden Toxizitätsstudien an dendritischen Zellen und einem bronchialen Triple-Kultur-Modell durchgeführt. Dendritische Zellen spielen bei der ersten Immunabwehr in der Lunge eine große Rolle. Aus der Zell-Linie THP-1 und primären Monozyten wurden reife dendritische Zellen differenziert und mittels Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz auf spezifische Zellmarker, wie zum Beispiel CD11c, CD83 oder auch CD209, charakterisiert und etabliert. Durch die Vergiftung der Zellen mit Dimethoat und Chlorpyrifos konnte eine Erhöhung des Zelltodes, die Sekretion von proinflammatorischen Mediatoren, Veränderungen in der Morphologie der Zellen und ein Effekt auf den Proteinkinase-Signalweg festgestellt werden. Spezifische dendritische Zellmarker (CD83, CD209) wurden inhibiert und die Dendriten der Dendritischen Zellen kürzer und beschädigt. Die Schädigung von Chlorpyrifos war erheblich größer, als die bei Dimethoat.rnDie weiteren Toxizitätsstudien wurden an einem bronchialen Triple-Kultur-Modell durchgeführt. Hierzu wurden auf Transwell-Filtermembranen bronchiale Epithelzellen, Fibroblastenzellen und Dendritische Zellen verwendet. Die bronchialen Epithelzellen und Fibroblastenzellen waren hier physiologisch voneinander getrennt, konnten aber durch Poren in der Membran miteinander interagieren. Die Etablierung des Triple-Kultur-Modells erfolgte durch die Untersuchung von Entzündungsprozessen, durch Stimulation mit LPS, TNF-alpha und Interferon-gamma. In der Ko-Kultur konnten Zell-Zell-Kontakt Schädigungen und Erhöhung von proinflammatorischen Markern, wie zum Beispiel IL-1ß, IL-6 oder auch IL-8 gemessen werden. Versuche in der Triple-Kultur zeigten den positiven Effekt von Dendritischen Zellen. Bei höheren Konzentrationsbereichen von Dimethoat und Chlorpyrifos konnte ein Wandern der Zellen zu den geschädigten Zell-Zell-Kontakten nachgewiesen werden. Die Ausschüttung der proinflammatorischen Mediatoren wurde inhibiert, vor allem bei IL-10 war eine deutliche Reduktion, um mehr als 70% messbar. Ebenso konnten Veränderungen in dem Apoptose-Signalblick festgestellt werden. Vor allem anti-apoptotische Proteine wurden nach einer Vergiftung der Triple-Kultur induziert. Interventionsstudien mit Vitamin C zeigten allerdings keinen positiven Effekt.

Rheumatoide Arthritis und Arteriosklerose : Bedeutung der zu Grunde liegenden chronisch entzündlichen Prozesse für die endotheliale Dysfunktion ; Wirkung der antiinflammatorischen Substanz Galiellalacton in murinen Arteriosklerosemodellen

Erhöhte arteriosklerotische und thrombotische Vorfälle sind ein Hauptgrund für die gesteigerten Zahlen kardiovaskulärer Todesfälle von Patienten mit chronisch entzündlichen Erkrankungen wie der rheumatoiden Arthritis (RA). Diese erhöhte Mortalität ist nicht auf die traditionellen Risikofaktoren, wie Alter, Geschlecht, Bluthochdruck oder Diabetes zurückzuführen. Man nimmt an, dass die systemische Entzündung einen nicht-traditionellen Risikofaktor für die erhöhten kardiovaskulären Todesfälle von RA-Patienten darstellt. Da die derzeitige Behandlung der RA zum Teil schwere Nebenwirkungen zur Folge haben kann, war es das Ziel dieser Doktorarbeit, die Zusammenhänge zwischen RA und Arteriosklerose (AS) näher zu untersuchen, sowie die neue antiinflammatorische Substanz Galiellalacton (Gal) für die Behandlung der AS zu charakterisieren.rnIn dem chronisch inflammatorischen Tiermodell der TTP-defizienten Mäuse, dessenrnPhänotyp dem einer humanen RA-Erkrankung ähnelt, konnte eine verschlechterternEndothelfunktion, die als ein erstes Symptom einer erworbenen AS gilt, nachgewiesen werden. Dies konnte auf eine erhöhte Stabilität der Nox2-mRNA zurückgeführt werden, die unabhängig von der erhöhten Expression des Entzündungsmarkers TNFα war. Diese gesteigerte Nox2-Menge führte wiederum zu einer erhöhten Bildung von reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies und somit zu einer verringerten Menge an bioaktivem Stickstoffmonoxid, welches die endotheliale Dysfunktion (eDF) bedingte.rnAls ein traditioneller Risikofaktor für das Auftreten von kardiovaskulären Ereignissen gilt unter anderem eine Diabeteserkrankung. Durch die Ausbildung einer Nitrattoleranz bei der Therapie mit organischen Nitraten wie NTG, ISMN oder ISDN kommt es zu der Entwicklung einer eDF. PETN, ein weiteres organisches Nitrat zeigt diese Nebenwirkung nicht. PETN, vermittelt seinen antioxidativen Effekt über die Nrf2-abhängige Induktion der HO-1-Promotoraktivität.rnDie Behandlung von arteriosklerotischen Mäusen (ApoE-/-- und ApoE-/-TFPI+/--Mäuse) mit dem antiinflammatorischen Pilzsekundärmetaboliten Gal zeigte eine verringerte mRNA-Expression von arteriosklerotischen und inflammatorischen Mediatoren, sowie eine reduzierte Thrombenbildung durch eine verringerte Plättchenadhäsion.rnZusammenfassend konnte gezeigt werden, dass inflammationsabhängiger oxidativerrnStress ein Hauptgrund für die entzündungsgetriebene Artheriogenese ist und Galrneine neue Leitsubstanz für die Behandlung dieser Erkrankung ist.