Generation and characterisation of acute myeloid leukaemia-reactive CD4 + T cells and their potential to eliminate human leukaemia blasts in NSG mice

Acute myeloid leukaemia (AML) is a cancer of the haematopoietic system, which can in many cases only be cured by haematopoietic stem cell transplantation (HSCT) and donor lymphocyte infusion (DLI) (Burnett et al., 2011). This therapy is associated with the beneficial graft-versus-leukaemia (GvL) effect mediated by transplanted donor T and NK cells that either recognise mismatch HLA molecules or polymorphic peptides, so-called minor histocompatibility antigens, leukaemia-associated or leukaemia-specific antigens in the patient and thus eliminate remaining leukaemic blasts. Nevertheless, the mature donor-derived cells often trigger graft-versus-host disease (GvHD), leading to severe damages in patients’ epithelial tissue, mainly skin, liver and intestine (Bleakley & Riddell, 2004). Therefore, approaches for the selective mediation of strong GvL effects are needed, also in order to prevent relapse after transplantation. One promising opportunity is the in vitro generation of AML-reactive CD4+ T cells for adoptive transfer. CD4+ T cells are advantageous compared to CD8+ T cells, as HLA class II molecules are under non-inflammatory conditions only expressed on haematopoietic cells; a fact that would minimise GvHD (Klein & Sato, 2000). In this study, naive CD4+ T cells were isolated from healthy donors and were successfully stimulated against primary AML blasts in mini-mixed lymphocyte/leukaemia cell cultures (mini-MLLC) in eight patient/donor pairs. After three to seven weekly restimulations, T cells were shown to produce TH1 type cytokines and to be partially of monoclonal origin according to their TCR Vβ chain usage. Furthermore, they exhibited lytic activity towards AML blasts, which was mediated by the release of granzymes A and B and perforin. The patient/donor pairs used in this study were fully HLA-class I matched, except for one pair, and also matched for HLA-DR and -DQ, whereas -DP was mismatched in one or both alleles, reflecting the actual donor selection procedure in the clinic (Begovich et al., 1992). Antibody blocking experiments suggested that the generated CD4+ T cells were directed against the HLA-DP mismatches, which could be confirmed by the recognition of donor-derived lymphoblastoid cell lines (LCLs) electroporated with the mismatched DP alleles. Under non-inflammatory conditions primary fibroblasts did not express HLA-DP and were thus not recognised, supporting the idea of a safer application of CD4+ T cells regarding induction of GvHD. For the assessment of the biological significance of these T cells, they were adoptively transferred into NSG mice engrafted with human AML blasts, where they migrated to the bone marrow and lymphoid tissue and succeeded in eliminating the leukaemic burden after only one week. Therefore, AML-reactive CD4+ T cells expanded from the naive compartment by in vitro stimulation with primary leukaemia blasts appear to be a potent tool for DLI in HSCT patients and promise to mediate specific GvL effects without causing GvHD.

Role of outgrowth endothelial cells for applications in tissue engineering

Co-culture systems, consisting of outgrowth endothelial cells (OEC) and primary osteoblasts (pOB), represent a prom¬ising instrument to mimick the natural conditions in bone repair processes and provide a new concept to develop constructs for bone replacement. Furthermore, co-culture of OEC and pOB could provide new insights into the molecular and cellular mechanisms that control essential processes during bone repair. The present study described several advantages of the co-culture of pOB and OEC for bone tissue engineering applications, including beneficial effects on the angiogenic activation of OEC, as well as on the assembly of basement membrane matrix molecules and factors involved in vessel maturation and stabilization. The ongoing angiogenic process in the co-culture system proceeded during the course of co-cultivation and correlated with the upregulation of essential angiogenic factors, such as VEGF, angiopoietins, basement membrane molecules and mural cell-specific markers. Furthermore the co-culture system appeared to maintain osteogenic differentiation capacity.rnrnAdditional treatment of co-cultures with growth factors or morphogens might accelerate and improve bone formation and furthermore could be useful for potential clinical applications. In this context, the present study highlights the central role of the morphogen, sonic hedgehog, which has been shown to affect angiogenic activation as well as osteogenic differentiation in the co-culture model of OEC and pOB. Treatment of co-cultures with sonic hedgehog resulted in an increased formation of microvessel-like structures as early as after 24 hours. This proangiogenic effect was induced by the upregulation of the proangiogenic factors, VEGF, angiopoietin1 and angiopoietin 2. In contrast to treatment with a commonly used proangiogenic agent, VEGF, Shh stimulation induced an increased expression of factors associated with vessel maturation and stabilization, mediated through the upregulation of growth factors that are strongly involved in pericyte differentiation and recruitment, including PDGF-BB and TGFbeta. In addition, Shh treatment of co-cultures also resulted in an upregulation of osteogenic differentiation markers like alkaline phosphatase, osteocalcin, osteonectin and osteopontin, as well as an increased matrix calcification. This was a result of upregulation of the osteogenic differentiation regulating factors, BMP2 and RUNX2 which could be assessed in response to Shh treatment. rn

Lentivirus-mediated knockdown of Galectin-10 and Foxp3 in human immune cells

Die Suppression von autoreaktiven T-Zellen ist eine Funktion von CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen (CD4+CD25+ Tregs). CD4+CD25+ Tregs unterdrücken autoaggressive Immunantworten. Galectin-10 und Foxp3 sind wichtige Proteine, die an dem supprimierenden Mechanismus der Tregs beteiligt sind. Galectin-10 ist eines der ältesten bekannten humanen Proteine, die nicht in anderen Spezies gefunden worden sind. Foxp3 ist ein Transkriptionsfaktor, der in menschlichen CD4+CD25+ Tregs und in CD4+CD25- T-Effektor-Zellen nach Aktivierung exprimiert wird. Ein siRNA-vermittelter Knockdown dieses intrazellulären löslichen Proteins hebt die supprimierende Funktion der humanen CD4+CD25+ Tregs auf.rnDiese Arbeit beinhaltet in vitro durchgeführte Untersuchungen zur Ermöglichung eines Knockdown von Galectin-10 und/oder Foxp3 in humanisierten Mäusen. Es war möglich, ein Verfahren für die Produktion von lentiviralen Partikeln zu etablierten, die sich als effizientes Vehikel für den Gentransfer in humane Stammzellen und verschiedene Tumor- und Immunzellen erwiesen. Nach der Transduktion von AML14.3D10 Tumorzellen mit GFP-codierenden lentiviralen Partikeln konnte eine langfristige Expression von GFP erreicht werden. Außerdem war es möglich lentivirale Partikel zu erzeugen, die mit shRNA gegen Galectin-10 codiert waren. Die erzeugten Partikel erwiesen sich als funktionell, indem sie eine deutliche Herunterregulation von Galectin-10 in konstitutiv Galectin-10 exprimierenden AML14.3D10 Tumorzellen bewirkten. Unsere Studie präsentierte außerdem eine erstmalige Untersuchung zum Nachweis von Galectin-10-Protein in Eosinophilen aus humanen CD34+ hämatopoetischen Stammzellen (HSC). Diese stabile in vitro Galectin-10-Expression bietet ein alternatives Untersuchungsmodell zu CD4+CD25+ Tregs, die nicht aus CD34+ HSC differenziert werden können. Der zusätzliche Einbau des GFP-Gens in die mit shRNA gegen Galectin-10 codierende lentivirale Partikel war ein wichtiger Schritt zur Markierung von Zellen, die einen Galectin-10-Knockdown aufwiesen. Die neuen bicistronischen lentiviralen Partikel erwiesen sich sowohl in aus CD34+ HSC differenzierten Eosinophilen als auch in AML14.3D10 Zellen, die einen eosinophilen Phänotyp aufweisen, als funktionell. Schließlich konnte mit den bicistronischen lentiviralen Partikeln, die mit GFP und shRNA gegen Foxp3 codiert waren, eine Herunterregulation von Foxp3 in CD4+CD25- T-Effektor-Zellen erreicht werden, was erneut die erfolgreiche Herstellung von funktionellen lentiviralen Partikeln bewies.rn

Tissue engineering strategies for biomaterial-based anticancer drug delivery and enhancement of angiogenesis in tumor-resected bone

Patienten, die an Osteosarkom leiden werden derzeit mit intravenös applizierten krebstherapeutischen Mitteln nach Tumorresektion behandelt, was oftmals mit schweren Nebenwirkungen und einem verzögerten Knochenheilungsprozess einhergeht. Darüber hinaus treten vermehrt Rezidive aufgrund von verbleibenden neoplastischen Zellen an der Tumorresektionsstelle auf. Erfolgreiche Knochenregeneration und die Kontrolle von den im Gewebe verbleibenden Krebszellen stellt eine Herausforderung für das Tissue Engineering nach Knochenverlust durch Tumorentfernung dar. In dieser Hinsicht scheint der Einsatz von Hydroxyapatit als Knochenersatzmaterial in Kombination mit Cyclodextrin als Medikamententräger, vielversprechend. Chemotherapeutika können an Biomaterial gebunden und direkt am Tumorbett über einen längeren Zeitraum freigesetzt werden, um verbliebene neoplastische Zellen zu eliminieren. Lokal applizierte Chemotherapie hat diverse Vorteile, einschließlich der direkten zytotoxischen Auswirkung auf lokale Zellen, sowie die Reduzierung schwerer Nebenwirkungen. Diese Studie wurde durchgeführt, um die Funktionsfähigkeit eines solchen Arzneimittelabgabesystems zu bewerten und um Strategien im Bereich des Tissue Engineerings zu entwickeln, die den Knochenheilungsprozess und im speziellen die Vaskularisierung fördern sollen. Die Ergebnisse zeigen, dass nicht nur Krebszellen von der chemotherapeutischen Behandlung betroffen sind. Primäre Endothelzellen wie zum Beispiel HUVEC zeigten eine hohe Sensibilität Cisplatin und Doxorubicin gegenüber. Beide Medikamente lösten in HUVEC ein tumor-unterdrückendes Signal durch die Hochregulation von p53 und p21 aus. Zudem scheint Hypoxie einen krebstherapeutischen Einfluss zu haben, da die Behandlung sensitiver HUVEC mit Hypoxie die Zellen vor Zytotoxizität schützte. Der chemo-protektive Effekt schien deutlich weniger auf Krebszelllinien zu wirken. Diese Resultate könnten eine mögliche chemotherapeutische Strategie darstellen, um den Effekt eines zielgerichteten Medikamenteneinsatzes auf Krebszellen zu verbessern unter gleichzeitiger Schonung gesunder Zellen. Eine erfolgreiche Integration eines Systems, das Arzneimittel abgibt, kombiniert mit einem Biomaterial zur Stabilisierung und Regeneration, könnte gesunden Endothelzellen die Möglichkeit bieten zu proliferieren und Blutgefäße zu bilden, während verbleibende Krebszellen eliminiert werden. Da der Prozess der Knochengeweberemodellierung mit einer starken Beeinträchtigung der Lebensqualität des Patienten einhergeht, ist die Beschleunigung des postoperativen Heilungsprozesses eines der Ziele des Tissue Engineerings. Die Bildung von Blutgefäßen ist unabdingbar für eine erfolgreiche Integration eines Knochentransplantats in das Gewebe. Daher ist ein umfangreich ausgebildetes Blutgefäßsystem für einen verbesserten Heilungsprozess während der klinischen Anwendung wünschenswert. Frühere Experimente zeigen, dass sich die Anwendung von Ko-Kulturen aus humanen primären Osteoblasten (pOB) und humanen outgrowth endothelial cells (OEC) im Hinblick auf die Bildung stabiler gefäßähnlicher Strukturen in vitro, die auch effizient in das mikrovaskuläre System in vivo integriert werden konnten, als erfolgreich erweisen. Dieser Ansatz könnte genutzt werden, um prä-vaskularisierte Konstrukte herzustellen, die den Knochenheilungsprozess nach der Implantation fördern. Zusätzlich repräsentiert das Ko-Kultursystem ein exzellentes in vitro Model, um Faktoren, welche stark in den Prozess der Knochenheilung und Angiogenese eingebunden sind, zu identifizieren und zu analysieren. Es ist bekannt, dass Makrophagen eine maßgebliche Rolle in der inflammatorisch-induzierten Angiogenese spielen. In diesem Zusammenhang hebt diese Studie den positiven Einfluss THP-1 abgeleiteter Makrophagen in Ko-Kultur mit pOB und OEC hervor. Die Ergebnisse zeigten, dass die Anwendung von Makrophagen als inflammatorischer Stimulus im bereits etablierten Ko-Kultursystem zu einer pro-angiogenen Aktivierung der OEC führte, was in einer signifikant erhöhten Bildung blutgefäßähnlicher Strukturen in vitro resultierte. Außerdem zeigte die Analyse von Faktoren, die in der durch Entzündung hervorgerufenen Angiogenese eine wichtige Rolle spielen, eine deutliche Hochregulation von VEGF, inflammatorischer Zytokine und Adhäsionsmoleküle, die letztlich zu einer verstärkten Vaskularisierung beitragen. Diese Resultate werden dem Einfluss von Makrophagen zugeschrieben und könnten zukünftig im Tissue Engineering eingesetzt werden, um den Heilungsprozess zu beschleunigen und damit die klinische Situation von Patienten zu verbessern. Darüber hinaus könnte die Kombination der auf Ko-Kulturen basierenden Ansätze für das Knochen Tissue Engineering mit einem biomaterial-basierenden Arzneimittelabgabesystem zum klinischen Einsatz kommen, der die Eliminierung verbliebener Krebszellen mit der Förderung der Knochenregeneration verbindet.